Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ ЗАБОЛЕВАНИЯ У ДЕТЕЙ С ДЕТСКИМ ЦЕРЕБРАЛЬНЫМ ПАРАЛИЧОМ

Изобретение относится к медицине, а именно к детской неврологии.

Проблема изучения перинатальной патологии нервной системы у детей раннего возраста обусловлена прогрессирующим ростом частоты церебральных нарушений у новорожденных. В последнее десятилетие в нашей стране наблюдается стремительное внедрение новых медицинских технологий, которые позволили выхаживать маловесных новорожденных. Однако современная технология одновременно способствует спасению и инвалидизации этих детей.

Наиболее тяжелой и частой формой поражения головного мозга, нередко приводящей к инвалидизации у недоношенных детей, является перивентрикулярная лейкомаляция (ПВЛ), развитие которой реализуется через три основных механизма: гипоксически-ишемический, глутаматный за счет нарушения миелинизации предшественников олигодендроцитов и цитокиновый [Ониангет Е.П. Перивентрикулярная лейкомаляция: факторы риска возникновения, выживаемость и мониторинг развития детей автореф. дис… канд. мед. Наук. / Е.П. Ониангет - 2009. - 23 с.]. Детский церебральный паралич (ДЦП) у детей, перенесших ПВЛ, формируется в 89% случаев [Семенова К.А. Восстановительное лечение детей с перинатальным поражением нервной системы и детским церебральным параличом - М.: Закон и порядок, серия «Великая Россия. Наследие». - 2007. - 616 с.]. В связи с этим изучение факторов риска возникновения ПВЛ, а также факторов, влияющих на исход и дальнейшее развитие детей, является весьма актуальным.

Актуальность изучаемой проблемы обусловлена тем, что все дети, перенесшие ПВЛ, в том числе имеющие высокий риск развития ДЦП, лечатся не дифференцированно, получают одинаковую стимулирующую терапию, что в ряде случаев может приводить к ухудшению прогноза психического и двигательного развития ребенка. До настоящего времени не определены критерии тяжести неврологических последствий ПВЛ и клинических признаков ДЦП в исходе ПВЛ.

Известен способ определения нестабильности генома у детей, больных детским церебральным параличом (ДЦП), с перивентрикулярной лейкомаляцией (ПВЛ), включающий выявление клинических признаков заболевания, определение в периферической крови ребенка уровня эритроцитов с микроядрами (ЭМ), исследование крови на содержание продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида - и на определение активности супероксиддисмутазы и при значении эритроцитов с микроядрами более 0,22%, повышении уровня малонового диальдегида более 0,7 мкМ/л и супероксиддисмутазы более 0,6 усл.ед. устанавливают нестабильность генома у ребенка, больного ДЦП с перивентрикулярно лейкомаляцией (пат. RU №2413226, МПК G01N 33/48, опубл. 27.02.2011 г.).

Недостаток этого способа - сложность, длительность и недоступность использования в широком круге лечебных учреждений.

Известен способ определения нестабильности генома у детей с ДЦП, включающий выявление клинических признаков заболевания, определение в периферической крови ребенка уровня эритроцитов с микроядрами и уровня перестроек хромосом в лимфоцитах, и при значении сумм эритроцитов с микроядрами более 0,14% и лимфоцитов с абберациями хромосом более 3,33% у девочек и 3,38% у мальчиков устанавливают нестабильность генома у ребенка (пат. RU №2295130, МПК G01N 33/48, опубл. 10.03.07 г.).

В этом способе, наиболее близком к предлагаемому, определяется только уровень эритроцитов с микроядрами и уровень перестроек хромосом в лимфоцитах периферической крови без учета факторов, приводящих к мутагенезу и процессов поддерживающих его.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в создании простого, быстрого и доступного в использовании способа определения степени тяжести ДЦП с учетом факторов, определяющих симптоматику заболевания.

Для достижения этого технического результата в способе определения степени тяжести ДЦП у детей раннего возраста, включающим выявление клинических признаков, которое проводят по шкале моторики Ривермид, определение в периферической крови ребенка уровня эритроцитов с микроядрами, а затем с помощью иммуноферментного анализа определяют количественное содержание фактора некроза опухоли (TNF-α) в слюнной жидкости у детей, больных ДЦП, сопоставляют с клиническими признаками и при значении эритроцитов с микроядрами 0,55±0,14% и повышении уровня TNF-α слюны до 13,23±5,2 пг/мл устанавливают среднюю степень тяжести заболевания, а при значениях эритроцитов с микроядрами 1,27±0,87% и выше, и уровне TNF-α слюны 25,41±5,42 пг/мл и выше - тяжелую степень заболевания.

