ГИПОАЛЛЕРГЕННАЯ ДЕРМАТОЛОГИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ

Настоящее изобретение относится к аллергии на зерновые культуры (злаки).

В рамках данного изобретения злаки включают в себя семейство Роасеае (Злаки) и псевдозлаки.

Термин «злаки» относится к семейству Злаков, спелое «зерно» (зерновку) которых используют в пищу, в особенности благодаря высокому содержанию в нем крахмала (Paris R.R., Moyse Н. Precis de matiere medicale. II Pharmacognosie speciale. Spermaphytes (continued): Angiospermes. Monocotyledones Dicotyledones. Apetales et Diapetales. 2^nd Edition. Paris: Masson, 1981, p.16). Термин «злак» также, как правило, относится к семенам таких растений.

В ботанике злаки принадлежат к семейству Роасеае или Gramineae.

Указанные злаки, как правило, представляют собой травянистые однодольные растения с полым стеблем между узлами (соломиной), несущим расположенные в два ряда листья с зачастую расщепленным и лигулосодержащим влагалищем листа. Цветки расположены во вторичных колосках и чаще всего сгруппированы в сложный колос или грозди, называемые «метелками». Цветок сведен до тычинок и завязи: два прилистника или две колосковые чешуи защищают вторичный колосок, а две нижние цветковые чешуи, одна из которых является передней, наклонной, обертывающей, часто щетинконосной, сходятся вместе с образованием цветка. Три выступающих тычинки колеблются, присоединенные тыльной стороной. Завязь имеет один плодолистик с двумя опушенными пестиками, непосредственно прилегающими к семяпочке и развивающимися каждый в отдельный плод, именуемый зерновкой; обильный эндосперм является крахмалистым.

Это семейство включает в себя приблизительно 700 родов и 12000 видов.

Большую часть злаковых трав используют для пищевых целей (это - пшеница, ячмень, рожь, овес, сорго, просо, кукуруза, рис и т.д).

Виды наиболее часто используемых злаков представлены ниже в Таблице 1.

Некоторые зерновые культуры, являющиеся представителями других ботанических семейств, похожи на злаки и называются псевдозлаками. Примеры таких видов, относящихся к злакам, но не являющихся частью семейства Роасеае, которые также используются и могут вызывать пищевую аллергию, включают виды, перечисленные ниже в Таблице 2.

Зерна злаков и псевдозлаков содержат большое количество белков: структурных белков, биологически активных белков и резервных белков. Osborne (1907) классифицировал их в соответствии с их растворимостью на:

- водорастворимые альбумины,

- глобулины, растворимые в физиологических растворах,

- проламины, растворимые в водном этаноле,

- глютелины, нерастворимые в перечисленных выше растворителях, частично растворимые в растворах мочевины или гуанидина.

Примеры:

Напротив, содержание белков в надземных частях, в частности в листьях, состоит, главным образом, из:

- мембранных белков хлоропластов (белков, часто относящихся к липидам и пигментам),

- растворимых белков хлоропласта (строма): RuBPCase.

Листья лебеды квиноа, подсолнечника, овса, ячменя и Zizania palustris, молодые побеги пшеницы, а также проростки кунжута, риса, пшеницы и кукурузы используют в косметических целях. Например, молодые зеленые побеги ячменя используют в качестве средства, замедляющего старение.

Кроме того, в известном уровне техники раскрыты:

- экстракт листьев щирицы (Amaranthus), используемый в качестве противовоспалительного лекарственного средства, в частности при лечении атопических дерматитов (патентный документ JP 2000143524),

- композиция, содержащая экстракт овсяной соломы с экстрактом иван-чая, для лечения воспалительных реакций кожи для местного применения (EP 1474159),

- косметическая композиция, защищающая против окисления с помощью масла рисовых зародышей (EP 1704898),

- косметическая композиция, включающая в себя экстракт проростков пшеницы (WO 9526183),

- косметический продукт, обладающий регенерирующим действием на кожу, содержащий экстракт стеблей подсолнечника (FR 2487674). Мука из злаков, в частности пшеничная мука, как известно, при вдыхании вызывает астму от мучной и зерновой пыли и риниты. Самая сильная IgE-реакция наблюдалась в случае альбуминов и глобулинов, белки которых растворимы в нейтральных растворах. Однако некоторые исследования также продемонстрировали реактивность белков, растворимых в этаноле или кислой среде (глютенинов и глиадинов). В последнее время иммуноблотные исследования сыворотки крови пациентов с аллергией на мучную и зерновую пыль показали, что основные аллергены в нейтральных фракциях пшеничной и ячменной муки относятся к низкомолекулярному диапазону (приблизительно 20 кДа).

