Результат интеллектуальной деятельности: БИОЛОГИЧЕСКИЙ АКТИВНЫЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ ОРГАНОГЕНЕЗА И ПРОДУКТ СЕКРЕЦИИ КЛЕТОК, СОДЕРЖАЩИХСЯ В ЭТОМ КОМПЛЕКСЕ

Изобретение относится к медицине и представляет собой комплекс для органогенеза и продукт секреции клеток, содержащихся в этом комплексе.

Известен биологический активный комплекс для органогенеза, состоящий из клеток человека и коллагеновой трехмерной многокомпонентной структуры, содержащей гликозаминогликаны и липопротеиды, по биохимическому составу и количественному содержанию близкие к биохимическому составу ткани, для регенерации которых он используется (патент РФ 2280459).

Однако подобный комплекс имеет ряд существенных недостатков, а именно объемная трехмерная структура, из которой состоит комплекс, не имеет выраженной трехмерной структуры, представляя собой просто неструктурированную трехмерную структуру с хаотично распределенными внутри него и на поверхности клетками. Такая структура не способна удовлетворительно обеспечивать органогенез вследствие отсутствия трехмерной структуры, подобной экстрацеллюлярному матриксу ткани, которую предполагается регенерировать. Кроме того, клетки, помещенные в фактически чужеродном субстрате из хаотически распределенных пептидов, способны образовывать участки фиброза с выделением медиаторов воспаления в область имплантации подобного комплекса с последующим некротическим отторжением комплекса.

Задачей изобретения является создание биологически активного комплекса для органогенеза, не вызывающего фиброзных и некротических изменений в тканях и органах реципиента.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является снижение периода реабилитации из-за отсутствия тканевого, клеточного и иммунного ответа реципиента и, соответственно, фиброзных изменений в области имплантации комплекса.

Технический результат достигается тем, что биологический активный комплекс для органогенеза, состоящий из клеток человека и коллагеновой трехмерной многокомпонентной структуры, содержащей гликозаминогликаны и липопротеиды, по биохимическому составу и количественному содержанию близкие к биохимическому составу ткани, для регенерации которых он используется, согласно изобретению трехмерная многокомпонентная структура организована путем трехмерного послойного реплицирования структуры нативной ткани человека или животного, для регенерации которых он используется, для чего берут биопсию ткани реципиента, а в случае отсутствия участка ткани с необходимостью его замещения при помощи конфокальной микроскопии, сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии определяют аминокислотный состав белковой составляющей, при помощи белкового анализатора идентифицируют надмолекулярную структуру, методом атомно-абсорбционного анализа определяют состав гликозаминогликанов и липидов, далее при помощи автосинтезатора белков синтезируют все основные белковые компоненты комплекса, подбирают качественно и количественно гликозаминогликаны и липиды в соотношениях, максимально близких к полученным при анализе биопсии, затем послойно при толщине слоя не более 1 мкм все компоненты наносят на полимерную подложку, образуя за счет агрегации структуру, подобную собственной ткани реципиента, на каждый слой помещают стволовые аллогенные или аутологичные клетки, закрываемые последующим слоем белков, липидов и гликозаминогликанов, полученный комплекс инкубируют при 37˚C в течение 3 суток и пересаживают, закрывая дефект ткани реципиента.

Биологический активный комплекс для органогенеза не вызывает фиброзных и некротических изменений в тканях и органах реципиента за счет подобности структуры комплекса структурам тканей реципиента. Подобие структуры нивелирует клеточный ответ реципиента, поскольку биохимический состав и структура комплекса, имплантированного пациенту, не воспринимается как чужеродная ткань и, соответственно, не вызывает иммунный и клеточный ответ. Отсутствие ответа приводит к отсутствию воспаления и, как следствие, фиброза и отторжения.

Продукт секреции клеток состоит из полипептидов, олигопептидов поли- и олигосахаридов, цитокинов, являющихся типичными для фенотипа клеток, полученного при их дифференцировке в предложенном комплексе для органогенеза.

