Результат интеллектуальной деятельности: ПИТАТЕЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЯБЛОЧНЫЙ ЭКСТРАКТ И СНИЖАЮЩАЯ СИМПТОМЫ ПИЩЕВОЙ АЛЛЕРГИИ, ОСОБЕННО У ДЕТЕЙ

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к применению натурального экстракта, содержащего полифенолы, при производстве питательной композиции для уменьшения аллергических симптомов у аллергических больных при воздействии аллергенов.

Уровень техники

Аллергии входят в число наиболее распространенных проблем со здоровьем, влияющих на жизнь пациентов всех возрастов. Аллергические заболевания в наши дни рассматриваются ВОЗ как эпидемические. Показано, что распространенность аллергий увеличилась за последние десятилетия. Современный образ жизни, особенно городской, связан с широким распространением и возрастанием тяжести аллергических проявлений.

Аллергическая сенсибилизация в детстве, особенно в раннем возрасте и особенно к пищевым аллергенам, имеет решающее значение и представляет наибольший интерес, так как показано, что возникновение "аллергического фенотипа" или "атопии" способствует последующей сенсибилизации к другим аллергенам. Поэтому аллергии в детстве могут быть первым шагом аллергического каскада, ведущего к множественным аллергиям в последующей жизни - процесса, который обычно называют "атопическим маршем". Например, при когортном анализе оказалось, что у детей с постоянной пищевой гиперчувствительностью в раннем возрасте резко повышается риск возникновения аллергического ринита (сенной лихорадки) или астмы в более позднем возрасте (Ostblom et al., 2008). У детей с более мягкой формой пищевой гиперчувствительности также возрастает риск возникновения дыхательных аллергий, но в меньшей степени, чем у детей с постоянной пищевой гиперчувствительностью. Следовательно, уменьшение тяжести пищевой гиперчувствительности может быть решающим для замедления "атопического марша".

В этом контексте наибольшее значение имеет лечение аллергических эпизодов и профилактика аллергий в детстве и младенчестве.

Иммунная система у детей раннего возраста активно развивается в течение всех первых лет жизни. Воздействие на аллергические реакции, их предупреждение, избегание, контролирование, снижение или модулирование у таких юных пациентов может повлиять на их аллергический профиль не только в краткосрочном плане, но также и на более длительное время в дальнейшей жизни.

Предупреждение аллергии может осуществляться на различных уровнях.

"Первичная профилактика" представляет собой эффект предотвращения или снижения риска сенсибилизации больных к аллергенам, который характеризуется отсутствием или снижением уровня аллергенспецифичных антител типа IgE. Предотвращение или снижение сенсибилизации приводит к отсутствию или уменьшению аллергических симптомов при воздействии того же самого аллергена. Модулируя то, каким образом пациент подвергается сенсибилизации по отношению к одному аллергену или целой группе аллергенов (первичная профилактика), можно модулировать и последующий аллергический ответ.

"Вторичная профилактика" представляет собой эффект модулирования симптомов аллергии, а именно возникновения или интенсивности аллергической реакции у больных, уже сенсибилизированных к одному или нескольким аллергенам, когда больной подвергается повторному воздействию данного аллергена (аллергенов). Модулируя появление или интенсивность аллергических симптомов (вторичная профилактика), можно минимизировать неудобства, связанные с аллергиями.

Учитывая эти разные концепции предупреждения аллергии, можно высказать предположение, что вследствие присущих им механизмов действия некоторые соединения могут действовать исключительно на одном из этих или на обоих специфических уровнях профилактики. Некоторые могут, к примеру, только уменьшать сенсибилизацию к определенному аллергену (первичная профилактика), тогда как другие соединения могут только лишь оказывать воздействие на вторичную профилактику и уменьшать тяжесть аллергических реакций. Другие соединения могут воздействовать как на сенсибилизацию, так и на симптомы, поэтому они эффективно способствуют и первичной и вторичной профилактике.

