6-ОКСИМЫ 16А,17А-ЦИКЛОГЕКСАНОПРЕГНЕНОВ, ОБЛАДАЮЩИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К ОПУХОЛЕВЫМ КЛЕТКАМ ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к области химии природных и физиологически активных веществ, а именно к области стероидных гормонов, конкретно к новым 16α,17α-циклогексанопрегненам, а именно к 6-оксимам 16α,17α- циклогексанопрегненов, содержащих оксииминогрупировку в 6-положении стероидного ядра, которые обладают цитотоксической активностью и могут найти применение в медицине для лечения злокачественных опухолей.

Известно, что выделенные в последние годы из морских организмов стероиды, так же как и синтезированные стероиды, содержащие оксиимино-группировки в различных положениях стероидного скелета, проявляют в зависимости от особенностей структуры и типа стероида широкий спектр биологического действия, включающий цитотоксическую активность [J.-G. Cuia, L. Fana, Li-L. Huanga, H.-Li Liub, A.-M. Zhoub . Synthesis and evaluation of some steroidal oximes as cytotoxic agents: Structure/activity studies (I). Steroids, 2009, 74, 62-72; J. Cuia, L. Fana, Y. Huanga, Yi Xinb, A. Zhoub. Synthesis and evaluation of some steroidal oximes as cytotoxic agents: Structure/activity studies (II). Steroids, 2009, 74, 989-95].

Синтезированные в 1959 г. авторами BABCOCK JOHN C. & ALLAN CAMPBELL J. (Steroidal 11-oximes and a process for their production , US 3064013 (A), 1962-11-13) 11-оксимы не нашли применения в медицине.

Современной терапии гормонозависимых опухолей нужны препараты, останавливающие неконтролируемую пролиферацию (рост) раковых клеток. Наряду с различными цитостатическими препаратами для этой цели широко используются прогестины и антипрогестины - модуляторы рецептора прогестерона (РП). Среди них перспективную группу представляют прегна-D′-пентараны - производные прогестерона с дополнительным карбоциклом D′ в 16α,17α-положениях стероидного скелета, обладающие прогестагенной и антипрогестагенной активностями in vivo и пригодные для перорального применения. В литературе описаны биологически активные прегна-D′₆-пентараны [А.В. Камерницкий, И.С. Левина. Прегна-D'-пентараны. Прогестины и антипрогестины. Биоорган. химия, 2005, Т.31, С.115 и 227]. Но среди этих описанных стероидов неизвестны пентараны, содержащие совместно дополнительный шестичленный карбоцикл D′ в 16α,17α-положениях стероидного скелета и оксииминогруппировку в положении 6 стероидного ядра.

Задачей настоящего изобретения является создание новых стероидов, содержащих оксииминогруппировку в положении 6 стероидного ядра и шестичленное кольцо D′ в 16α,17α-положениях стероидного скелета, обладающих цитотоксической активностью.

Поставленная задача достигается новыми 6-гидроксимино-16α,17α-циклогексанопрегненами общей формулы I

где X + Y образуют вместе O или X = H, Y = OH; R = H или CH₃

Предложенные соединения формулы 1 обладают цитотоксической активностью, т.е. способны ингибировать рост раковых клеток.

Предложенные соединения формулы 1 получают путем раскрытия окисного цикла в 3β-ацетокси-16α,17α-циклогексано-5α,6α-эпоксипрегнан-20-оне (2) [А.А. Ахрем, А.В. Камерницкий, И.С. Левина, Л.Е. Куликова. Синтез ∆⁶-6-замещенных циклогексано[1',2';16α,17α]прогестеронов. Изв. АН. Сер.хим., 444, (1978)] действием 65%-ной хлорной кислоты в тетрагидрофуране и образующийся при этом 3β-ацетокси-5α,6β-дигидрокси-16α,17α-циклогексанопрегнан-20-он (3) окисляют реактивом Джонса (CrO₃-H₂SO₄-H₂O) в ацетоне с образованием 3β-ацетокси-5α-гидрокси-16α,17α-циклогексанопрегнан-6,20-диона (4), который подвергают взаимодействию с хлористым тионилом в пиридине с последующей обработкой и гидролизу полученного при этом 3-ацетата 16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-6,20-диона(5) водным раствором щелочи в метаноле с образованием 3β-гидрокси-16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-6,20-диона (6) и последующим его взаимодействием с солянокислым гидроксиламином с образованием 6(E)-гидроксиимино-16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-3β-ол-20-она 1a либо с солянокислым O-метилгидроксиламином с образованием 6(E)-метоксииимино-16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-3β-ол-20-она 1b. После окисления последних с помощью пиридинийдихромата (PDC) в пиридине получены соответствующие 3-кетоны 6(E)-гидроксиимино-16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-3,20-диона 1c и 6(E)-метоксиимино-16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-3,20-диона 1d по приведенной ниже схеме:

a) HClO₄/THF, 20°C; b) CrO₃-H₂SO₄-H₂О/ацетон, 5 -10°C; c) SOCl₂/Py, °C; d) KOH/MeOH ; e) NH₂OH·HCl или NH₂OMe·HCl, Py, EtOH, RT; f) PDC, Py, RT.