Потребление злаков иногда приводит к целиакии и герпетическому дерматиту. Некоторые исследования выявили наиболее задействованный антиген, относящийся к глиадиновой фракции растворимых в этаноле белков.

Несмотря на значение злаков в питании человека предполагают, что они приводят к ухудшению состояния при атопическом дерматите, в особенности у детей. Аналогичным образом, иммунологические исследования (по существу, SPT тест - скарификационная проба и RAST - радиоаллергосорбентный тест) приводят к идентификации участвующих белков в пшенице, овсе, ржи, ячмене, рисе, просе и кукурузе и демонстрируют перекрестные реакции между пшеницей и ячменем или рожью (Varjonen Е, Vainio Е, Kalimo К, Juntunen-Backman К, Savolainen J Skin-prick test and RAST responses to cereals in children with atopic dermatitis. Characterization of IgE-binding components in wheat and oats by an immunoblotting method (Ответы скарификационной пробы и RAST на злаки у детей с атопическим дерматитом. Определение характеристик 1дЕ-связывающих компонентов в пшенице и овсе методом иммуноблоттинга) Clin Exp Allergy 1995, 25:1100-1107) (Palosuo К, Alenius H, Varjonen E, Kalkkinen N, Reunala T. Rye γ-70 and γ-35 secalins and barley γ-3 hordein cross-react with go-5 gliadin, a major allergen in wheat-dependent, exercise-induced anaphylaxis (Перекрестные реакции γ-70 и γ-35 секалинов ржи и гордеина γ-3 ячменя с ω-5 глиадином, основным аллергеном обусловленной пшеницей анафилаксической реакции физического напряжения). Clin Exp Allergy, 2001, 31:466-473). Предполагается, что в случаях, когда поглощенные злаки являются причиной атопического дерматита, задействованы наименее растворимые белки (глиадины и глютенины). Многие предварительные исследования показывают, что в случае детей с атопическим дерматитом существенную роль играет пищевая гиперчувствительность, и удаление из пищи аллергенов приводит к клиническому улучшению.

Сообщается о некоторых проявлениях контактной аллергии на косметические средства на основе экстрактов зерен злаков (в особенности на белок пшеницы, будь то гидролизованный или негидролизованный, а также кунжут) у людей с повышенной чувствительностью. Было показано, что гидролиз белка пшеницы, который мог бы быть решением для смягчения аллергии, будет напротив гораздо более сенсибилизирующим (повышающим чувствительность), структурные изменения, вызванные гидролизом, выявляют новые места связывания антигена (Pecquet С, Lauriere М. New allergens in hydrolysates of wheat proteins (Новые аллергены в гидролизатах белка пшеницы). Rev Fr Allerg Immunol Clin 2003, 43:21-23).

Считается, что людям, подверженным аллергии, следует избегать белков зерен злаков как при пероральном, так и при местном применении, в особенности это относится к детям.

Таким образом, существует необходимость и устойчивый спрос на косметические изделия, предназначенные для людей с повышенной чувствительностью или аллергией на зерна злаков.

Неожиданно и к удивлению авторы изобретения обнаружили, что косметическая композиция, содержащая экстракт надземной части злаков или псевдозлаков, собранных предпочтительно до появления колоса, не приводит к перекрестным реакциям с теми белками, которые ответственны за аллергию на зерна злаков.

Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение экстракта надземной части (частей) злака и/или псевдозлака, за исключением зерен, для использования людьми с аллергией на белок зерновых.

Под термином надземная часть злака и/или псевдозлака в данном контексте подразумевается любая часть, расположенная выше уровня земли, за исключением зерен.

Предпочтительно, чтобы «надземные части злаков и/или псевдозлаков» включали в себя листья, и/или стебли, и/или вторичные колоски, и/или цветки, за исключением зерен.

Предпочтительно, чтобы экстракт согласно изобретению представлял собой экстракт надземной части (частей) злака и/или псевдозлака, собранного до появления колоса.

В контексте настоящего изобретения фраза «надземные части злака и/или псевдозлака, собранного до появления колоса» относится к надземным частям злака или псевдозлака, собранного после прорастания семян (спустя приблизительно от 2 недель до 2 месяцев после прорастания семян) во время стадии выхода в трубку вплоть до, но исключая его, появления колоса.

В контексте настоящего изобретения термин «выход в трубку» относится к фазе роста, соответствующей росту стебля в длину и до вступления в фазу колошения, перед цветением.