Признаки, отличающие предложенный способ определения степени тяжести ДЦП у детей раннего возраста от наиболее близкого к нему известного по патенту РФ №2295130 (прототип), характеризуют проведение клинических признаков заболевания по шкале моторики Ривермид, определение с помощью иммуноферментного анализа количественного содержания фактора некроза опухоли (TNF-α) в слюнной жидкости, сопоставление их с клиническими признаками и установление средней степени тяжести ДЦП при значении эритроцитов с микроядрами 0,55±0,14% и повышении уровня TNF-α слюны до 13,23±5,2 пг/мл, а тяжелой степени заболевания - при значениях эритроцитов с микроядрами 1,27±0,87% и выше, и уровня TNF-α слюнной жидкости 25,41±5,42 пг/мл и выше, что позволяет получить простой, доступный в использовании экспресс-способ определения степени тяжести заболевания и возможность незамедлительного лечения заболевания, не травмируя ребенка.

Способ иллюстрируется чертежами.

На фигуре 1 представлены уровни TNF-α слюнной жидкости у обследованных детей в зависимости от наличия патологии перивентрикулярной области.

На фигуре 2 изображено распределение детей со спастической диплегией в зависимости от степени тяжести клинической картины, оцененной шкалой Ривермид.

На фигуре 3 показано распределение детей с гемипаретической формой ДЦП в зависимости от степени тяжести заболевания, оцененной шкалой Ривермид.

На фигуре 4 - кривая зависимости уровня TNF-a слюнной жидкости в зависимости от степени тяжести по шкале Ривермид.

На фигуре 5 - кривая зависимости уровня эритроцитов с микроядрами и уровня TNF-α слюнной жидкости в группах детей с ДЦП.

Способ осуществляли следующим образом.

Пример 1

Больной В. Возраст 3 года 10 месяцев. Диагноз: Детский церебральный паралич, спастическая диплегия, средней степени тяжести. Родился от II беременности, протекавшей на фоне явлений раннего токсикоза, угрозы прерывания на ранних сроках. Роды II на сроке 35-36 недель. Оценка по шкале Апгар - 4/6 баллов. Вес при рождении 2300 г, длина тела 48 см. Психомоторное развитие: голову держит с 4-х мес., сидит самостоятельно с 8-ми мес., ходит - с 1 г. 7 мес. Особенности неврологического статуса на момент осмотра: глазодвижения в полном объеме, лицо симметричное, мышечный тонус повышен в аддукторах бедер с двух сторон, сухожильные рефлексы спастичные, грубее слева, сила мышц снижена до 4,0 баллов, походка - спастикопаретическая.

Оценка двигательного дефицита по шкалам:

- Модифицированная шкала спастичности Ashworth - 2 балла

- Оценка Клуба Моторики - 16 баллов

- Оценка моторики Ривермид - 14 баллов.

Степень неврологического дефицита, оцененная по шкалам, соответствует средней тяжести.

Заключение магнитно-резонансной томографии - перивентрикулярно определяются небольшие зоны повышения гидрофильности вещества головного мозга.

Аналогично изучались показатели 65 детей в возрасте от 1 года до 4-х лет: 25 детей со спастической диплегией, сформировавшейся в исходе ПВЛ, 20 детей с гемипарезом, сформировавшимся в исходе неонатального инсульта, а также данные 20 здоровых детей группы контроля аналогичного возраста - таблица 1 и 2.

Обязательным условием включения ребенка в исследование являлось получение письменного информированного согласия родителей пациентов. В исследовании участвовали дети, у которых отсутствовали клинические и лабораторные признаки внутриутробного инфицирования в неонатальном периоде и инфекционного процесса за 30 дней до и на момент обследования. Диагноз устанавливался на основании изучения клинической картины заболевания, данных анамнеза, сведений из медицинской документации (история развития ребенка (форма №112/у) и медицинской карты амбулаторного больного (форма №025/у)).

Для оценки психоневрологического статуса больных ДЦП использованы специальные балльные шкалы оценки тяжести неврологического дефицита:

модифицированная шкала спастичности Ashworth (Ashworth, 1964); Оценка Клуба Моторики (по A. Ashbum, 1982; D. Wade, 2000); Оценка моторики Ривермид (по F. Collen и соавт., 1990; D. Wade, 2000), адаптированные к детскому возрасту. Модифицированная шкала спастичности Ashworth оценивает степень повышения мышечного тонуса и возможность выполнения пассивных движений по 5 степеням: нулевая степень - нет повышения тонуса (тонус не изменен), 4 степень - ригидное положение конечности (таблица 3).

