КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПОЛЕЗНЫЕ ДЛЯ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА ПРОДУКТЫ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ

Изобретение относится к биотехнологии и фармацевтической промышленности и предназначено для использования в производстве и применении медицинских иммунобиологических препаратов и биологически активных добавок к пище.

В настоящее время установлено, что использование живых пробиотических микроорганизмов может в ряде случаев привести к проблемам нарушения микроэкологии и возникновению заболеваний человека (Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том III. Пробиотики и функциональное питание. - М.: Грантъ, 2001. - С.217-224).

Поэтому перспективной является разработка продукции на основе метаболитов пробиотических микроорганизмов (RU 2397246, C12N 1/20, A23L 1/054).

Известны бактериоцины молочнокислых бактерий, которые предложены в качестве биоцидов для промышленного использования в виде биоцидной композиции (WO 2012145185, A01N 63/02). Согласно данному изобретению бактериоцины продуцируются штаммами молочнокислых бактерий, выбранными из группы: Streptococcus spp., Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Pediococcus spp., Leuconostoc spp., Bifidobacterium spp. и Enterococcus spp. Бактериоцины выбраны из группы: ацидофилин, grocin, alveicin, aureocin, bulgarican, карноцин, казеицин, колицин, curvaticin, diplococcin, divercin, энтероцин, энтеролизин, эпидермин, erwiniocin, glycinecin, halocin, helveticin, лактококцин, лактицин, лактоцин, leucoccin, mesentericin, низин, педиоцин, плантарицин, сакацин, субтилин, sulfolobicin, турицин, trifolitoxin, vibriocin и варнерин. Биоцидная композиция на основе данных бактериоцинов предназначена для обработки систем водоснабжения, в том числе для обработки системы дезинфекции питьевой воды.

Известен консервант сельскохозяйственной продукции, включающий антимикробный агент низин, молочную кислоту, внеклеточные метаболиты молочнокислых бактерий, обладающие антимикробной активностью, и внутриклеточные метаболиты молочнокислых бактерий, полученные путем экстракции разрушенных или неразрушенных клеток молочнокислых бактерий водой или водно-солевыми растворами, причем в качестве молочнокислых бактерий содержит штаммы молочнокислых бактерий, обладающие антимикробной активностью (RU 2159553, А23В 7/14, А23В 7/10, A23L 1/212, A23L 3/3463).

Основными недостатками данных аналогов на основе бактериоцинов молочнокислых бактерий являются отсутствие сочетания продуктов жизнедеятельности бактерий, обладающих взаимодополняющим антибактериальным, иммуномодулирующим, противоаллергическим и противовоспалительным действием, и то, что они не предназначены для использования в качестве медицинских иммунобиологических препаратов и биологически активных добавок к пище.

Известны такие свойства экзополисахаридов молочнокислых бактерий - лаксаранов, как: стимуляция роста некоторых молочнокислых бактерий и подавление количества энтеропатогенной кишечной палочки и стафилококков; стимуляция фагоцитарной активности макрофагов и влияние на продукцию основных провоспалительных цитокинов; ранозаживляющие свойства. Также известно использование свойств лаксаранов для улучшения структурно-механических, физико-химических, микробиологических и органолептических свойств сыровяленых колбас (Правдивцева М.И. Характеристика биологической активности экзополисахаридов бактерий рода Lactobacillus и перспективы их использования: автореф. дисс.… канд. биол. наук. - Саратов, 2012. - 21 с. - URL: http://www.sgau.ru/assets/files/Nauka/autoref/pravdivceva_mi.doc).

Основными недостатками данного аналога, в котором описаны свойства и возможности применения экзополисахаридов молочнокислых бактерий - лаксаранов, являются отсутствие сочетания продуктов жизнедеятельности бактерий, обладающих взаимодополняющим антибактериальным, иммуномодулирующим, противоаллергическим и противовоспалительным действием, и то, что не разработаны композиции, предназначенные для использования в качестве медицинских иммунобиологических препаратов и биологически активных добавок к пище.

Известно средство для раннего лечения радиационных и комбинированных радиационно-термических поражений, представляющее собой микробные клетки и продукты их метаболизма в среде культивирования, полученные при инактивации консорциума штаммов Lactobacillus acidophilus 100аш, NK₁ и К₃Ш₂₄, взятых в соотношении 1:1:1 при содержании 10⁷-10⁸ живых микробных клеток в 1 мл ростовой среды (RU 2123344, А61К 35/74).