Клетки при помещении в окружение трехмерной послойно-реплицированной коллагеновой структуры приобретают фенотип клеток, находящихся в подобной структуре в нормально функционирующем организме, причем особенности фенотипа клетки четко определяются структурой и составом белково-липидно-полиаминосахаридного окружения.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Первоначально берется биопсия ткани реципиента, а в случае отсутствия участка ткани с необходимостью его замещения определяется аминокислотный состав белковой составляющей, при помощи конфокальной микроскопии, сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии идентифицируется надмолекулярная структура (укладка белковых волокон), при помощи белкового анализатора, методик атомно-абсорбционного анализа определяется состав гликозаминогликанов и липидов. При помощи автосинтезатора белков синтезируют все основные белковые компоненты комплекса согласно изобретению, подбирают качественно и количественно гликозаминогликаны и липиды в соотношениях, максимально близких к полученным при анализе биопсии, затем послойно (толщина слоя не более 1 мкм) все компоненты наносятся на полимерную подложку, образуя за счет агрегации структуру, подобную собственной ткани реципиента. На каждый слой помещаются стволовые аллогенные или аутологичные клетки, закрываемые последующим слоем белков, липидов и гликозаминогликанов. Полученный комплекс инкубируют при 37˚C в течение 3 суток и пересаживают, закрывая дефект ткани реципиента.

В случае полного отсутствия ткани соотношение компонентов и структуру формируют по принципу максимальной близости уже имеющихся результатов анализов состава, наиболее близких по возрасту, полу, расе и т.д. пациентов.

Клетки, помещенные в комплекс для органогенеза, продуцируют вещества, характерные для фенотипа клеток, находящихся в состоянии клеточной пролиферации, поскольку помещаются в область дефекта собственной ткани реципиента, получают соответствующие сигналы от собственных рецепторов. Таким образом, продукт их секреции сам обладает пролиферативным эффектом, что, например, характерно для типичной фибробластической реакции, когда фибробласты сами себя стимулируют к митозу по принципу цепной реакции, выделяя как раз такой продукт. Причем структура и состав комплекса являются определяющим для состава продукта секреции.

Пример 1

У добровольца И., 42 года, пол мужской, был выявлен тонкий биотип десны, выраженная рецессия десны между 3 и 4, 4 и 5 зубами слева. При клиническом и рентгенологическом исследовании был поставлен диагноз рецессии десны II класса по Миллеру, предрасположенность к генерализованным рецессиям. После полной санации полости рта была произведена трансплантация предложенного комплекса, содержащего аутологичные клетки для органогенеза пародонта, который вводили в собственно слизистую оболочку, прилежащую к шейке зуба и в межзубные десневые сосочки на глубину 1 мм. Начиная с 4-х недель, наблюдалось появление положительной клинической динамики, а к 4-му месяцу визуально отмечалось утолщение прикрепленной слизистой оболочки десны в местах инъекций, плотное сращение слизистой оболочки десны с твердыми тканями зуба, уменьшение размеров рецессии десны.

Пример 2

У добровольца П. 53 лет, пол мужской, был выявлен тонкий биотип десны, выраженная рецессия десны между 2 и 3, 4 и 5 зубами, при клиническом и рентгенологическом исследовании был поставлен диагноз рецессии десны II класса по Миллеру, предрасположенность к генерализованным рецессиям. После полной санации полости рта была произведена трансплантация предложенного комплекса для органогенеза пародонта, содержащего аллогенные клетки, который вводили в собственно слизистую оболочку, прилежащую к шейке зуба и в межзубные десневые сосочки на глубину 1 мм. Вторая инъекция была сделана через две недели после первой инъекции. Начиная с 4-х недель, наблюдалось появление положительной клинической динамики, а к 4-му месяцу визуально отмечалось утолщение прикрепленной слизистой оболочки десны в местах инъекций, плотное сращение слизистой оболочки десны с твердыми тканями зуба, уменьшение размеров рецессии десны.

Пример 3

У пациентки Н. 58 лет отмечались выраженные инволюционные изменения кожи в виде сниженного тонуса кожи, морщин. Данные были подтверждены методами профилометрии, эластометрии на соответствующем оборудовании для объективизации показателей кожи компании (СК Electronic, Германия). После трансплантации предложенного комплекса, содержащего аутологичные клетки в количестве 4,5 млн, через 4 недели отмечалось повышение тонуса кожи, выравнивание микрорельефа кожи, повышение показателей эластичности. Нарастание эффекта было отмечено через 6 и 12 месяцев исследования.