Пищевые аллергены входят в число самых первых аллергенов, с которыми дети сталкиваются в раннем возрасте: как правило, с белками коровьего молока могут сталкиваться дети, не получающие исключительно грудное вскармливание. Так, молочные белки находятся среди наиболее часто наблюдаемых причин пищевой аллергии в раннем возрасте, за которыми следуют яичные и белки пшеницы. В общем, пищевые аллергии могут проявляться кожными (сыпь, экзема и др.) и желудочно-кишечными симптомами (спазмы в животе, боли, особенно в животе, рвота) у младенцев и маленьких детей. Дальнейшая сенсибилизация и случаи аллергии могут появиться уже тогда, когда малыши сталкиваются с новым видом пищи, как то: злаками, овощами или фруктами.

Полифенолы представляют собой большую группу небольших соединений с антиоксидантной активностью, которые обычно встречаются в растениях и фруктах. Флавоноиды представляют собой подгруппу полифенолов с общими структурными характеристиками, которых тоже можно разбить на дальнейшие подгруппы (опять же на основании общих характеристик), к примеру, на флавонолы, флаванолы, флавоны, флаваноны и другие. Использовались соединения, содержащиеся в яблоках, и было показано, что они обладают общим действием на аллергии: как и предполагалось, такие флавоноиды, как кверцетин, а также другие полифенолы оказывают положительный эффект на аллергии вообще. Яблоки богаты различными полифенолами, включая кверцетин и флоризидин. Опыты in vitro и in vivo на лабораторных животных привели к предположению, что некоторые полифенолы могут уменьшать аллергические реакции через механизм, аналогичный распространенным антигистаминовым препаратам (то есть ингибирование дегрануляции тучных клеток). Это было описано, в частности, в М.Kimata et al., Clin. Exp. Allergy 2000, 30:501-508; M.P.Nair et al., Biochim. Biophys. Acta 2002, 1593:29-36; и W. Dorsch et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 1992, 97:1-7. Более того, Kojima et al. описали в Allergology International (2000) 49:69-73, что яблочные полифенолы могут оказывать благоприятное действие на атопический дерматит.Kishi et al. в Biosci. Biotechnol. Biochem. 2005, 69(4), 829-832, описали эффективность яблочных полифенолов при лечении аллергии на пыльцу кедра.

Тем не менее, остается потребность в специфическом снижении аллергических реакций и симптомов, особенно у маленьких детей.

Проблема пищевых аллергических реакций в детском возрасте еще больше осложняется специфическими пищевыми потребностями младенцев и маленьких детей. Калорийность, энергетическая плотность, разнообразие питательных веществ, содержание белка и качество белка входят в число факторов, важных для получения наиболее подходящего питания для младенцев и маленьких детей. Также важно присутствие микронутриентов, таких как витамины и минералы, особенно тогда, когда их наличие ограничивается конкретными рамками, соответствующими возрасту данных пациентов. По существу, маленьким детям и младенцам присущ сложный матрикс для введения пищи, но он и не требует разнообразия: к примеру, младенцам, несмотря на то, что они потенциально аллергичны, требуется специальный баланс белка в матриксе из молочных белков. Присутствие таких множественных нутриентов может усиливать действие пищевых аллергенов. В таких сложных матриксах малое количество ключевых аллергенов не способно само по себе вызывать аллергические проявления, но затем оно может усиливать запуск аллергической реакции. Равным образом в таких сложных пищевых матриксах может уменьшиться или исчезнуть эффект у соединений, которые могут нейтрализовать аллергены или воздействовать на предупреждение аллергии. В частности, невозможно предсказать, будет ли соединение, обычно известное как предупреждающее аллергию, все еще активно и в какой степени в таком сложном матриксе, как пищевая композиция для младенцев или маленьких детей.

Существует потребность в ослаблении симптомов пищевой аллергии у младенцев и маленьких детей, имевших случаи аллергии в прошлом и/или страдающих аллергией.

Существует потребность в обеспечении полноценной пищевой композиции, не только обеспечивающей разнообразие нутриентов, но и снижающей тяжесть аллергических реакций.

Существует потребность в обеспечении пищевой композиции, модулирующей аллергические реакции у юных пациентов, страдающих легкими и средними формами аллергии, так как они имеют особые потребности, которые диктуются незрелостью их пищеварительной и иммунной системы.

Также существует потребность в модулировании аллергических реакций у маленьких детей, не переносящих строго направленные фармацевтические молекулы, к примеру, при таких диетологических вмешательствах, как включение модуляторов иммунной системы в обычный пищевой рацион.