Известна композиция для коррекции дисбактериоза кишечника, составленная на основе консорциума штаммов лактобацилл, обеспечивающего соотношение суммы короткоцепочечных монокарбоновых жирных кислот фракций (С₂-С₄) и изомера масляной кислоты от 20:1 до 40:1 (RU 2431492, А61К 35/74, А61Р 1/00). Техническим результатом заявляемого изобретения является обеспечение персонализации коррекции дисбактериоза кишечника у пациентов с повышенным показателем обратного соотношения суммы фракций короткоцепочечных монокарбоновых жирных кислот (С₄-С₆) к сумме фракций их изомеров (С₄-С₆).

Основным недостатком данного аналога является отсутствие сочетания продуктов жизнедеятельности бактерий, обладающих взаимодополняющим антибактериальным, иммуномодулирующим, противоаллергическим и противовоспалительным действием.

Известен препарат хилак форте, содержащий короткоцепочечные летучие жирные кислоты, обеспечивающие восстановление поврежденной микрофлоры кишечника при инфекционных заболеваниях желудочно-кишечного тракта, стимулирующие регенерацию эпителиальных клеток кишечной стенки, восстанавливающие нарушенный водно-электролитный баланс в просвете кишки. Хилак форте усиливает защитные функции организма благодаря стимуляции иммунного ответа (Хилак форте (Hylak forte): инструкция по применению, противопоказания и состав. - URL: http://www.rlsnet.ru/tn_index_id_3474.htm).

Основным недостатком данных аналогов является отсутствие сочетания продуктов жизнедеятельности бактерий, обладающих взаимодополняющим антибактериальным, иммуномодулирующим, противоаллергическим и противовоспалительным действием.

Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения - прототипом является комплексный обогатитель пищевого продукта, полученный путем культивирования пробиотических микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры человека, до максимального накопления биомассы с последующим отделением микроорганизмов и содержанием основных экзометаболитов, мг/л: экзополисахариды 50,0-400,0, органические кислоты в пересчете на молочную кислоту 9,0-12,0, витамины группы В 80,0-100,0 (RU 2397246, C12N 1/20, A23L 1/054).

Основным недостатком прототипа является отсутствие сочетания в композиции продуктов жизнедеятельности бактерий, обладающих взаимодополняющим антибактериальным, иммуномодулирующим, противоаллергическим и противовоспалительным действием.

Главной задачей заявляемого изобретения является сочетание в композиции продуктов жизнедеятельности бактерий, обладающих взаимодополняющим антибактериальным, иммуномодулирующим, противоаллергическим и противовоспалительным действием.

Поставленная задача реализуется за счет того, что композиция представляет собой среду культивирования молочнокислых бактерий, содержащую лаксаран в количестве 5-10 г/мл, казеицин, исрацидин или их смесь и лектины в количестве 0,05-2,5 моль/л, гистамин в количестве 0,8-2,0 ммоль/л и монокарбоновые жирные кислоты с неразветвленной цепью, а именно: уксусную кислоту, пропионовую кислоту, масляную кислоту и валериановую кислоту - в количестве 10-20 мг/мл. Композиция может также содержать целевые добавки и быть при этом выполненной в форме суспензии или крема, или мази, или пасты, или маски. Среда культивирования бактерий может быть выбрана из ряда: сквашенное молоко, имеющее жирность 0,5-1,5% и рН 5,0-6,8, сквашенное обезжиренное молоко, имеющее рН 5,0-6,8, сквашенное обезжиренное, выпаренное на 10-20% молоко, имеющее рН 5,0-6,8, среда на основе раскисленной молочной солянокислотной казеиновой сыворотки после культивирования бактерий, среда на основе раскисленной молочной молочнокислотной казеиновой сыворотки после культивирования бактерий, среда на основе раскисленной молочной лимоннокислотной казеиновой сыворотки после культивирования бактерий, казеиново-дрожжевая среда после культивирования бактерий, гидролизатно-молочная среда после культивирования бактерий или их смеси. В качестве лаксарана композиция может содержать лаксаран, выбранный из ряда: лаксаран Z, лаксаран 1936, лаксаран 1596 или их смесь. В качестве казеицина композиция может содержать казеицин А, казеицин В или их смесь. В качестве целевых добавок композиция может содержать настой пижмы, настой шалфея, отвар коры дуба, казеин, желатин, агар, глицерин, яичный желток, яичный белок, пектин, целлюлозу, производные целлюлозы, бентонит, каолин, аэросил, меди сульфат, меди глюконат, хинозол, хитозан, воду, экстракт корня солодки, экстракт шиповника, настой ромашки, инулин, экстракт топинамбура, экстракт цикория, настой кипрея, настой мяты перечной, масло из семян расторопши, воск эмульсионный, комбижир, ланолин, спермацет, вазелин, церезин, вазелиновое масло, искусственный вазелин, пальмитин, гидрированный жир, переэтерифицированный жир, кондитерский жир, пальмовый олеин, пальмовый стеарин, масло оливковое, масло персиковое, масло подсолнечное, масло касторовое, полиэтиленоксид, нипагин, нипазол, микрокаре РМ5, микрокаре IT или их смеси.

