СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ В ПУЛЕ ВЕЩЕСТВ СРЕДНЕЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ, ПЛАЗМЕ, ЭРИТРОЦИТАХ И В МОЧЕ

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии и предназначено для определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы (средних молекул) сыворотки или плазмы крови, эритроцитах, моче при любых патологических состояниях путем биохимического исследования.

В настоящее время достаточно широко изучены механизмы перекисного окисления липидов, его роли в нормальном функционировании клеток и патогенезе различных заболеваний. Однако активные формы кислорода могут вызывать свободно-радикальное окисление не только липидов, но и белков, что вносит значительный вклад в формирование окислительного стресса любого генеза. Изучение окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы, которые могут проявлять и оксидантные, и прооксидантные свойства, позволит глубже изучить механизмы развития критическх состояний и углубит клинико-лабораторную диагностику тяжести эндотоксикоза [1].

Известен способ определения эндогенной интоксикации [2], заключающийся в определении уровня молекул средней массы в сыворотке крови. Однако этот способ не позволяет оценить степень окислительной модификации белков сыворотки крови, существенный вклад в которую вносят вещества средней молекулярной массы.

Наиболее близким к заявленному изобретению является биохимический способ определения окислительной модификации белков сыворотки крови человека [3], заключающийся в реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДФГ) с образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона.

Данный способ предполагает забор крови натощак, затем к 0,1 мл сыворотки крови приливается 20% раствор трихлоруксусной кислоты. К денатурированным белкам добавляется равный объем (1 мл) 0,1 М 2,4-ДФГ, растворенного в 2 М HCl. В контрольную пробу добавляется вместо 2,4-ДФГ равный объем 2 М HCl. Инкубацию осуществляют при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем пробы центрифугируют при 3000 об/мин 20 минут. Осадок промывают 3 раза раствором этанол-этилацетат (1:1) для экстракции липидов и 2,4-ДФГ, который не реагировал с карбонильными группами окисленных белков. Полученный осадок подсушивают с целью устранения оставшегося растворителя этанол-этилацетат и затем растворяют в 8 М растворе мочевины. Мочевину приливают к осадку в объеме 2,5 мл и выдерживают в кипящей водяной бане в течение 5 минут до полного растворения. Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов регистрируют на спектрофотометре при следующих длинах волн: 356, 370, 430, 530 нм.

Однако этот метод ориентирован только на одну биологическую среду - сыворотку крови, только на один параметр - окислительную модификацию белков.

Имеется также трудность технического характера: такой реактив, как «0,1 М 2,4-ДФГ, растворенный в 2 М HCl», приготовить сложно в связи с практической нерастворимостью 2,4-ДФГ - он постоянно выпадает в осадок. Можно провести нагревание, но, через определенное время, осадок снова выпадает.

Задачей заявляемого изобретения является увеличение информативности биохимических тестов определения молекул средней массы (МСМ) и окислительной модификации белков (ОМБ) в сыворотке крови, эритроцитах путем исследования их в комплексе - в одной и той же пробе и снижение расхода биологического материала. Предлагаемый способ позволяет работать и в других биологических средах - плазме крови, моче. Таким образом, применение данного изобретения позволит расширить представления о механизмах окислительной модификации белков у больных в критических состояниях за счет комплексного изучения основных маркерных биологических сред, используемых в клинико-диагностических лабораториях, - сыворотка крови, эритроциты, моча. Сыворотка крови может быть заменена на плазму.

Техническим результатом заявляемого изобретения является определение окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы сыворотки крови, эритроцитах, отличающееся тем, что одновременно в пробах производят определение уровня средних молекул, и окислительной модификации белков, причем растворение денатурированных белков производят в 0,05 М растворе 2,4-ДФГ (динитрофенилгидразина) в 2 М HCl (соляной кислоте), после чего пробу центрифугируют при 1000 об/мин, в течении 20 минут, далее осадок промывают 2 раза раствором этанол-этилацетат (1:1), после подсушивания и растворения которого выдерживают пробы в кипящей воде в течении 10 минут. В способе определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы вместо сыворотки крови в качестве биологического материала может быть использована плазма крови.

Также поставленная задача решается способом определения окислительной модификации белков мочи в пуле веществ средней молекулярной массы, включающий забор биологических сред, осаждение белков, центрифугирование, добавление раствора мочевины, отличающийся тем, что в пробе мочи для определения окислительной модификации белков берут 0,5 мл жидкости из верхней части пробирки, далее обрабатывают 0,05 М раствором 2,4-ДФГ в 2 М HCl пробу центрифугируют при 1000 об/мин, в течение 20 минут.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Производят забор крови путем венепункции натощак. Кровь центрифугируют для отделения сыворотки от форменных элементов.

Проводят разведение сыворотки крови в 10 раз (в стеклянных пробирках, в том числе все этапы далее также в стеклянных пробирках) путем прибавления к 0,1 мл сыворотки крови 0,9 мл физиологического раствора. Затем для осаждения белков к пробе приливается 0,5 мл 10% раствор трихлоруксусной кислоты и производится перемешивание. Проводят центрифугирование 15 минут при 1000 оборотов в минуту.

Надосадочную жидкость отбирают в количестве 0,5 мл, прибавляют 4,5 мл дистиллированной воды и определяют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 254 нм. Величина экстинкции пробы соответствует уровню молекул средней массы, содержание которых выражается в единицах оптической плотности (ед.опт.пл.).