Существует потребность в обеспечении пищевой композиции, модулирующей аллергические реакции у юных пациентов во время или близко от времени отнятия ребенка от груди, когда кишечный тракт подвергается серьезным изменениям и когда вводится новая потенциально аллергичная твердая пища и поэтому пациенты особенно подвержены сенсибилизации пищевыми аллергенами.

Существует потребность в ослаблении симптомов аллергии путем обеспечения эффективной композиции, потенциально уменьшающей воздействие аллергенов, даже если композиция не может прямо уменьшить сенсибилизацию аллергенами.

Существует потребность в композиции, обладающей положительным эффектом на вторичную профилактику аллергии, которая не обязательно действует на первичную профилактику той же самой аллергии.

Наконец, существует потребность в композиции, наиболее подходящей для юных пациентов, которая путем ослабления симптомов может способствовать ослаблению "аллергического фенотипа" и тем самым понизить чувствительность к новым аллергенам в дальнейшей жизни. Существует потребность в ослаблении атонического марша.

Сущность изобретения

В первом аспекте настоящим изобретением предусмотрена полноценно питательная композиция для ослабления симптомов аллергии, возникающих от пищи у пациентов, у которых аллергию вызывают пищевые аллергены, особенно у младенцев и/или маленьких детей.

Во втором аспекте настоящим изобретением предусмотрена композиция, которая существенно способствует вторичной профилактике аллергических реакций, вызванных пищевыми аллергенами, но не обязательно влияет на первичную профилактику против тех же аллергенов.

В третьем аспекте настоящим изобретением предусмотрена композиция, обогащенная полифенолами, в особенности кверцетином.

В следующем аспекте изобретения композиция по изобретению особенно эффективна для младенцев и/или маленьких детей во время отнятия от груди.

Изобретение также распространяется на снижение сенсибилизации к другим аллергенам в дальнейшей жизни.

Краткое описание фигур

Фиг.1. Схематическое описание модели пищевой аллергии на OVA у мышей.

Фиг.2. Ослабление симптомов пищевой аллергии у мышей, получавших 1% яблочного экстракта в течение последней недели перед введением аллергена. Результаты двух независимых экспериментов.

Фиг.3. Ослабление симптомов пищевой аллергии у мышей, получавших 1% яблочного экстракта (Pomactiv HFV или Diana Naturals AFPOMM9080) либо в период сенсибилизации (первичная), либо в последнюю неделю перед введением аллергена (вторичная).

Фиг.4. Средний уровень протеазы-1 тучных клеток мыши (ММСР-1) в сыворотке через 4 часа после введения аллергена.

Фиг.5 - Табл. 1. Уровень экспрессии генов в пейеровых бляшках подвздошной кишки.

Фиг.6 - Табл. 2. Уровень экспрессии генов в подвздошной кишке.

Раскрытие изобретения

Определения. В данном описании следующие термины имеют следующие значения:

"Полноценная питательная композиция". В целях данного документа полноценная питательная композиция - это композиция, которая содержит значительное количество, обычно 50% или больше основных пищевых нутриентов, рекомендованных для данного возраста. Такие основные нутриенты обычно обеспечиваются в таком количестве и пропорции, чтобы удовлетворить 50% или больше конкретных рекомендованных доз нутриентов для данного возраста и в достаточном количестве для обеспечения рекомендованной калорийности для данного возраста. Полноценная питательная композиция обычно включает источник белка, источник липидов, источник углеводов в сбалансированной пропорции, отвечающей общим рекомендациям для данного возраста. Обычно она включает и такие микронутриенты, как витамины и минералы, а также источник незаменимых аминокислот и источник незаменимых жирных кислот. Однако следует иметь в виду, что полноценная питательная композиция может включать не все определенные нутриенты и не все рекомендованные количества для удовлетворения всех пищевых потребностей младенцев или маленьких детей. Полноценная питательная композиция исключает композиции, содержащие только яблочные экстракты или яблочные экстракты в преобладающей пропорции.

"Симптомы аллергии" обычно включают симптомы, запускаемые аллергенами. Такие симптомы включают кожные (покраснение кожи, сыпь, зуд, дерматит, экзема), глазные (зуд и слезливость глаз), желудочно-кишечные (запор, боль в животе, спазмы, рвота, понос), респираторные (жжение в носу, заложенный нос, ринит, астма) и в тяжелых случаях системные (головокружение, спутанность сознания, анафилаксия) проявления.