В результате впервые проведенных нами исследований была определена обеспечивающая решение поставленной задачи новая совокупность оригинальных отличительных признаков: установлен перечень показателей (состава продуктов жизнедеятельности молочнокислых бактерий, действие которых дополняет и усиливает друг друга), обеспечивающий сочетание антибактериального, иммуномодулирующего, противоаллергического и противовоспалительного действия композиции; разработаны достигаемые в процессе культивирования и очистки значения данных показателей (концентрации лаксарана, казеицина, исрацидина и лектинов, гистамина и короткоцепочечных монокарбоновых жирных кислот с неразветвленной цепью), оптимальные для получения сочетания заданных свойств вариантов композиции. Был разработан порядок приоритетов определяемых показателей, используемый при подборе питательных сред, штаммов молочнокислых бактерий и условий культивирования, обеспечивающий решение поставленной задачи и представляющий собой следующую последовательность: концентрация гистамина, концентрация короткоцепочечных монокарбоновых жирных кислот с неразветвленной цепью и концентрации лаксарана, казеицина, исрацидина и лектинов.

Из патентно-технической литературы и практики производства медицинских иммунобиологических препаратов и биологически активных добавок к пище неизвестна композиция, содержащая полезные для организма человека продукты жизнедеятельности молочнокислых бактерий в виде экзометаболитов и продуктов ферментолиза, которая была бы идентична заявляемой.

Отсюда правомерен вывод о соответствии заявляемого решения критерию «новизна».

Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для получения технического результата - сочетания в композиции продуктов жизнедеятельности бактерий, обладающих взаимодополняющим антибактериальным, иммуномодулирующим, противоаллергическим и противовоспалительным действием, которое обеспечивается перечнем определяемых показателей (составом продуктов жизнедеятельности бактерий, действие которых дополняет и усиливает друг друга), достигаемым в процессе культивирования и очистки значениями данных показателей (концентрации лаксарана, казеицина, исрацидина, лектинов, гистамина и короткоцепочечных монокарбоновых жирных кислот с неразветвленной цепью), оптимальными для получения сочетания заданных свойств вариантов композиции.

Между существующими признаками и решаемой задачей существует причинно-следственная связь, где каждый признак необходим и влияет на получение технического результата, а вместе взятые признаки достаточны для его получения. Правомерен вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Предлагаемая композиция с присущими ей существенными признаками может быть получена многократно, а значит, заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».

Заявляемое изобретение апробировано при получении вариантов композиции и исследовании их свойств на экспериментальных животных моделях заболеваний. Ниже приводятся результаты этой апробации. При этом приведенные примеры полученных вариантов композиций и их свойств показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.

Пример 1. Получена композиция, представляющая собой среду культивирования молочнокислых бактерий (среду на основе раскисленной молочной лимоннокислотной казеиновой сыворотки после культивирования бактерий), содержащую бактериальные экзополисахариды (смесь лаксарана Z и лаксарана 1936) в количестве 10 г/мл, антимикробные пептиды (смесь казеицина А, казеицина В и исрацидина) и лектины в количестве 2,5 моль/л, гистамин в количестве 2,0 ммоль/л и короткоцепочечные монокарбоновые жирные кислоты с неразветвленной цепью (смесь уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты и валериановой кислоты) в количестве 20 мг/мл.

Свойства композиции были исследованы на экспериментальной животной модели экземы, осложненной пиодермией, полученной с использованием линии инбредных мышей BALB/c. В результате перорального введения полученной композиции и ее нанесения на очаги высыпаний на коже экспериментальных животных экзематозные высыпания и проявления пиодермии разрешились. Отмечена элиминация возбудителя пиодермии - Staphylococcus aureus. Нормализовались иммунологические показатели экспериментальных животных (в том числе соотношение CD4- и CD8-клеток, а также реакция бласттрансформации лимфоцитов). Снизился уровень гистамина в содержимом кишечника. В образцах эпидермиса и дермы, полученных из разрешившихся высыпаний, при гистологическом исследовании не выявлено признаков воспалительной реакции. Таким образом было установлено сочетание антибактериального, иммуномодулирующего, противоаллергического и противовоспалительного действия полученной композиции.