Оценка Клуба Моторики предусматривает подсчет баллов при выполнении заданных движений верхней и нижней конечностью из различных исходных положений. Каждый показатель оценивается от 0 до 2 баллов (0 - нет движений, 1 - ограниченная амплитуда движений, 2 - полная амплитуда движений (в сравнении с противоположной стороной), координация может быть нарушена). По сумме баллов устанавливается выраженность клинических проявлений заболевания: чем меньше число баллов, тем тяжелее клиническая картина (таблица 4).

Шкала моторики Ривермид, адаптированная для детского возраста, содержит разделы «общие функции» (13 заданий), «нога и туловище» (10 заданий), «рука» (15 заданий). В каждом разделе задания расположены в порядке возрастания сложности их выполнения. Балл «1» присваивается за каждое задание, если больной выполнил его, балл «0» - если не смог выполнить. По сумме баллов оценивается выраженность клинических проявлений заболевания: чем меньше число баллов, тем более тяжелее клиническая картина (таблица 5).

Таблица 5

Определение клинических признаков по шкале моторики Ривермид - Rivermead Motor Assessment (по N.Lincoln, D.Leadbitter. 1979; F.Collen и соарт., 1990; D.Wade. 2000)

На таблице 6 представлено распределение степеней тяжести неврологического дефицита в зависимости от суммы баллов каждой шкалы.

Патология перивентрикулярной области устанавливалась на основании НСГ - исследования в возрасте до одного года (по имеющимся протоколам в амбулаторной карте) и после установления диагноза ДЦП (в возрасте старше 1 года) по результатам КТ или МРТ исследований. Магнитно-резонансная томография (МРТ) выполнялась на томографе MRI 50A фирмы «Toshiba» с напряженностью магнитного поля 0,5 Тл. Применялись импульсные последовательности SE, IR и VE для получения Т1- и Т2-взвешенных изображений. Применялись сагиттальный, аксиальный и коронарный срезы с толщиной выделяемого слоя 6 мм. Рентгеновская компьютерная томография (РКТ) выполнялась на аппарате Xpeed фирмы «Toshiba» с применением аксиальных срезов толщиной для детей 1-2 лет на базальных уровнях, 2 мм, срезы средних и верхних отделов - 5 мм; для детей старше 2 лет - срезы базального и среднего уровней толщиной 5 мм, верхних отделов - 10 мм. Нейросонография (НСГ) выполнялась на аппарате фирмы «Toshiba» (Xario). Сканирование осуществляли в стандартных плоскостях: коронарной, сагиттальной, парасаггитальной и аксиальной. Анализ эхограммы включал в себя оценку состояния паренхимы головного мозга, желудочковой системы, цистерн и субарахноидалыюго пространства, рисунка извилин и борозд, пульсации мозговых сосудов и наличие очаговых патологических образований (ПВЛ на разных стадиях развития, кровоизлияния в желудочки или паренхиму мозга, кисты различной локализации). Перивентрикулярная лейкомаляция, обнаруженная у обследованных нами детей, сопровождалась зоной повышенной эхогенности, окружающей оба желудочка вокруг тел и затылочных рогов, а также кистозной дегенерацией мозга в области повышенной эхогенности с образованием множественных перивентрикулярных псевдокист размерами от 2 до 5 мм в диаметре. У всех детей с перивентрикулярной лейкомаляцией в дальнейшем формировалась умеренная симметричная вентрикуломегалия и расширение субарахноидального пространства.

Для выявления цитогенетических аномалий в соматических клетках применялся микроядерный тест (учет эритроцитов с микроядрами) (Schmid W., 1975). В этих целях использовались мазки периферической крови для стандартного общего анализа крови, взятые у больных при поступлении в стационар (т.е. до лечения), а у здоровых лиц - во время диспансерного обследования в детской поликлинике. Таким образом, подготовка препаратов для исследования микроядер эритроцитов всегда совмещалась с плановыми лабораторными анализами, и дети не подвергались дополнительным исследовательским манипуляциям. Капля крови наносилась на чистое сухое предметное стекло, покровным стеклом готовили мазок, затем препараты высушивались на воздухе в течение нескольких часов. Свежие высушенные мазки фиксировались 90- 70% этиловым спиртом 3 мин. Сухие препараты окрашивались в растворе азур-эозинового красителя Романовского - Гимза 1:5 на дистилированной воде рH 6,8 20 минут и хорошо промывались. Для исследования на микроядерный тест были просмотрены по 1-2 препарата каждого больного. Поскольку частота встречаемости в периферической крови эритроцитов крови с микроядрами у человека низка, то в каждом случае анализировали 20000 клеток. Число эритроцитов с микроядрами пересчитывали в процентах. Для отличия микроядер от частиц краски обязательно оценивалось отсутствие преломления света. Образцы крови у больных и в контрольной группе забирались в один и тот же период времени. Каких-либо факторов, способных индуцировать цитогенетические нарушения у лиц контрольной группы (иммунные, нейроэндокринные конфликты в организме, а также последствия воздействия на организм факторов инфекционной природы) на момент и в течение месяца до забора крови не выявлено. Всего проведен подсчет эритроцитов с микроядрами у 65 детей (45 в основной, 20 в контрольной группе).