"Первичная профилактика аллергии" означает все мероприятия, направленные на избежание или уменьшение аллергической (иммунологической) сенсибилизации, к примеру предупреждение или снижение специфических антител типа IgE.

"Вторичная профилактика аллергии" означает предупреждение возникновения аллергического заболевания/аллергических симптомов у сенсибилизированного индивидуума.

"Период отнятия ребенка от груди" - это период, в течение которого младенец адаптируется от чисто жидкого питания к твердой или полутвердой пище и адаптируется от почти единственного типа пищи (обычно материнского молока или детского питания) к разнообразной пище.

"Сенсибилизация" означает индукцию/возникновение аллергенспецифичных антител типа IgE.

"Дети/маленькие дети/младенцы/грудные дети". Поскольку дети или младенцы особенно подвержены пищевой аллергии, то композиции настоящего изобретения предназначаются, без ограничения, для детей и/или младенцев. Согласно определениям, приведенным в Статье 2 Директивы 2006/141/ЕС Европейской комиссии от 22 декабря 2006 г.о детском питании и смесях для следующей стадии, "младенцы" - это дети младше 12 месяцев, а маленькие дети - это дети в возрасте от 1 до 3 лет. Термин "дети" включает все возрастные группы от 1 до 14 лет. Младенцы могут быть эквивалентом грудных детей и/или маленьких детей.

Авторы изобретения засвидетельствовали, что аллергические реакции и симптомы могут быть ослаблены, когда сенсибилизированные молодые млекопитающие получают полноценную питательную композицию, содержащую яблочный экстракт. Этим определяется положительный эффект на вторичную профилактику аллергии.

Вне ожидания этот эффект не сопровождался снижением сенсибилизации молодых млекопитающих аллергенами (т.е. не наблюдалось первичной профилактики аллергии).

Действие композиции

Изобретение касается применения яблочного экстракта, содержащего полифенолы, для изготовления полноценной питательной композиции, предназначенной для ослабления симптомов (аллергии, возникающей от пищи) у пациентов с аллергией, вызванной пищевыми аллергенами. Авторы изобретения показали, что яблочный экстракт способен уменьшать симптомы пищевой аллергии в группе мышей, получавших пищевую композицию, содержащую яблочный экстракт. Это наблюдается тогда, когда аллергическая реакция (провоцирующая проба) индуцируется после сенсибилизации. Модель имитирует пищевую аллергию у людей, когда они (обычно младенцы/маленькие дети) подвергаются естественной сенсибилизации к пищевым аллергенам. Таким образом, яблочный экстракт проявляет защитное действие. Не придерживаясь какой-либо теории, авторы полагают, что полифенолы яблочного экстракта взаимодействуют с полноценной питательной композицией (в частности, жировыми или белковыми компонентами), вызывая эффект усиления.

В одном воплощении изобретения композиция преимущественно оказывает действие на вторичную профилактику аллергии. Симптомы аллергии на модели у мышей действительно значительно ослабляются, о чем свидетельствует снижение клинического показателя аллергии. Как правило, симптомы могут включать все или выборочные из общепризнанных симптомов аллергии.

В одном воплощении изобретения симптомы включают понос, раздражение кожи или респираторные симптомы либо их комбинации.

В одном воплощении изобретения симптомы сопровождаются высвобождением биохимических медиаторов, таких как триптаза, химаза, гистамин, лейкотриены.

В одном воплощении изобретения композиция все-таки не влияет на сенсибилизацию пациентов к аллергенам. Действительно, первичная профилактика вроде как не достигается при действии композиции, содержащей яблочный экстракт. Пациенты все еще сенсибилизированы к пищевым аллергенам, но развивается меньше симптомов аллергии при повторном воздействии аллергена. Не придерживаясь какой-либо теории, предполагаем, что такое действие не ослабляет естественную иммунную защиту (которая имеет положительный эффект для пациента), а просто снижает выраженность симптомов аллергии.