Пример 2. Получена композиция, представляющая собой среду культивирования молочнокислых бактерий (смесь среды на основе раскисленной молочнокислотной казеиновой сыворотки после культивирования бактерий и казеиново-дрожжевой среды после культивирования бактерий), содержащую бактериальные экзополисахариды (лаксарана Z) в количестве 5 г/мл, антимикробные пептиды (смесь казеицина А и исрацидина) и лектины в количестве 0,05 моль/л, гистамин в количестве 0,8 ммоль/л и короткоцепочечные монокарбоновые жирные кислоты с неразветвленной цепью (смесь уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты и валериановой кислоты) в количестве 10 мг/мл.

Свойства композиции были исследованы на экспериментальной животной модели экземы, осложненной пиодермией, полученной с использованием линии инбредных мышей BALB/c. В результате перорального введения полученной композиции и ее нанесения на очаги высыпаний на коже экспериментальных животных экзематозные высыпания и проявления пиодермии разрешились. Отмечена элиминация возбудителя пиодермии - Staphylococcus aureus. Нормализовались иммунологические показатели экспериментальных животных (в том числе соотношение CD4- и CD8-клеток, а также реакция бласттрансформации лимфоцитов). Снизился уровень гистамина в содержимом кишечника. В образцах эпидермиса и дермы, полученных из разрешившихся высыпаний, при гистологическом исследовании не выявлено признаков воспалительной реакции. Таким образом было установлено сочетание антибактериального, иммуномодулирующего, противоаллергического и противовоспалительного действия полученной композиции.

Пример 3. Получена первая композиция, представляющая собой среду культивирования молочнокислых бактерий (смесь среды на основе раскисленной молочной лимоннокислотной казеиновой сыворотки после культивирования бактерий и гидролизатно-молочной среды после культивирования бактерий), содержащую бактериальные экзополисахариды (смесь лаксарана Z, лаксарана 1936 и лаксарана 1596) в количестве 8 г/мл, антимикробные пептиды (смесь казеицина А, казеицина В и исрацидина) и лектины в количестве 2,0 моль/л, гистамин в количестве 1,5 ммоль/л и короткоцепочечные монокарбоновые жирные кислоты с неразветвленной цепью (смесь уксусной кислоты, пропионовой кислоты и масляной кислоты) в количестве 17 мг/мл.

Получена также вторая композиция, представляющая собой среду культивирования бактерий (смесь сквашенного обезжиренного молока, имеющего рН 5,0-6,8, и гидролизатно-молочной среды после культивирования бактерий), содержащую бактериальные экзополисахариды (смесь лаксарана Z, лаксарана 1936 и лаксарана 1596) в количестве 5 г/мл, антимикробные пептиды (смесь казеицина А, казеицина В и исрацидина) и лектины в количестве 0,05 моль/л, гистамин в количестве 0,8 ммоль/л, короткоцепочечные монокарбоновые жирные кислоты с неразветвленной цепью (смесь уксусной кислоты, пропионовой кислоты и масляной кислоты) в количестве 10 мг/мл и целевые добавки (хитозан, ланолин, вазелиновое масло и масло оливковое). При этом данная композиция была выполнена в форме крема.

Свойства обеих композиций были исследованы на экспериментальной животной модели пищевой аллергии, в сочетании с экземой и пиодермией, полученной с использованием линии инбредных мышей BALB/c. В результате перорального введения первой (по данному примеру) полученной композиции и нанесения второй (по данному примеру) полученной композиции на очаги высыпаний на коже экспериментальных животных у животных нормализовалась консистенция фекалий, разрешились экзематозные высыпания и проявления пиодермии. Отмечена элиминация в кишечнике грибов рода Candida, а также элиминация возбудителя пиодермии - Streptococcus pyogenes. Улучшились иммунологические показатели экспериментальных животных (в том числе нормализовались соотношение CD4- и CD8-клеток, реакция бласттрансформации лимфоцитов, снизился уровень специфических IgE). Уменьшились значения дегрануляции перитонеальных тучных клеток. Снизился уровень гистамина в содержимом кишечника. В образцах эпидермиса и дермы, полученных из разрешившихся высыпаний, при гистологическом исследовании не выявлено признаков воспалительной реакции. Таким образом было установлено сочетание антибактериального, иммуномодулирующего, противоаллергического и противовоспалительного действия полученных композиций.