Структуры всех полученных соединений следуют из данных физико-химического анализа. E-Конфигурации 6-оксимам 1a - 1d были приписаны на основании характерного сигнала экваториального протона при С(7) в виде дублета с δ 3,33 м.д. (J= 14,0 и 4,0 Гц).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. A. К раствору 5,0 г (11,7 ммоль) 3β-ацетокси-16α,17α-циклогексано-5α,6α-эпоксипрегнан-20-она (2) в 170 мл ТГФ прибавили при перемешивании 0.25 мл 65%-ной HClO₄ и выдержали при 20°C 30 мин. Реакционную смесь нейтрализовали 5%-ным водным раствором NaHCO₃, ТГФ удалили в вакууме и остаток растворили в 100 мл CHCl₃. После обычной обработки получено 4.98 г (колич.) 3β-ацетокси-5α,6β-дигидрокси-16α,17α-циклогексанопрегнан-20-она (3). Аналитический образец имеет т.пл. 272-274 °C (из смеси ацетон-гексан). Спектр ЯМР ¹H (δ, м.д.): 0,70; 1,19; 2,03; 2;14 (все с, по 3H, С(18)Ме, С(19)Ме, С(3)OAc, С(21)Ме), 2,98 (м, 1H, С(16)H), 5,16 (м, 1H, С(3)H). Масс-спектр, m/z (I_отн (%)): 446 (4) [M]+; 368 (5) [M-AcOH-H₂O]+; 307 (32) [M-- AcOH -H₂O- Ac]+.

B. Диол 3 (4,90 г, 11 ммоль) в 150 мл ацетона окисляли 5 мл реактива Джонса (получен из 26,72 г CrO₃, 23 мл конц. H₂SO₄ и H₂O до 100 мл) при 10°C. Реакционную смесь вылили в воду и экстрагировали CHCl₃ (2×50 мл). Остаток, полученный после обычной обработки, хроматографировали. Градиентное элюирование смесью ацетон-петр.эфир (8:92→12:88) дало 3,27 г (67%) 3β-ацетокси-5α-гидрокси-16α,17α-циклогексанопрегнан-6,20-диона (4) с т.пл. 248-250 °C (из смеси ацетон-гексан). Спектр ЯМР ¹H (δ, м.д.): 0,66; 0,82; 2,01; 2,14 (все с, по 3H, С(18)Ме, С(19)Ме, С(3)OAc, С(21)Ме), 2,80 (т, 1H, С(7)H, J=15 Гц))H 2.98 (м, 1H, С(16)H), 5,05 (м,1H, С(3)H). Масс-спектр, m/z (I_отн (%)): 444 (12) [M]+; 384 (9) [M-AcOH ]+; 366 (12) [M-- AcOH -H₂O]+, 323 (73) [M-- AcOH -H₂O- Ac]+.

C. К раствору 0,75 г (1,69 ммоль) 3β-ацетокси-5α-гидрокси-16α,17α-циклогексанопрегнан-6,20-диона (4) в 9 мл абс.Py прибавили 0,3 мл (4,1 ммоль) SOCl₂ при 0°C и смесь перемешивали при этой температуре 1 ч. Затем реакционную смесь вылили в 100 мл воды и экстрагировали EtOAc (3×35 мл). Объединенные органические экстракты промыли 25 мл 10%-ной HCl и насыщенным водным раствором NaCl. Остаток после обычной обработки перекристаллизовали из MeOH. Получено 0.5 г (69%) 3β-ацетокси-16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-6,20-диона (5), т.пл. 184-6 °C. Спектр ЯМР ¹H (δ, м.д.): 0,70; 1,02; 2,07; 2,14 (все с, по 3H, С(18)Ме, С(19)Ме, С(3)OAc, С(21)Ме), 2,98 (м, 1H, С(16)H), 5,32 (м,1H, С(3)H), 6,08 (уш.с., 1H, С(4)H).