В одном воплощении композиция ослабляет сенсибилизацию к другим аллергенам в дальнейшей жизни. Полагаем, что композиция усиливает (или по крайней мере не блокирует) естественные процессы иммунного созревания и поэтому способна оказывать долговременный эффект на ослабление сенсибилизации к тем же аллергенам или к другим аллергенам (ослабление сенсибилизации в дальнейшей жизни). Предполагается, что композиция изобретения, вызывая ослабление только лишь симптомов аллергии (вторичная профилактика), может способствовать естественному процессу иммунного созревания и оказывать такое продолжительное благоприятное действие.

Композиция изобретения

В одном воплощении изобретения композиция содержит яблочный экстракт, богатый полифенолами. Яблочный экстракт действительно обогащен полифенолами по сравнению с необработанным яблочным экстрактом (без обогащения). В одном из воплощений степень обогащения составляет по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 2 или по меньшей мере 5. Для действия композиции как будто необходимо, чтобы яблочный экстракт был достаточно концентрированным (обогащенным полифенолами) для развития и проявления антиаллергического эффекта. Эффект может быть обусловлен блокированием высвобождения аллергических медиаторов из эффекторных клеток типа тучных клеток (что сравнимо с действием антигистаминовых препаратов). Не придерживаясь какой-либо теории, полагаем также, что некоторые из соединений, присутствующих в значительном количестве в яблочном экстракте, могут связывать белковые аллергены и маскировать их от узнавания иммунной системой организма. Нельзя исключить, что яблочный экстракт (возможно, активные полифенолы) реагирует с определенными белками композиции (белками, присутствующими в композиции - особенно молочными белками) с образованием комплексов и маскирует потенциальные аллергены.

В одном воплощении изобретения композиция содержит от 0,01% до 0,3 масс.% яблочного экстракта. В одном из воплощений композиция содержит от 0,1% до 1 масс.% яблочного экстракта или от 0,4% до 0,6 масс.% Хотя для оказания требуемого эффекта нужно, чтобы присутствовало достаточное количество яблочного экстракта, слишком большое количество яблочного экстракта будет вызывать отрицательный эффект, воздействуя отрицательно на композицию (дисбаланс питательных веществ). Это значит, что при комплексировании слишком большого количества белка может измениться содержание биодоступного белка в композиции.

В следующем воплощении изобретения яблочный экстракт представляет собой белковый экстракт, выпускаемый фирмой Val de Vire Bioactives (Conde sur Vire, France) под названием "Pomactive HFV". В одном из воплощений яблочный экстракт подобен или происходит из указанного Pomactive HFV и обладает аналогичным действием.

В одном воплощении изобретения композиция содержит кверцетин. Кверцетин может содержаться в яблочном экстракте, в частности в полифенольных компонентах яблочного экстракта. В частности, кверцетин может связываться/образовывать комплексы с белками в полноценной питательной композиции, включая аллергенные белки, содержащиеся в композиции, а комплексообразование может способствовать антиаллергическому действию путем секвестрирования аллергенов от иммунной системы.

В одном воплощении изобретения композиция содержит гидролизованные или частично гидролизованные белки. Пищевая композиция на основе (частично) гидролизованных белков особенно подходит для иммунной системы и желудочно-кишечного тракта младенцев/маленьких детей, так как гидролизованные белки легче перевариваются и обладают меньшей аллергенностью по сравнению с интактными белками. Более того, можно предполагать, что гидролизованные белки могут очень эффективно связываться с полифенолами яблочного экстракта - к примеру, вследствие их относительного размера. Это может вызывать усиление эффекта маскировки аллергенов и тем самым еще более снижать аллергенность композиции. Она представляет наиболее подходящую композицию для иммунной системы и желудочно-кишечного тракта младенцев/маленьких детей с пищевой аллергией. В таком случае комбинация яблочного экстракта с гидролизованными белками имеет наибольшее значение для изобретения.

В одном воплощении гидролизованными белками являются белки, подвергнутые гидролизу из белков пшеницы и/или казеина. В одном из воплощений гидролизованные белки возникают под действием трипсина и/или химотрипсина на белки (особенно белки пшеницы). В одном из воплощений гидролизованные белки составляют соевые белки и/или яичные белки. В одном из воплощений гидролизованные белки возникают под действием таких протеаз, как Protamex® и/или Flavourzyme® (Novozyme, Дания). В одном из воплощений белки композиции, предпочтительно гидролизованные белки, составляют белки злаков или яичные белки. В одном из воплощений гидролизованные белки возникают под действием алкалазы. Композиция изобретения может содержать смесь из двух или нескольких из указанных источников белка.

