СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА С3 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА ПО СПОСОБНОСТИ СВЯЗЫВАТЬСЯ С ПЕПТИДОГЛИКАНОМ

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса.

Известен способ определения функциональной активности компонента C3 [1], который предусматривает сорбцию в лунках микропанели иммуноглобулина G, затем внесения в лунки микропанели комплемента морской свинки, служащего в качестве источника компонентов C1, C2 и C4 (присутствующий компонент C3 морской свинки не обнаруживается специфическими антителами против C3 человека) и анализируемой пробы, содержащей компонент C3 человека с неизвестной активностью, и проведения инкубации для активации комплемента, в ходе которой происходит связывание C3 на молекулах активатора - сорбированного иммуноглобулина. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента C3 человека определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к C3, конъюгированных с ферментом.

Известен также способ [2], позволяющий определять функциональную активность компонента C3 комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата дерината для использования в качестве активатора классического пути комплемента и заменой комплемента морской свинки гомологичным реагентом R3 - сыворотки крови человека, лишенной активности C3.

Наконец, для активации компонента C3, необходимой для связывания на микропанели с последующим определением количества связавшегося теми же приемами, в способе [3] используется альтернативная C3 конвертаза, формируемая в результате активации альтернативного пути с помощью сорбируемого на микропанели лизоцима - активатора альтернативного пути и реагента R3, как источника факторов В и D человека, необходимых для формирования C3 конвертазы альтернативного пути комплемента.

Недостатком всех этих способов является участие в процессе активации компонента C3, C3 конвертазы, формируемой из компонентов комплемента морской свинки в первом случае либо из компонентов или факторов комплемента реагента R3, во втором и в третьем случаях, поскольку при проведении определения активности компонента C3 в сыворотках крови неизбежно создаются условия активации комплемента по классическому или альтернативному пути, что затрагивает и другие компоненты комплемента и может приводить к их неспецифической сорбции на поверхности лунок микропанели.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность компонента C3 комплемента человека в условиях отсутствия активации ни одного из путей комплемента и не требующего участия других компонентов комплемента и не затрагивающего их, если они присутствуют в анализируемой пробе.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора для иммуноферментного определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели препаратов, содержащих пептидогликан, затем внесение в лунки микропанели раствора, содержащего компонент C3 комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии ЭДТА для блокирования всех путей активации комплемента, в ходе которой происходит связывание C3 на сорбированном пептидогликане, выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента C3 человека, отмывание несвязавшегося конъюгата, внесение субстрата конъюгированного фермента и проведение расчета активности компонента C3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Тем самым достигается определение функциональной активности C3 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным пептидогликаном, конъюгат фермента с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью C3 в качестве стандарта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости активации всей системы комплемента.

В основе предлагаемого способа лежит обнаруженная способность препаратов пептидогликана прочно и одинаково связывать (по-видимому, ковалентно) только функционально активные молекулы компонента C3, которая не зависит от наличия в среде солей кальция и магния, необходимых для активации классического и лектинового путей, только магния для альтернативного пути, а также в среде с ЭДТА, когда отсутствие ионов кальция и магния полностью блокирует возможность активации комплемента.

Иммуномодулирующие свойства пептидогликана известны давно [4, 5]. В 1983 г. было впервые показано, что пептидогликан из Lactobaccilus bulgaricus (бластолизин) активирует альтернативный путь комплемента [6], и тем самым было доказано, что иммуномодулирующие свойства пептидогликанов из клеточных стенок бактерий обусловлены его воздействием на систему комплемента. Кроме того, в литературе неоднократно публиковались работы, посвященные иммуномодулирующей активности пептидогликанов. В частности, это касалось свойств препарата иммуномакса [7, 8], представляющего собой кислый пептидогликан растительного происхождения.

Пример 1. Определение функциональной активности компонента C3 комплемента человека. Пептидогликан - аптечный препарат иммуномакс в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, с конечной концентрацией 5-20 мкг/мл вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°C. Три раза отмывают микропанель 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетат натрия), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки микропанели вносят по 100 мкл раствора, содержащего определяемый компонент C3 в том же буфере. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, трехкратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против C3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Количество активного компонента C3 рассчитывают по стандартной кривой (рис.1), где представлено определение активности компонента C3 комплемента человека иммуноферментным методом на иммуномаксе. (R²=0.98).

Пример 2. Набор для определения функциональной активности компонента C3. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом пептидогликана, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известным содержанием активного компонента C3 в качестве стандарта. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного компонента C3 и позволяет достоверно определять функциональную активность компонента C3 в количествах от 1 нг описанным способом с использованием описанного набора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Козлов Л.В., Романов С.В., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека по классическому пути. 2005. Патент РФ 2251397. Бюл. №13. 10.05.2005.

2. Козлов Л.В., Гора Н.В., Бичучер A.M. Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека. Патент РФ 2417375. Бюл. №12. 27.04.2011.

3. Козлов Л.В., Гора Н.В. Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека по альтернативному пути активации. Патент 2380707. 27.01.2010.

4. White R.G., Bernstock L., Johns R.G.S., Lederer E. The influence of components of M. tuberculosis and other Mycobacteria upon antibody production to ovalbumin. Immunology. 1958. V.1. P.54-66.

5. Ellouz F., Adam A., Ciorbaru R., Lederer E. Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycan derivatives. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1974. V.59. No.4. P.1317-1325.

6. Козлов Л.В., Зинченко А.А., Соляков Л.С., Сизой М.Н., Ищенко A.M., Мартюшин С.В., Андреев С.В. Механизм активации комплемента человека иммуностимуляторами из клеточных стенок бактерий. Биоорган. химия. 1983. Т.9. №8. С.1047-1055.

7. Атауллаханов Р.И.; Пичугин А.В.; Хаитов P.M. Способ получения вещества, обладающего иммуностимулирующей, противовирусной и антибактериальной активностью, вещество, полученное этим способом, и фармацевтическая композиция на его основе. Патент 2195308. 27.12.2002.

8. Атауллаханов Р.И., Пичугин А.В., Шишкова Н.М., Мастернак Т.Е., Малкина Е.Ю., Ульянова Л.И., Стеценко О.Н. Клеточные механизмы иммуномодулирующего действия препарата иммуномакса. Иммунология. 2005. №2. С.111-120.