Предпочтительно, экстракт согласно изобретению получают из надземной части (частей) пшеницы, риса, ячменя или овса, более предпочтительно овса.

Экстракт надземной части (частей) овса, преимущественно используемый согласно изобретению людьми, подверженными аллергии на белок зерновых, содержит от 2 до 15% флавоноидов и от 0,2 до 2% авенакозидов A и B, предпочтительно от 5 до 10% флавоноидов изовитексин-2''-O-арабинопиранозида и изоориентин-2''-O-арабинопиранозида и/или менее 1 миллионных долей (м.д.) (ppm) белков, предпочтительно менее 0,5 м.д. и еще более предпочтительно менее 0,3 м.д. белков.

Используемый экстракт надземной части (частей) овса отличается содержанием в нем целевых флавоноида и сапонина. Последние анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, применяя один из двух различных методов, подходящих для каждого типа соединений.

Количества этих разных молекул изменяется в зависимости от условий экстракции. Основными флавоноидами являются изовитексин-2''-O-арабинопиранозид и изоориентин-2''-O-арабинопиранозид. Основными сапонинами являются авенакозиды А и В. Это бисдесмозидные стероидные сапонины.

Предпочтительно, экстракт согласно изобретению представляет собой экстракт надземной части (частей) пшеницы, риса или овса, собранных до появления колоса, и предпочтительно, надземной части (частей) овса, собранного до появления колоса.

Предпочтительно, экстракт согласно изобретению представляет собой экстракт, полученный в органическом растворителе.

Экстракт согласно изобретению может быть приготовлен путем экстрагирования органическим растворителем надземной части (частей) злака или псевдозлака (приблизительно от 2 недель до 2 месяцев после прорастания семян во время стадии роста в длину до, и исключая, появления колоса) после сушки и измельчения. В частности, используют органический растворитель, выбранный из группы, состоящей из кетонов, сложных эфиров, C₁-C₄-спиртов и их смесей в любых смешивающихся пропорциях. Предпочтительно используют органический растворитель, выбранный из группы, состоящей из ацетона, метилэтилкетона, метилизобутилкетона, этилацетата, C₁-C₄-спирта и их смеси в любой смешивающейся пропорции.

Экстракцию предпочтительно проводят при перемешивании или статически.

Экстракцию проводят при кипячении с обратным холодильником либо при комнатной температуре.

Предпочтительно, экстракцию проводят при соотношении растение/растворитель в диапазоне от 1:7 до 1:20, предпочтительно от 1:8 до 1:12.

Предпочтительно, экстракцию проводят в течение от 30 минут до 48 часов, наиболее предпочтительно, в течение от 60 до 120 минут. Экстракция может повторяться 2 или 3 раза.

Жмых, полученный на стадии экстракции, затем отделяют от экстракта путем центрифугирования или фильтрацией, после чего раствор может быть в той или иной степени сконцентрирован до получения сухой массы.

Отбеливающая обработка может проводиться либо путем обезжиривания с помощью концентрирования, осаждения и фильтрации, либо путем добавления к концентрированному или неконцентрированному экстрагирующему раствору абсорбирующего субстрата, такого как активированный уголь или абсорбционная смола.

На стадии сушки может быть добавлен субстрат в весовом соотношении относительно экстрагируемого сухого вещества в диапазоне от 1 до 75%. Субстрат может представлять собой сахар, такой как мальтодекстрин, лактоза, диоксид кремния или любой другой косметологически приемлемый субстрат.

Предпочтительно, чтобы этот экстракт был получен экстракцией ацетоном или смесью ацетон/вода, содержащей до 20% воды. Ацетоновый или водно-ацетоновый, содержащий до 20% воды, экстракт содержит целевые молекулы, флавоноиды и сапонины и в значительной степени обеднен белками. Фактически, методы анализа для определения белков, описанные в Европейской фармакопее, оказываются безрезультатными, а электрофоретическая миграция во время электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия после осаждения из ацетона и проявления с помощью кумасси голубого или нитрата серебра показывает отсутствие полосы, свидетельствующей о наличии белка. Нанесение контрольной пробы на тот же самый электрофорез позволяет оценить предел обнаружения белка, как соответствующий приблизительно 1 нг, и, таким образом, содержание белка в данном экстракте составляет менее 1 м.д. (на основании количества экстракта, нанесенного на гель). Предпочтительно, чтобы указанное содержание белка составляло менее 0,5 м.д., еще более предпочтительно, менее 0,3 м.д. белков.