Целевая группа

Композиция изобретения лучше всего подходит для сравнительно юных пациентов, хотя нельзя исключить и действие на взрослых. Наиболее предпочтительно пациенты достаточно молоды и все еще проходят фазу созревания иммунной системы и желудочно-кишечного тракта. У таких пациентов действие композиции может быть более сильным или более быстрым. В одном из воплощений композиция представляет собой детскую смесь, смесь для следующей стадии развития ребенка, молоко для подрастающих детей, зерновые каши/хлопья для грудных детей и/или детское питание. Под смесью для следующей стадии развития ребенка обычно понимаются композиции для младенцев после первых 6 месяцев жизни. Под молоком для подрастающих детей обычно понимаются композиции для малышей и/или детей в возрасте от 1-2 до 6 лет или от 2-3 до 5 лет. Молоко для подрастающих детей обычно означает композицию на основе коровьего молока. Предпочтительно композиция нацелена на младенцев или маленьких детей младше 6 лет, от рождения до 3-летнего возраста или от рождения до отнятия от груди. В одном из воплощений композиция представляет собой стартовую/начальную детскую смесь или смесь для следующей стадии развития ребенка. Предпочтительно питательная композиция содержит подавляющее большинство питательных веществ, необходимых для кормления маленьких детей.

В одном воплощении питательная композиция представляет собой композицию зерновых каш/хлопьев для младенцев/маленьких детей в возрасте от 1 до 4 лет. Композиция может быть более конкретно нацелена на период отнятия от груди и может вводиться вплоть до 12 месяцев после него. Период отнятия от груди, конечно, важен для изобретения, так как малыши сталкиваются с разнообразной пищей в период отнятия от груди в то время, когда их иммунная система и желудочно-кишечный тракт подвергаются быстрому созреванию. Следовательно, в этот период особое значение имеет эффективное контролирование аллергического ответа.

В одном воплощении питательная композиция изобретения представляет собой молоко для подрастающих детей, нацеленное на и составленное конкретно для малышей в возрасте от 1 до 3 лет или детей в возрасте от 3 до 6 лет. Композиция основана на коровьем молоке и может содержать пробиотики и/или пребиотики. Композиция может являться частью текущего рациона в возрасте от 1 до 6 лет и может вводиться в возрасте от 1 до 3 лет, а затем от 3 до 6 лет. Такое введение может быть не ежедневным, но достаточно регулярным (например, как минимум раз в месяц или неделю), чтобы давать ожидаемый эффект. Эффект композиции будет более выраженным при действии в ключевой период созревания иммунной системы и при введении на протяжении длительного времени.

В одном воплощении композиция вводится как во время раннего младенчества (первые 6 месяцев и/или от 6 месяцев до 1 года), так и позднего младенчества (напр., от 1 до 4 лет или от 2 до 6 лет). Такое введение может и не быть ежедневным, но достаточно регулярным (напр., как минимум раз в месяц или неделю), чтобы давать ожидаемый эффект. Непрерывное введение на протяжении длительного времени (несколько лет), хотя и относительно нечасто (раз в неделю, от 1 до 4 раз в месяц), может усиливать наблюдаемый эффект, действуя в решающей фазе созревания иммунной системы.

Что касается применения композиции изобретения, то дети, малыши или младенцы могут быть аллергичными. Аллергичными являются те дети, малыши или младенцы, которые испытали по меньшей мере один эпизод аллергической реакции - легкой, средней или тяжелой - на пищевой аллерген. В одном воплощении изобретения у детей, малышей или младенцев отмечались тяжелые аллергии на пищевые аллергены и/или они испытали более чем один эпизод умеренной или тяжелой пищевой аллергии.

Пищевые аллергены, охваченные настоящим изобретением, могут включать все типы аллергенов, встречающихся в природе или обычно встречающихся в пище, особенно в пище для юных (например, младенцев, малышей, детей).

Экспериментальные результаты

Исследования in vitro с клетками человека и клетками грызунов привели к предположению, что антиоксиданты могут модулировать функцию тучных клеток. Поскольку фрукты и овощи богаты антиоксидантами, авторы поставили вопрос, могут ли фруктовые экстракты повлиять на симптомы пищевой аллергии. В частности, авторы протестировали эффект потребления яблочного экстракта Pomactiv HFV на модели пищевой аллергии у мышей (OVA Food Allergy Mouse Model, представленная на фиг.1).

