Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АФЛАТОКСИНА В1 МЕТОДОМ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к анодному инверсионно-вольтамперометрическому способу определения микотоксина афлатоксина B1, который представляет собой (6aR-cis)(2,3,6a,9a)тетрагидро-4-метоксициклопент a[c] фуро [2,3-h][1]бензопиран-1,11-дио-на. Данное изобретение может быть применено в анализе пищевых продуктов и продовольственном сырье и использовано в пищевой, медицинской, фармакологической промышленности и сельском хозяйстве.

Структурная формула афлатоксина B1

Афлатокосин B1 (Aspergillus flavus, A.parasiticus) относится к высокотоксичным микотоксинам, которые в свою очередь относятся к одной из доминирующих в последние годы групп биогенных ядов, загрязняющих корма и продукты питания. К настоящему времени накоплен значительный фактический материал по токсическим, канцерогенным, мутагенным, тератогенным и другим проявлениям биологической активности афлатоксина B1. Афлатоксин B1 является гепатотропным ядом и поражает в первую очередь печень. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют, что афлатоксины вызывают генные мутации, оказывают тератогенное действие, являются сильными иммунодепрессантами. По своим свойствам афлатоксин B1 относится к группе фурокумаринов, содержит в молекуле лактоновую, карбонильную, метоксильную группы, бензольное кольцо и изолированную двойную связь. Афлатоксин B1 в результате химической модификации превращается в эпоксид, который является канцерогеном и вызывает развитие рака печени. Учитывая высокую токсичность афлатоксина B1, в Российской Федерации введены довольно жесткие нормативы по МДУ содержания его в кормах: 0,01 мг/дм³ - для собак, кошек и декоративных птиц. ПДК афлатоксина B1 в пищевых продуктах 0,005 мг/дм. В связи с высокой токсичностью афлатоксина B1 и малыми МДУ к методу определения его в кормах предъявляются особые требования по чувствительности, селективности и воспроизводимости.

В прототипе описан способ определения афлатоксина B1 методом дифференциальной полярографии [Gajan Raymond J., Nesheim Hanley, Campbell A.D. Идентификация афлатоксинов методом осциллографической полярографии // Note on identification of anatoxins by oscillographic polarography." J. Assoc. Offic. Agric. Chemist", 1964, 47 N1. - С.27-28]. Авторами для совместного определения афлатоксина B1 и G1 был предложен в качестве фонового электролита 0,1 M по (CH₃)₄NBr и по LiCl, содержащего 40% CH₃OH. Образец, содержащий афлатоксины B1 и G1, растворяли в 2 мл CH₃OH, прибавляли 3 мл фона и полярографировали от -1,0 до -1,5 B при 25±1°C. Потенциалы пиков полуволны были соответственно E_1/2=(-1,33±0,02)B и E_1/2=(-1,25±0,02) В относительно AgCl - анода.

В аналогичных работах описано определение афлатоксина B1 электрохимическим методом с помощью иммуносенсора электрохимического импеданса на стеклоуглеродном электроде, модифицированного силикагель-ионной жидкостью с образованием биопленки в пыльце пчел [Li Zaijun, Wang Zhongyun, Sun Xiulan, Fang Yinjun, Chen Peipei /A sensitive and highly stable electrochemical impedance immunosensor based on the formation of silica gel-ionic liquid biocompatible film on the glassy carbon electrode for the determination of aflatoxin B[1] in bee pollen/ Чувствительный и высоко устойчивый иммуносенсор электрохимического импеданса на основе образования биопленок силикагель-ионная жидкость на стеклоуглеродном электроде для определения афлатоксина B[1] в пыльце пчел // Talanta. - 2010. - T.80; №5. - с.1632-1637]. В данной работе авторами для увеличения чувствительности сенсора была использована в качестве модификатора ионная жидкость гексафторфосфат 1-амил-2,3-диметилимидазолия. Сенсор дает линейный отклик в диапазоне 0,1-10 нг/мл афлатоксина B1, предел обнаружения 0,01 нг/мл. По сравнению с классическим сенсором на основе силикагеля новый сенсор чувствительнее в 2 раза, устойчивее в 190 раз, определению не мешают афлатоксины B2, G1, G2, M1. Мера правильности 96,0-102,5%. В предлагаемом способе определение афлатоксина B1 осложнено использованием модифицирующего агента вследствие чего увеличивается суммарное время анализа.