Для определения TNF-α использована слюнная жидкость, сбор которой производился в индивидуальные стерильные контейнеры при помощи электроотсоса. Полученная слюнная жидкость центрифугировалась при 5000 об/мин в течение 10 минут. В исследуемой жидкости количественное определение TNF-α осуществляли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора реактивов «α-ФНО-ИФА-Бест» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) согласно прилагаемой инструкции. В использованном нами наборе реактивов основным агентом являются моноклональные антитела к TNF-α, иммобилизированные на поверхности лунок планшета и взаимодействующие с TNF-α исследуемой биологической жидкостью (сыворотка крови, слюна). Результаты анализа регистрируют с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность в двухволновом режиме: основной фильтр - 450 нм, референс-фильтр - в диапазоне 620-650 нм. Допустима регистрация результатов

только с фильтром 450 нм. Время между остановкой реакции и измерением оптической плотности не должно превышать 10 мин. После измерения оптической плотности строится калибровочный график, по которому рассчитывается концентрация TNF-α в пг/мл.

Полученные данные обработаны с использованием пакета программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc, США). Количественные признаки представлены в виде среднего арифметического значения±стандартное отклонение. Различия показателей между двумя независимыми выборками определяли с помощью соответствующего t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна-Уитни. Различия считались статистически значимыми при р<0,05. Связь количественных признаков оценивалась с помощью корреляционного анализа с расчетом коэффициента корреляции (R) по Пирсону.

По результатам исследования при нейровизуализации у 56% (14 чел.) детей со спастической диплегией обнаружены признаки перенесенной ПВЛ. У 60% (12 чел.) больных с гемипарезом контрлатерально определялись перивентрикулярно расположенные кисты различных размеров. У 44% обследованных со спастической диплегией (11 чел.) и у 30% детей с гемипарезом (6 чел.) нейровизуализация не выявила каких-либо находок в головном мозге, и в ПВО в том числе.

Проведен анализ уровня TNF-α слюнной жидкости, результаты которого сведены в таблицу 7.

Как видно из табл.7 у детей с ДЦП уровень TNF-α в слюне достоверно выше уровня исследуемого цитокина у здоровых детей.

Изучено содержание TNF-α слюнной жидкости в зависимости от форм ДЦП. Данные приведены в табл.8.

Из табл.8 видно - значения TNF-α слюнной жидкости у детей со спастической диплегией достоверно выше показателей детей с гемипаретической формой, а также детей контрольной группы (р≤0,01).

Анализ содержания TNF-α слюны у детей со спастической диплегией в зависимости от наличия перивентрикулярной лейкомаляции (ПВЛ) приведен на графике (фиг.1). Как видно из графика (фиг.1) уровень TNF-α слюнной жидкости у детей со спастической диплегией в исходе ПВЛ достоверно (p≤0,05) выше показателя детей без признаков ПВЛ.

Для оценки степени выраженности неврологического дефицита у всех детей основной группы изучена тяжесть двигательных нарушений по шкалам Ashworth, Клуба Моторики и Ривермид (фиг.2). При оценке всеми шкалами у преобладающего числа детей со спастической диплегией выявлена средняя степень тяжести двигательных нарушений. Тяжелая степень заболевания определена у 11% больных со спастической диплегией по шкале Ashworth, у 10% - по шкале Клуба Моторики и у 20% детей - по шкале Ривермид. Оказалось, что при использовании шкал балльной оценки степени тяжести неврологических нарушений наиболее достоверные результаты показала шкала моторики Ривермид (р≤0,001).

Показатели изучения двигательного дефицита при гемипаретической форме заболевания приведен на диаграмме (фиг.3). Из диаграммы следует, что гемипаретическая форма ДЦП в большинстве случаев представлена легкой и средней степенью тяжести заболевания.

Изучение содержания TNF-α слюнной жидкости в зависимости от степени тяжести ДЦП, оцененной по шкалам Ashworth, Клуба Моторики и Ривермид выявило достоверное превышение изучаемого цитокина у детей со средней и тяжелой степенью заболевания.