После провоцирующей пробы у мышей, получавших яблочный экстракт, возникали менее тяжелые клинические симптомы, чем у сенсибилизированных, необработанных животных (положительный контроль). Эти результаты проиллюстрированы экспериментальными результатами, представленными на фиг.2 и 3.

На фиг.2 представлены результаты двух независимых предварительных экспериментов, проведенных при 10 животных на группу. Измеренный результат (показатель аллергии) проявлял положительную тенденцию снижения показателя аллергии у мышей, получавших яблочный экстракт, по сравнению с положительным контролем (p=0,08, 0,06, соответственно).

На фиг.3 представлены результаты статистически значимых экспериментов (n=15 в группе) на той же модели. Эффект снижения показателя аллергии в группе, получавшей яблочный экстракт в течение последней недели перед провоцирующей пробой (вторичная профилактика), подтвердился и оказался статистически значимым (фиг.3; p=0.014, группа "яблочный экстракт Pomactiv HFV", вторичная). В группе, получавшей тот же самый яблочный экстракт во время фазы сенсибилизации (группа "яблочный экстракт Pomactiv HFV", первичная), не наблюдалось ослабления симптомов после пробы. Точно также в группе, получавшей другой яблочный экстракт, не наблюдалось ослабления симптомов после пробы (фиг.3, группа Diana Naturals AFPOMM9080).

Наряду с клиническим показателем определяли уровень протеазы-1 тучных клеток мыши (ММСР-1) в сыворотке в качестве меры активации тучных клеток кишечника после пробы с аллергеном. Потребление яблочного экстракта Pomactiv HFV значительно снижало уровни ММСР-1 в сыворотке по сравнению с необработанными контрольными животными (фиг.4).

Уровни экспрессии в кишечнике различных генов, связанных с аллергией, определяли методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR, см. методику ниже). Измерения экспрессии генов проводились на тканях из двух различных участков (пейеровы бляшки подвздошной кишки и сама подвздошная кишка для группы положительного контроля, группы отрицательного контроля и группы, получавшей яблочный экстракт (Pomactiv HFV) в последнюю неделю перед провоцирующей пробой (вторичная профилактика). На фиг.5 (табл.1) и фиг.6 (табл.2) представлены полученные результаты. Группа, получавшая яблочный экстракт Pomactiv HFV, проявляла снижение экспрессии различных генов, включая цитокины интерлейкин (IL)-5, IL-13, IL-10, интерферон (IFN)-γ и хемокин CCL11 (эотаксин) в пейеровых бляшках подвздошной кишки и цитокины IL-13, IL-10, IL-12, IFN-γ, хемокин CCL11 (эотаксин) и фактор транскрипции GATA-3 в самой подвздошной кишке. Гены, у которых отмечалось снижение экспрессии, являются общепризнанными маркерами для фенотипа Т-хелперов 2 (IL-5, IL-13, CCL11, GATA-3), который, как известно, ведет к развитию аллергии. Таким образом, эксперименты свидетельствуют о понижающей модуляции иммунных ответов путем снижения экспрессии соответствующих генов тогда, когда сенсибилизированные животные получают яблочный экстракт (вторичная профилактика). Предполагается, что это способствует антиаллергическому эффекту исследуемого яблочного экстракта в уменьшении аллергических симптомов (вторичная профилактика).

Заключение

Эти данные показывают, что потребление обогащенного полифенолом яблочного экстракта (Pomactiv HFV) сенсибилизированными животными приводит к ослаблению симптомов аллергии при воздействии сенсибилизирующего аллергена. Ослабление симптомов сопровождалось снижением уровня ММСР-1 в сыворотке и снижением экспрессии ключевых генов, связанных с аллергией, в кишечнике, свидетельствуя о том, что модуляция таких компонентов иммунной системы, как тучные клетки, вносит вклад в защитный эффект.