Пример 4

У пациентки Л. 38 лет отмечались инволюционные изменения кожи 2 степени, а также диспигментация. Данные были подтверждены методами профилометрии, эластометрии на соответствующем оборудовании для объективизации показателей кожи компании (СК Electronic, Германия). После трансплантации предложенного комплекса, содержащего 2 млн аллогенных клеток, через 4 недели отмечалось повышение тонуса кожи, улучшение микроциркуляции, выравнивание микрорельефа кожи, повышение показателей эластичности, отмечалось выравнивание тона кожи. Нарастание эффекта было отмечено через 6 и 12 месяцев исследования.

Пример 5

У пациентки Н. 58 лет отмечались выраженные инволюционные изменения кожи в виде сниженного тонуса кожи, морщин. Данные были подтверждены методами профилометрии, эластометрии на соответствующем оборудовании для объективизации показателей кожи компании (CK Electronic, Германия). После трансплантации предложенного комплекса, содержащего 6 млн аутологичных клеток, через 4 недели отмечалось повышение тонуса кожи, выравнивание микрорельефа кожи, повышение показателей эластичности. Нарастание эффекта было отмечено через 6 и 12 месяцев исследования.

Пример 6

У пациентки Л. 38 лет отмечались инволюционные изменения кожи 2 степени, а также диспигментация. Данные были подтверждены методами профилометрии, эластометрии на соответствующем оборудовании для объективизации показателей кожи компании (CK Electronic, Германия). После трансплантации предложенного комплекса, содержащего 1 млн аллогенных клеток, через 4 недели отмечалось повышение тонуса кожи, улучшение микроциркуляции, выравнивание микрорельефа кожи, повышение показателей эластичности, отмечалось выравнивание тона кожи. Нарастание эффекта было отмечено через 6 и 12 месяцев исследования.

Пример 7

Больной Л, 30, лет был поставлен диагноз посттромботическая болезнь. На левой голени наблюдается трофическая язва размером 3 см в диаметре и 6 мм глубиной. Язва возникла после незначительной травмы 1 год назад. Все предыдущие методы лечения - троксевазин, лазерная терапия, эластическое бинтование, ежедневные перевязки с использованием актовегина, ируксола к заживлению язвы не приводили. После очищения язвенной поверхности на нее накладывали предложенный комплекс, содержащий аллогенные клетки, 2-3 раза в неделю. Для наружной компрессии применяли эластичное бинтование. Через 3 дня гнойное отделяемое полностью исчезло, наблюдался рост грануляций, краевая эпителизация. Полная эпителизация произошла на 24 день от начала лечения заявленным способом.

Пример 8

У больной Б., 60 лет, был поставлен диагноз: декомпенсированный сахарный диабет II типа. Диабетическая ангиопатия нижних конечностей. На нижней трети голени образовалась язва, к эпителизации которой не приводила обычная местная терапия (ежедневные перевязки с ируксолом, левомеколем, пливасептом и т.п.), проводившаяся в течение 2-х недель. После обработки язвенной поверхности на рану накладывали предложенный комплекс, содержащий аутологичные клетки, 2-3 раза за неделю. На 3 сутки рана полностью очистилась, заполнена сочными грануляциями, по окружности раны - краевая эпителизация. Значительно уменьшилась болезненность раны. К 8 суткам произошло полное заживление раны.

Пример 9

Пациент Д. Диагноз: OU эпителиопатия, кератит. На комплексе согласно изобретению, состоящем из коллагена, подобного роговичному, и мезенхимальных стволовых клеток, получали продукт секреции клеток и инсталлировали в конъюнктивальную полость пациента. На пятые сутки роговичный эпителий в норме, явления кератита не наблюдали.

Пример 10

Пациент Ш. Дефект кости орбиты, имплантация деминерализованного костного импланта не показана.

На комплексе согласно изобретению, состоящем из коллагена, подобного костному у реципиента, гидроксиапатита и мезенхимальных стволовых клеток, получали продукт секреции клеток согласно изобретению и инъецировали в полость дефекта в течение месяца. По данным магниторезонансной томографии - полное замещение дефекта собственной новообразованной костной тканью наступило через месяц после начала лечения.