D. Суспензию 0,48 г полученного соединения и 1 мл 1М водного раствора KOH в 25 мл MeOH перемешивали 45 мин при 20°C, после чего вылили в 100 мл лед.воды, выпавший порошок отфильтровали, промыли водой и высушили на воздухе. Получено 0,43 г 3β-гидрокси-16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-6,20-диона (6). Аналитический образец имеет т.пл. 199-202 °C (из смеси ацетон-гексан). Спектр ЯМР ¹H (δ, м.д.): 0,70; 1,02; 2,14 (все с, по 3H, С(18)Ме, С(19)Ме, С(21)Ме), 2.52 (д.д., 1 H, С(7)H_e, ²J=13 Гц, ³J‹ 2 Гц) 2,98 (м, 1H, С(16)H), 4,23 (м,1H, С(3)H), 6,15 (уш.с., 1H, С(4)H). Масс-спектр, m/z (I_отн (%)): 484 (8) [M]+; 341 (9) [M-- Ac]+.

E. К раствору 0,38 г (1 ммоль) 3β-гидрокси-16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-6,20-диона (6) в 15 мл EtOH добавили 0,084 г NH₂OH.HCl и 0,1 мл Py и реакционную смесь выдержали сутки при 20°C, после чего вылили в 100 мл лед.воды, выпавший осадок отфильтровали, промыли на фильтре водой и сушили на воздухе. Получено 0,36 г (89%) 6(E)-гидроксиимино-16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-3β-ол-20-она 1a с т.пл. 157-160°C (из смеси ацетон-гексан). Спектр ЯМР ¹H (δ, м.д.): 0,70; 0,99; 2,12 (все с, по 3H, С(18)Ме, С(19)Ме, С(21)Ме), 3,00 (м, 1H, С(16)H), 3,33 м.д. (д.д., 1 H, С(7)H), 4,15 (м, 1H, С(3)H), 5,80 (уш.с., 1H, С(4)H). Масс-спектр, m/z (I_отн (%)): 399 (7) [M]+.

Пример 2. Аналогично примеру 1 из 0,14 г 3β-гидрокси-16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-6,20-диона (6) и 0,047 г MeONH₂·HCl получено 0,12 г 6(E)-метоксиимино-16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-3β-ол-20-она 1b, т.пл. 223-225 °C(из смеси ацетон-гексан). Спектр ЯМР ¹H (δ, м.д.): 0,70; 1,01; 2,12 (все с, по 3H, С(18)Ме, С(19)Ме, С(21)Ме), 3,00 (м, 1H, С(16)H), 3.38 м.д. (д.д., 1 H, С(7)H), 3,90 (с, 3 H, OMe); 4,18 (м, 1H, С(3)H), 5,85 (уш.с., 1H, С(4)H). Масс-спектр, m/z (I_отн (%)): 413 (11) [M]+.

Пример 3. К раствору 0,36 г (0,9 ммоль) стероида 1a в 5 мл Py добавили 0,37 г PDC и реакционную смесь перемешивали 1 ч при 20°C. Затем смесь разбавили 30 мл EtOAc и профильтровали. Фильтрат промыли 10%-ной HCl, 5%-ным водным раствором NaHCO₃ и насыщенным водным раствором NaCl. Остаток после обычной обработки хроматографировали на колонке, элюирование смесью петр.эфир-ацетон (9:1). Получено 0,18 г 6(E)- гидроксиимино-16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-3,20-диона 1c с т.пл. 245-247 °C (из смеси ацетон-гексан). Спектр ЯМР ¹H (δ, м.д.): 0,74; 1,15; 2,12 (все с, по 3H, С(18)Ме, С(19)Ме, С(21)Ме), 3,00 (м, 1H, С(16)H); 3,45 м.д. (д.д., 1 H, С(7)H); 6,45 (с, 1H, С(4)H); 9,68 (с, 1 H, NOH). Масс-спектр, m/z (I_отн (%)): 397 (9) [M]+.

Пример 4. Аналогично примеру 3 из 0,11 г 6(E)-метоксииимино-16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-3β-ол-20-она 1b получено 0,9 г 6(E)-метоксиимино-16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-3,20-диона 1d, т.пл. 209-211°C (из смеси ацетон-гексан). Спектр ЯМР ¹H (δ, м.д.): 0,72; 1,15; 2,12 (все с, по 3H, С(18)Ме, С(19)Ме, С(21)Ме), 3,00 (м, 1H, С(16)H); 3,40 м.д. (д.д., 1 H, С(7)H); 6,20 (с, 1H, С(4)H). Масс-спектр, m/z (I_отн (%)):411(16) [M]+.