Проведено изучение корреляционной связи уровня TNF-α слюнной жидкости и выраженности клинических симптомов у детей с ДЦП. Данные приведены на кривой (фиг.4). На фиг.4 видно, что у детей с перенесенной ПВЛ выявлена сильная корреляционная зависимость степени тяжести ДЦП (по шкале Ривермид) от содержания TNF-α в слюне (R=- 0,89). Наряду с этим выявлена средняя положительная корреляция между содержанием TNF-a в слюнной жидкости и степенью тяжести ДЦП, оцененной по шкале Ashworth (R=0,418), и средняя отрицательная корреляция между аналогичными показателями при оценке шкалой Клуба Моторики (R=- 0,512).

Анализ корреляционной зависимости уровня нестабильности генома от содержания TNF-α в слюнной жидкости приведен на графике (фиг.5). Содержание TNF-α в слюне у детей с ДЦП, независимо от наличия изменений в ПВО, умеренно коррелировало с показателями цитогепетических нарушений в эритроцитах, а именно: сила корреляционной связи между TNF-α слюнной жидкости и ЭМ у детей с ДЦП в исходе ПВЛ составила - R=0,91, в то время как в контрольной группе выявлена сильная отрицательная корреляционная связь между этими показателями (R=-1,0).

Анализ результатов при изучении содержания TNF-α выявил наиболее высокое содержание изучаемого цитокина у детей со спастической диплегией. При изучении содержания TNF-α слюнной жидкости в зависимости от степени тяжести ДЦП, оцененной по шкале Ривермид, было выявлено достоверное превышение показателей у детей со средней и тяжелой степенью заболевания. Анализ содержания TNF-α в зависимости от наличия ПВЛ выявил достоверное (р<0,05) повышение уровня TNF-α слюны у детей с ПВЛ с исходом в ДЦП по сравнению с группой детей с ДЦП без признаков ПВЛ. Можно предположить, что деструктивные процессы в ПВО приводят к формированию неспецифического воспаления. Таким образом, можно полагать, что выработка TNF-α приводит к развитию самоподдерживающегося процесса, обусловливающего его хроническое течение, и, как следствие этого, запускаются иммунопатологические процессы, которые приводят к патологическим изменениям как в нервной (в перивентрикулярной области), так и в иммунокомпетентной системах в организме больных ДЦП.

Изучение корреляционной связи между содержанием TNF-α в слюнной жидкости и отдельными иммунологическими показателями, а также выраженностью клинических симптомов у детей с ДЦП обнаружило, прямую корреляционную зависимость степени тяжести ДЦП. Эти данные могут свидетельствовать о прямой взаимосвязи уровня иммунологических показателей и выработки TNF-α у детей с патологией ПВО: возможно, процессы при ПВЛ стимулируют синтез TNF-α.

Таким образом, у детей с ДЦП в исходе ПВЛ выявлены два значимых звена патогенеза: с одной стороны нестабильность клеточного генома, выражающаяся в увеличении числа клеток с цитогенетическими нарушениями, с другой стороны -иммунные нарушения, характеризующиеся увеличением содержания цитокина TNF-α в слюнной жидкости. Выявленная сильная корреляционная зависимость между показателями анеугенеза и содержанием провоспалительного цитокина у детей с патологией ПВО свидетельствуют об активных процессах эндомутагенеза у этих больных. Не исключено, что эти звенья взаимосвязаны и свидетельствуют об активных биохимических процессах, текущих в организме детей с ДЦП. Достоверное преобладание этих показателей у больных ДЦП с ПВЛ по сравнению с больными без ПВЛ наводит на мысль о существовании пока неизвестных патологических процессов в ПВО, в которой может индуцироваться эндомутагенез. С этих позиций патология в ПВО может рассматриваться как текущий, возможно, иммунопатологический процесс, инициированный внутриутробной гипоксией и продолжающейся в начальной резидуальной стадии

ДЦП.

Предлагаемый способ диагностики прост, неинвазивен, не требует специальной подготовки невролога, обеспечивает безопасность диагностики и не имеет побочных эффектов. Он позволяет объективизировать степень тяжести неврологических нарушений у детей, страдающих ДЦП; назначать адекватную в зависимости от тяжести, своевременную патогенетическую терапию;

осуществлять объективный контроль течения заболевания и эффективности проводимых терапевтических мероприятий.

Полученные результаты и способ определения тяжести неврологического дефицита при ДЦП намечено внедрить в работу неврологического отделения Детской республиканской клинической больницы г.Казани во II квартале 2013 года.