Еще одной целью настоящего изобретения является использование экстракта надземной части (частей) злаков и/или псевдозлаков, за исключением зерен, людьми, подверженными аллергии на белок зерновых.

Еще одна цель настоящего изобретения относится к использованию экстракта надземной части (частей) злаков и/или псевдозлаков, за исключением зерен, для приготовления гипоаллергенной дерматологической композиции, то есть композиции, минимизирующей и/или предотвращающей риски возникновения аллергических реакций у людей, подверженных аллергии на белок зерновых.

Еще одна цель настоящего изобретения относится к использованию косметической гипоаллергенной композиции, содержащей экстракт надземной части (частей) злаков и/или псевдозлаков, людьми, подверженными аллергии на белок зерновых.

Дерматологическая или косметическая композиция, используемая согласно изобретению, может, в частности, содержать добавки и вспомогательные средства для приготовления лекарственной формы, такие как эмульгирующие вещества, загустители, гелеобразователи, нейтрализаторы воды, лиофилизирующие добавки, стабилизаторы, красители, отдушки и консерванты.

Дерматологическая или косметическая композиция, используемая согласно изобретению, также включает в себя традиционные дерматологически совместимые наполнители.

Она может быть приготовлена в виде эмульсии вода-в-масле (W/О) или масло-в-воде (O/W), гетерогенной эмульсии, такой как, например, эмульсия вода-в-масле-в-воде (W/O/W) или эмульсия масло-в-воде-в-масле (O/W/О), или же в виде водной дисперсии или масляной дисперсии, геля или аэрозоля.

Дерматологически совместимые наполнители могут быть любыми наполнителями, известными специалисту в данной области техники, подходящими для получения композиции, предназначенной для местного применения в форме крема, лосьона, геля, мази, эмульсии, микроэмульсии, средства для распыления, шампуня и тому подобного.

Предпочтительно, чтобы дерматологическая или косметическая композиция, используемая согласно изобретению, содержала от 0,1 до 10 масс.% экстракта надземной части (частей) злака или псевдозлака, за исключением зерен, от общей массы композиции. Предпочтительно, чтобы указанная композиция включала в себя экстракт надземной части (частей) злака согласно изобретению в количестве от 0,1 до 5 масс.% от общей массы композиции.

Краткое описание графических материалов

Фиг.1: Сравнение профилей суммарного белка из зерен и из молодых побегов овса методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (12,5% полиакриламидный гель) в присутствии додецилсульфата натрия при проявлении с помощью кумасси голубого.

Фиг.2: Вестерн-блоттинг, окрашивание ферментами с поликлональными антителами против белков надземных частей.

Фиг.3: Вестерн-блоттинг, окрашивание ферментами с поликлональными антителами против белков зерен. Следующие примеры иллюстрируют изобретение, не ограничивая его.

Пример 1: Приготовление экстракта надземных частей овса, собранного до появления колоса, экстракцией ацетоном

400 кг высушенных надземных частей овса, собранного до появления колоса, размалывают и затем помещают в реактор с 10 объемами смеси ацетон/вода при перемешивании в течение 1 часа при комнатной температуре.

После разделения фаз твердая/жидкая получают первый экстракт. Жмых экстрагируют снова 10 объемами смеси ацетон/вода в течение 1 часа при комнатной температуре при перемешивании. После разделения твердой/жидкой фаз получают второй экстракт и объединяют его с первым. Полученный в результате раствор концентрируют до содержания воды 1,33 об./кг, после чего фильтруют. Полученный таким образом экстракт сушат с помощью микроволн после добавления мальтодекстриновой подложки (25%/нативный экстракт, достаточное количество (qsp)).

Таким способом получают 36 кг порошка бледно-коричневого цвета, содержащего 6% флавоноидов (изовитексин-2''-O-арабинопиранозида и изоориентин-2''-O-арабинопиранозида), 0,3% авенакозида A и 0,6% авенакозида B, при этом содержание белка в полученном таким образом экстракте составляет менее 0,3 м.д.

Пример 2: Биохимическое и иммунологическое сравнение экстракта зерна злака и экстракта надземных частей того же злака, собранного до появления колоса.

Отсутствие перекрестных реакций между экстрактами зерна злаков и экстрактами надземных частей было продемонстрировано с помощью биохимических (экстракция и определение белка) и иммуноферментных методов (специфическая детекция наличия белка посредством образования антитела).

Экстракт белка зерновых может быть приготовлен следующим образом.