Пример 4. Получена композиция, представляющая собой среду культивирования молочнокислых бактерий (смесь сквашенного обезжиренного молока, имеющего рН 5,0-6,8, среды на основе раскисленной молочной лимоннокислотной казеиновой сыворотки после культивирования бактерий и гидролизатно-молочной среды после культивирования бактерий), содержащую бактериальные экзополисахариды (смесь лаксарана Z, лаксарана 1936 и лаксарана 1596) в количестве 10 г/мл, антимикробные пептиды (смесь казеицина А, казеицина В и исрацидина) и лектины в количестве 2,5 моль/л, гистамин в количестве 2,0 ммоль/л, короткоцепочечные монокарбоновые жирные кислоты с неразветвленной цепью (смесь уксусной кислоты, пропионовой кислоты и масляной кислоты) в количестве 20 мг/мл и целевые добавки (глицерин, хинозол, экстракт корня солодки, экстракт шиповника и каолин). При этом данная композиция была выполнена в форме суспензии.

Свойства композиции были исследованы на экспериментальной животной модели пищевой аллергии, в сочетании с экземой и пиодермией, полученной с использованием линии инбредных мышей BALB/c. В результате перорального введения полученной композиции и ее нанесения на очаги высыпаний на коже экспериментальных животных у животных нормализовалась консистенция фекалий, разрешились экзематозные высыпания и проявления пиодермии. Отмечена элиминация в кишечнике грибов рода Candida, а также элиминация возбудителя пиодермии - Streptococcus pyogenes. Улучшились иммунологические показатели экспериментальных животных (в том числе нормализовались соотношение CD4- и CD8-клеток, реакция бласттрансформации лимфоцитов, снизился уровень специфических IgE). Уменьшились значения дегрануляции перитонеальных тучных клеток. Снизился уровень гистамина в содержимом кишечника. В образцах эпидермиса и дермы, полученных из разрешившихся высыпаний, при гистологическом исследовании не выявлено признаков воспалительной реакции. Таким образом было установлено сочетание антибактериального, иммуномодулирующего, противоаллергического и противовоспалительного действия полученной композиции.

Пример 5. Получена композиция, представляющая собой среду культивирования молочнокислых бактерий (сквашенное обезжиренное, выпаренное на 10-20% молоко, имеющее рН 5,0-6,8), содержащую бактериальные экзополисахариды (смесь лаксарана Z, лаксарана 1936 и лаксарана 1596) в количестве 8 г/мл, антимикробные пептиды (смесь казеицина А, казеицина В и исрацидина) и лектины в количестве 1,8 моль/л, гистамин в количестве 1,4 ммоль/л, короткоцепочечные монокарбоновые жирные кислоты с неразветвленной цепью (смесь уксусной кислоты, пропионовой кислоты и масляной кислоты) в количестве 16 мг/мл и целевые добавки (настой шалфея, глицерин, хинозол, экстракт корня солодки, экстракт шиповника, аэросил, кондитерский жир и масло оливковое). При этом данная композиция была выполнена в форме пасты.

Свойства композиции были исследованы на экспериментальной животной модели пищевой аллергии в сочетании с экземой и пиодермией, полученной с использованием линии инбредных мышей BALB/c. В результате перорального введения полученной композиции (в качестве пищевой пасты) и ее нанесения на очаги высыпаний на коже экспериментальных животных (в качестве средства для наружного применения) у животных нормализовалась консистенция фекалий, разрешились экзематозные высыпания и проявления пиодермии. Отмечена элиминация в кишечнике грибов рода Candida, а также элиминация возбудителя пиодермии - Streptococcus pyogenes. Улучшились иммунологические показатели экспериментальных животных (в том числе нормализовались соотношение CD4- и CD8-клеток, реакция бласттрансформации лимфоцитов, снизился уровень специфических IgE). Уменьшились значения дегрануляции перитонеальных тучных клеток. Снизился уровень гистамина в содержимом кишечника. В образцах эпидермиса и дермы, полученных из разрешившихся высыпаний, при гистологическом исследовании не выявлено признаков воспалительной реакции. Таким образом было установлено сочетание антибактериального, иммуномодулирующего, противоаллергического и противовоспалительного действия полученной композиции.

В примерах показаны преимущества заявляемого технического решения по сравнению с прототипом, заключающиеся в сочетании в композиции продуктов жизнедеятельности бактерий, обладающих взаимодополняющим антибактериальным, иммуномодулирующим, противоаллергическим и противовоспалительным действием.