Аналитические методы

Модель пищевой аллергии на OVA у мышей

6-недельных мышей стандартной линии BALB/c сенсибилизировали перорально (гаважом) с интервалом в 1 неделю с помощью 20 мг овальбумина (OVA) фирмы Fluka (Buchs, Швейцария)+10 мкг/мышь холерного токсина (в качестве адъюванта) фирмы LuBioscience (Lucerne, Швейцария) в течение 7 недель. Через неделю после последней сенсибилизации проводили перорально провоцирующую пробу с помощью 100 мг OVA. На всем протяжении эксперимента проводилось пищевое вмешательство добавлением в корм (Kliba 3200, Kliba Nafag Kaiseraugst, Швейцария) яблочного экстракта HFV фирмы Val de Vire Bioactives (Val de Vire Bioactives - BP2-50890 Conde sur Vire, France, название по каталогу: "Pomactiv HFV") или AFPOMM9080 фирмы Diana Naturals (Antrain, France) (1 масс.%); в качестве первичной профилактики в период сенсибилизации или в качестве вторичной профилактики, начиная с конца фазы сенсибилизации (фиг.1). Через 15 минут после пробы мышей отслеживали индивидуально в течение 30 минут). Регистрировали клинические симптомы и выражали их количественно (аллергический показатель) следующим образом: 0 - нет симптомов, менее 4 случаев почесывания; 1 - 4-10 случаев почесывания вокруг носа и головы, без поноса; 2 - более 10 случаев почесывания или ощетинившаяся шерсть и неподвижность или мягкий стул; 3 - понос или затрудненное дыхание либо цианоз; 4 - понос в сочетании с неподвижностью после толчка, ощетинившаяся шерсть, затрудненное дыхание или цианоз; 5 - анафилаксия. Через 4 часа после пробы мышей забивали (смещением шейных позвонков), брали кровь и последний сантиметр подвздошной кишки плюс одну пейерову бляшку из того же участка и замораживали в жидком азоте.

ММСР-1 в сыворотке

Протеазу-1 тучных клеток мыши (ММСР-1) определяли в сыворотке мышей методом ELISA с помощью набора, приобретенного у Moredun Scientific (Midlothian, Scotland), согласно инструкциям производителя. Концентрацию ММСР-1 получали, переводя значения OD в пкг/мл по стандартной полиномной кривой.

Анализ экспрессии генов в кишечнике на матрицах низкой плотности

Экстракция РНК и ее определение

Тотальную рибонуклеиновую кислоту (РНК) из подвздошной кишки и пейеровых бляшек экстрагировали по методике производителя с помощью набора SV Total RNA Isolation System, приобретенного у Promega (Dubendorf, Швейцария). РНК определяли с помощью набора Quant-IT Ribogreen Reagent kit фирмы Promega (Dubendorf, Швейцария) по методике производителя.

Обратная транскрипция

Обратную транскрипцию проводили на 1 мкг тотальной РНК с помощью набора Multiscribe Reverse Transcriptase фирмы Applied Biosystems (Foster City, USA). Тотальную РНК смешивали с 50 мкМ случайных гексамеров, 0,5 мМ dNTPs, 20 ед. ингибитора РНКаз (Applied Biosystems), 62,5 ед. обратной транскриптазы Multiscribe, буфера 1×RT и 5,5 мМ MgCl₂ в конечном объеме 50 мкл. Обратную транскрипцию запускали на термоциклере ТЗ (Biometra, Gottingen, Германия) со следующей программой циклов: 10 мин при 25°C, 30 мин при 48°C, 5 мин при 95°C и заканчивали при 4°C.

LDA (матрицы низкой плотности)

Матрицы низкой плотности проектировали через веб-сайт Applied Biosystems (http://www3.appliedbiosystems.com/index.htm). Нанесение, разгон и анализ проводили по методике производителя на количественном ABI-Prism 7900HT.

Расчеты нормализировали по средним значениям 3 конститутивных (housekeeping) генов: β-актина, GAPDH и HPRT. Исходя из полученных значений пороговой величины цикла (Ct), определяли относительную и нормализованную экспрессию мРНК для каждого гена, используя значения ΔCt. Значения ΔCt для каждого гена подвергали коррекции по среднему значению 3 конститутивных генов. Результаты рассчитывали в виде относительной экспрессии по формуле - 2 - ΔCt×K, где коэффициент K=10⁶. Увеличение уровня экспрессии нормализировали по уровню экспрессии в отрицательной группе.