Пример 5. Цитостатическая активность заявляемых соединений 1a - 1d изучена на культуре HeLa (рак шейки матки человека). Для оценки их влияния на жизнеспособность клеток культуры HeLa использовался МТТ-тест [Nogueira D.R., Mitjans M., Infante M.R., Vinardell M.P. Com Int. J. Pharm. 2011. V. 420. № 1. Р.51-58]. Клетки инкубировали в течение 7 дней совместно с эстрадиолом в концентрации 10^-8 моль/л и исследуемыми соединениями в концентрации 10^-5-10^-7 моль/л. В эксперименте использовалось два контроля: первый - клетки, стимулированные эстрадиолом 10^-8 (эстрадиол-стимулированный контроль - ЭСК) и второй - клетки, инкубированные без эстрогенной стимуляции (К). Результаты МТТ-теста относительно первого контроля (ЭСК) представлены в таблице 1, второго контроля (К) - в таблице 2.

В качестве препарата сравнения использован синтетический прогестин медроксипрогестерона ацетат (МПА)

Таблица 1. Влияние соединений 1a - 1d на жизнеспособность клеток культуры HeLa, выраженное в процентах по отношению к эстрадиолстимулированному контролю (ЭСК).

Концентрация М К1044 1a К1045 1b К1046 1c К1047 1d 10-5 67,0 10,7* 64,8 8,9* 66,5 9,3* 50,6 10,5* 10-6 81,3 4,6* 81,3 5,3* 67,9 4,5* 68,2 8,0* 10-7 69,4 7,5* 57,1 8,1* 84,0 6,0* 70,7 9,0*

Примечание : * - Достоверные отличия от ЭСК при р<0,05.

Жизнеспособность в ЭСК составила 100±10,5%

Цифры в колонках означают процент выживаемости раковых клеток в процентах к контролю.

Таблица 2. Влияние соединений 1a - 1d на жизнеспособность клеток культуры HeLa, выраженное в процентах по отношению к контролю (К).

Концентрация, М К1044 1a К1045 1b К1046 1c К1047 1d МПА 10-5 82,1 7,9 * 79,4 10,6 * 81,6 8,4 * 62,0 12,6 * 63,2±12,5* 10-6 99,6 5,5 99,6 6,9 83,2 6,09 * 83,6 6,4 * 75,1±16,9 10-7 85,0 5,0 * 69,9 9,7 * 102,9 7,2 86,7 10,8 84,3±19,8

Примечание : * - Достоверные отличия от Контроля при р<0,05.

Жизнеспособность в Контроле составила 100±9,5%

Из таблицы 1 следует, что все соединения в исследуемых концентрациях подавляли эстрадиолстимулированную пролиферацию раковых клеток, при этом наибольшую ингибирующую активность проявил оксим 1d.

Из таблицы 2 следует, что все соединения в исследуемых концентрациях подавляли нестимулированную (базальную) пролиферацию раковых клеток, превосходя препарат сравнения МПА в концентрациях 10^-6-10^-7М , однако в меньшей степени, чем эстрогенстимулированную пролиферацию. Наибольшую ингибирующую активность в концентрации 10^-5М проявил оксим 1d.

Пример 6. Заявляемые соединения показали высокое сродство к рецепторам прогестерона (Р4). Методом радиолигандного анализа [Schneider М. [1982] была изучена способность исследуемых соединений вытеснять меченый тритием прогестерон (³Н-Р4*) и связываться с рецепторами прогестерона. Результаты исследования выражены в процентах по отношению к контролю- связыванию ³Н-Р4* в отсутствие исследуемых соединений. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3. Связывание ³Н-Р4 с рецепторами прогестерона в цитозоле матки крыс в присутствии избытка заявляемых соединений, МПА и прогестерона.

Соединения К1044 К1045 К1046 К1047 МПА Р4 % связывания Р4* 33,8 4,2* 21,5 3,6* 25,6 3,8* 22,9 3,5* 53,9 13,6* 19,6 3,1*

* - Достоверные отличия от контроля (³Н-Р4) при р<0,05

Из представленных данных видно, что все исследуемые прегна-D'-пентараны способны связываться с рецепторами прогестерона. Процент связывания ³Н-Р4* варьирует от 19,6 до 53,9% . Наименьшее связывание ³Н-Р4* наблюдалось в присутствии чистого прогестрона-19,6%, наибольшее для МПА - 53,9±13,6*%. Исследуемые прегна-D'-пентараны более эффективно вытесняют ³Н-Р4* (на 78,5-77,1%), чем препарат сравнения МПА (на 46,1%).

Заявляемое изобретение не очевидно для специалистов, работающих в области химиотерапии опухолей.

В связи с большой социально-экономической значимостью проблемы лечения злокачественного роста создание новых соединений представляет собой актуальную проблему как экспериментальной, так и клинической медицины.

Заявляемые соединения - 6-Оксимы 16α,17α-циклогексанопрегненов - пригодны для перорального применения, обладают высоким сродством к рецепторам прогестерона и показали высокую цитостатическую активность в отношении клеток рака шейки матки человека, что очень ценно и в клиническом, и в социальном, и в экономическом отношениях.