В работе [Горячева И.Ю., Русанова Т.Ю., Бурмистров Н.А., Де Саегер С. Иммунохимические методы определения микотоксинов // Журн. аналит. химии. - 2009. - Т.64, №8. - С.788-806] методами дифференциальной импульсной вольтамперометрии описано определение афлатоксина B1 на графитовых печатных электродах, на поверхность которых иммобилизировали иммунореагенты. Авторами работы в качестве метки, обеспечивающей возникновение аналитического сигнала, использовали ферменты. Субстратом служил 1-нафтилфосфат, окисление которого в 1-нафтол катализирует щелочную фосфатазу. Возникающий ток регистрировали методами дифференциальной импульсной вольтамперометрии. В предложенной работе графитовый печатный электрод требует обновления и нанесения фермента, что ограничивает применение данного метода с точки зрения трудоемкости и использования токсичных химических реагентов.

Задачей заявленного изобретения является применение электродов из нетоксичного материала и определение афлатоксина B1 методом дифференциальной вольтамперометрии в присутствии растворенного кислорода без дополнительного введения в фоновый электролит восстановителя, а также расширение диапазона определяемых концентраций и разработки экспресс-технологии оценки афлатоксина B1 в течение 30-40 мин.

Поставленная задача достигается тем, что способ количественного определения афлатоксина B1 включает перевод афлатоксина B1 из пробы в раствор и вольтамперометрическое определение с использованием индикаторного стеклоуглеродного электрода. При этом накопление афлатоксина B1 в перемешиваемом растворе проводят в течение 30 с при потенциале электролиза E_э=(0,0±0,05)B (табл.1) относительного насыщенного хлоридсеребряного электрода на фоне 0,1 M хлората аммония (NH₄ClO₄) с последующей регистрацией анодных пиков в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм при скорости развертки потенциала 30 мВ/с и концентрацию афлатоксина B1 определяют по высоте пика в диапазоне потенциалов E_п=(0,625±0,045)B методом добавок аттестованных смесей.

В предлагаемом способе установлена способность афлатоксина B1 окисляться на углеродных электродах различных типов. Для выбора индикаторного электрода использовали: графитовый электрод, пропитанный полиэтиленом с парафином в вакууме, стеклоуглеродный и углеситаловый электроды. Использование таких электродов обусловлено их высокой химической и электрохимической устойчивостью, отсутствием токсической ртути, широкой областью рабочих потенциалов, а также простотой механического обновления поверхности и требованиями техники безопасности. Использование в аналогах модифицированного стеклоуглеродного электрода/графитового печатного электрода с нанесением фермента на рабочую поверхность требует дополнительных химических реактивов и постоянного обновления поверхности электрода перед каждым анализом, что неудобно при проведении серийных анализов. Способность к электроокислению афлатоксина B1 зависит от материала электрода и состояния его поверхности. Наибольшую величину аналитического сигнала, наименьшее значение остаточного тока и лучшую воспроизводимость сигналов на вольтамперограмме наблюдали на стеклоуглеродном электроде, который и был выбран в качестве рабочего.

Абсолютной новизной является экспериментально установленный фоновый электролит - 0,1 M раствора хлората аммония (NH₄ClO₄) с pH 2÷3, который позволяет с хорошей воспроизводимостью проводить ИВ-измерения в присутствии растворенного кислорода без дополнительного введения восстановителя (в прототипе в качестве фонового электролита 0,1 M по (CH₃)₄NBr и по LiCl, содержащего 40% CH₃OH).

Другим отличительным признаком является использование трехэлектродной ячейки: индикаторный электрод - стеклоуглеродный; вспомогательный и сравнения - хлоридсеребряные электроды. Предварительный электролиз при потенциале (0,0±0,05) В с последующим анодным растворением осадка позволяет регистрировать вольтамперограммы с четко выраженным максимумом при значении потенциала (0,625±0,045), прототипе E_1/2=(-1,33±0,02)B для афлатоксина B1.

Установленные условия проведения электродного процесса позволили количественно определять афлатоксин B1 на основе реакции электроокисления. Предлагаемый вольтамперометрический способ позволил сократить количество используемых реактивов, в частности модифицирующих агентов для индикаторных электродов, а также проводить измерения в присутствии растворенного кислорода и существенно улучшить метрологические характеристики анализа афлатоксина B1. Диапазон определяемых концентраций 0,8^·10^-5÷2,0·10⁵ мг/дм³. Относительное стандартное отклонение (Sr) не более 20%.