Зерна размалывают и экстрагируют гидроксидом натрия при pH 8. После фильтрации фильтрат осаждают добавлением соляной кислоты до pH 5.4. После центрифугирования осадок отбирают, помещают в водный раствор и диализуют против воды в диализном мешке, имеющем порог отключения 6-8 кДа, при температуре 4°C в течение ночи.

Экстракт надземных частей может быть приготовлен следующим образом.

Из свежего материала:

- экстракцией путем солюбилизации в буферном растворе Tris.HCl с величиной рН 8,0, фильтрацией и последующей серией из двух осаждений из ацетона для удаления солей,

или:

- экстракцией путем солюбилизации в восстанавливающем буфере Лэммли при pH 7,5, содержащем мочевину и тиомочевину, фильтрацией и последующей серией из двух осаждений из ацетона для удаления солей.

Из сухого материала:

экстракцией в течение 27 часов путем солюбилизации в восстанавливающем буфере Лэммли при pH 7,5, содержащем мочевину и тиомочевину, фильтрацией и последующей серией из двух осаждений из ацетона для удаления солей.

Биохимическое и иммунологическое исследование

Биохимические методы

I. Электрофорез

Принцип действия: Методом специфического исследования белков является электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия: в присутствии додецилсульфата натрия отрицательно заряженные белки перемещаются в полиакриламидном геле в направлении катода в зависимости только от их массы, белки определяют с помощью красителей, таких как кумасси голубой или нитрат серебра.

Используемый положительный контроль соответствует либо экстракту суммарного белка в надземной части овса до появления колоса, либо экстракту суммарного белка зерна, полученным как описано выше.

II. Иллюстративный результат - Фиг.1

Сравнение профилей суммарного белка зерна и надземных частей овса до появления колоса с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (12,5% полиакриламидный гель) в присутствии додецилсульфата натрия при проявлении с помощью кумасси голубого.

Профиль электрофореза, показанный на Фиг.1, обнаруживает существенное различие в белковом составе обоих исследуемых экстрактов, в особенности в отношении основных белков. Однако единственным способом, позволяющим удостовериться в качественном различии между этими двумя сериями белков, является использование иммунологических методов со специфическим распознаванием антиген-антитело.

Иммунохимический метод

Этот метод требует, прежде всего, получения антител против всех белков в надземных частях или в зернах. С этой целью экстракты всех белков надземных частей и зерен одного и того же вида вводят в организм кроликов. Затем из сыворотки крови животных получают поликлональные антитела.

Цель состоит в том, чтобы продемонстрировать, что белки надземной части овса до появления колоса отличаются от белков зерен и что при этом отсутствует перекрестная реакция между белками зерен и белками надземной части.

- Антитела, направленные против белков надземной части овса до появления колоса, в сравнении с белками зерен овса,

- Антитела, направленные против белков зерен овса, в сравнении с белками надземной части овса до появления колоса,

с использованием методов ELISA (иммуноферментного анализа) и вестерн-блоттинга.

I. Прямой ELISA

ELISA (иммуноферментный анализ) является иммунохимическим методом определения наличия антигена в растворе. Принцип действия состоит в фиксации белков в испытуемом растворе в колодце планшета с последующей обработкой антибелковыми поликлональными антителами. Далее второе антитело анти-lgG кролика, соединенное с ферментом, покажет после промывки наличие антигена в лунке планшета с помощью простой колориметрической реакции.

II. Вестерн-блоттинг

Принцип действия: Метод вестерн-блоттинга состоит из электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия белковой смеси с последующим окрашиванием с помощью специфического взаимодействия антиген-антитело. При этом будут выявляться только те белки, которые распознаются с помощью поликлональных антител. Первые антитела затем распознаются вторым антителом (в данном контексте - антителом анти-lgG кролика), соединенным с ферментом, таким как щелочная фосфатаза.

Иллюстративный результат - Фиг.2 и 3

Перекрестные реакции между белками зерна и антителами, направленными против белков надземной части овса до появления колоса (Фиг.2), и перекрестные реакции между белками надземной части овса до появления колоса и антителами, направленными против белков зерна (Фиг.3).

Метод вестерн-блоттинга подтверждает первые результаты, полученные с помощью ELISA, а именно, что белки надземной части овса до появления колоса отличаются от белков зерна и перекрестные реакции между ними отсутствуют.

Пациент, иммунизированный против белков зерна овса с помощью диеты, не будет, таким образом, реагировать на экстракт надземной части (за исключением зерен), даже если в нем содержатся белки.