Измерения проводили на компьютеризованных вольтамперометрических анализаторах СТА (ООО «ИТМ», г. Томск). На Фиг.1 представлено адсорбционное инверсионное вольтамперметрическое определение афлатоксина B1 на стеклоуглеродном электроде. Концентрирование 30 сек при 0,0 B (метод добавок): 1-10 мл 0,1 M NH₄ClO₄; 2-10 мл 0,1 M NH₄ClO₄+0,02 мл афлатоксина B1; 3-10 мл 0,1 M NH₄ClO₄+0,04 мл афлатоксина B1.

Пример 1. Определение содержания афлатоксина B1 на уровне 0,002 мг/дм³.

В кварцевый стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл 0,1 M раствора хлорида аммония. Стаканчик с раствором помещают в электролитическую ячейку. Опускают в раствор электроды (индикаторный - стеклоуглеродный, вспомогательный и сравнения - хлоридсеребряные). Проводят электронакопление при потенциале (0,0±0,05) B в течение 30 с при перемешивании раствора. По окончании электролиза начинают регистрацию вольтамперограммы в диапазоне потенциалов от 0,0 до +1,1 B (Фиг.1, график 1). Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона. Затем добавляют 0,02 мл стандартного раствора афлатоксина B1 концентрации 1 мг/дм³ и проводят электронакопление при потенциале (0,0±0,05) B в течение 30 с при перемешивании раствора с последующей регистрацией вольтамперограммы в диапазоне (0,625±0,045)B (отн. ХСЭ) при чувствительности прибора (0,5÷1)·10^-9 A/мм (Фиг.1,график 2). Проводят разметку вольтамперограмм, средняя высота анодного пика составляет 0,006 мкА. Далее в стаканчик с анализируемым раствором с помощью дозатора вносят добавку аттестованной смеси афлатоксина B1 в объеме 0,02 мл концентрацией 1 мг/дм³. Электронакопление и регистрацию аналитического сигнала проводят в тех же условиях (Фиг.1, график 3). Пик регистрируют в диапазоне потенциалов от (0,625±0,045)B (отн. ХСЭ), средняя высота пика составляет 0,012 мкА.

Пример 2. Определение содержания афлатоксина B1 в пробе «отруби диетические пшеничные».

В мерную колбу вместимостью 50 мл вносят навеску анализируемой пробы (0,125±0,0001) г и добавляют 25 мл 96% этанола и тщательно перемешивают. Затем содержимое колбы экстрагируют в течение 30-40 мин с периодическим помешиванием и отфильтровывают полученный раствор через бумажный фильтр. Полученный фильтрат является подготовленной пробой для вольтамперометрического измерения. Затем 0,02 мл полученного фильтрата вносят в кварцевый стаканчик с фоновым раствором. Электронакопление и регистрацию аналитического сигнала проводят в тех же условиях. Анодный пик афлатоксина B1 фиксируют в диапазоне (0,625÷0,045)В на стеклоуглеродном электроде при чувствительности прибора (1÷5) 10^-8 A/мм в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм. Массовую концентрацию афлатоксина B1 в пробе оценивают методом добавок аттестованных смесей, измеряя высоту анодных пиков по формуле (1):

,

где X₁ - содержание афлатоксина B1 в анализируемой пробе, мг/дм³;

C_д - концентрация аттестованной смеси /АС/ афлатоксина B1, из которой делается добавка к анализируемой пробе, мг/дм³;

V_д - объем добавки AC афлатоксина B1, мл;

I₁ - величина максимального тока компонента в анализируемой пробе, мкА;

I₂ - величина максимального тока компонента в пробе с добавкой AC, мкА;

V_ал - объем навески пробы, взятой для анализа, мл.

Время анализа одной пробы с учетом времени пробоподготовки занимает около 40 минут.

Таким образом, впервые установлена способность количественного химического анализа афлатоксина B1 по пикам электроокисления его на стеклоуглеродном электроде (в аналоге количественное определение афлатоксина B1 проводят на графитовом печатном электроде или модифицированном стеклоуглеродном электроде).

Предложенный способ прост, не требует большого количества реактивов и трудозатрат и может быть приемлем в любой химической лаборатории, имеющей полярограф, особенно в настоящее время, когда налажен выпуск отечественной и зарубежной электроаппаратуры с контрольным управлением и обработкой данных (анализаторы типа СТА, ТА и др.). Предложенный способ может быть использован в медицине, фармакокинетических и фармацевтических исследованиях, сельскохозяйственной и пищевой промышленности, для разработки методик анализа афлатоксина B1 и родственных ему соединений в сложных многокомпонентных биосистемах (кровь, моча). Определение концентраций в диапазоне 0,8·10^-5÷2,0·10⁵ мг/дм³ важно для пищевой промышленности, так как по содержанию афлатоксина B1 определяют качество продукции.