К осадку денатурированных белков добавляют 1 мл 0,05 М 2,4-ДФГ, растворенного в 2 М HCl. Инкубацию осуществляют при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем пробы центрифугируют при 1000 об/мин. 20 минут.

Осадок промывают последовательно 2 раза раствором этанол-этилацетата (1:1) для экстракции липидов и 2,4-ДФГ, который не реагировал с карбонильными группами окисленных белков. После каждого промывания раствором этанол-этилацетата (1:1) осадок подсушивают на водяной бане 10 минут с целью устранения оставшегося растворителя этанол-этилацетата и затем растворяют в 2,5 мл 8 М раствора мочевины, выдерживая пробы в кипящей водяной бане в течение 10 минут до полного растворения.

Аналогично проводят ход метода с мочой и эритроцитами. Однако при работе с мочой есть специфика.

Особенность проведения метода в моче. Для анализа берут не осадок денатурированных белков, т.к. он, как правило, образуется слабо, а 0,5 мл жидкости из пробирки. Стадия промывания раствором этанол-этилацетатом (1:1) отсутствует. Далее делают все в соответствии с методом: добавляют 2,5 мл 8 М раствора мочевины, выдерживая пробы в кипящей водяной бане в течение 10 минут.

Для определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы в эритроцитах, сначала эритроциты получают из крови следующим образом: кровь центрифугируют при 3000 оборотов в минуту в течение 15 минут, плазму отсасывают, и эритроциты промывают 3 раза физиологическим раствором объемом 9 мл. Эритроцитарную массу используют в соответствии с ходом метода. Кровь должна быть взята с антикоагулянтом, например с гепарином или трилоном Б.

Ход проведения метода может быть реализован в виде клинического набора реактивов. В этом случае при описании хода метода используют следующие обозначения: реактив А - 10% раствор трихлоруксусной кислоты; реактив Б - 0,05 М 2,4-ДФГ, растворенный в 2 М HCl; реактив В - раствор этанол-этилацетат (1:1); реактив Г - 8 М раствор мочевины.

Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов регистрируют на спектрофотометре при следующих длинах волн: 356, 370, 430, 530 нм (против воды). У практически здоровых людей без клинических проявлений каких-либо заболеваний (контрольная группа - 13 человек в возрасте 32,69±2,99 лет) показатели этого параметра и уровни МСМ представлены в таблице 1. Величины более этих уровней (верхняя граница диапазона нормы) позволяют говорить об увеличенных уровнях этих параметров, что свидетельствует об увеличении эндогенной интоксикации организма, проявляющейся, в том числе, повышенной окислительной модификацией белков в анализируемых биологических средах.

Анализ определений ОМБ при различных длинах волн показывает, что наибольшие различия в их уровнях в различных биологических средах имеют место при 530 нм. Это позволяет рекомендовать эту длину волны как необходимую, базовую. Однако, в зависимости от имеющегося в данной клинико-диагностической лаборатории оборудования, можно выбрать любую из указанных длин волн или использовать их все (356, 370, 430, 530 нм) в комплексе.

Далее представлены клинические примеры использования предлагаемого способа.

Пример 1. Больная Ш., 62 года, поступила в Городскую клиническую больницу скорой медицинской помощи им. Г.А.Захарьина г.Пензы (ГКБ СМП им. Г.А.Захарьина) с диагнозом - хронический холецистит.

У больной была произведена венепункция и сбор утренней мочи, натощак. Состояние пациентки и подготовка к лапороскопической холецистэктомии (ЛХЭ) требовали всестороннего лабораторного обследования. Для оценки выраженности эндогенной интоксикации определяли уровни МСМ и окислительной модификации белков (ОМБ) в сыворотке крови, эритроцитах на этапах до ЛХЭ, сразу после ЛХЭ, на 1 и 5 сутки наблюдений, в моче - до ЛХЭ, на 1 и 5 сутки после операции. Для получения сыворотки крови и эритроцитов взятую кровь делили на две порции: в ту пробирку, в которой планировалось получение эритроцитов, добавляли ЭДТА.

Окислительную модификацию белков сыворотки крови человека в пуле веществ средней молекулярной массы определяли следующим образом.

1. В сыворотке крови.

Взятую кровь центрифугировали для отделения сыворотки от форменных элементов. Проводили разведение сыворотки крови в 10 раз (в стеклянных пробирках, в том числе все этапы далее) путем прибавления к 0,1 мл сыворотки крови 0,9 мл физиологического раствора. Затем для осаждения белков к пробе приливали 0,5 мл 10% раствор трихлоруксусной кислоты и производится перемешивание. Проводили центрифугирование 20 минут при 1000 оборотов в минуту.

Надосадочную жидкость отбирали в количестве 0,5 мл, прибавляли 4,5 мл дистиллированной воды и определяли оптическую плотность полученного раствора при длине волны 254 нм. Величина экстинкции пробы соответствовала уровню молекул средней массы, содержание которых выражали в единицах оптической плотности (ед.опт.пл.).

К осадку денатурированных белков добавляли 1 мл 0,05 М 2,4-ДФГ, растворенного в 2 М HCl. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем пробы центрифугировали при 1000 об/мин 20 минут.

Осадок промывали последовательно 2 раза раствором этанол-этилацетата (1:1) для экстракции липидов и 2,4-ДФГ, который не реагировал с карбонильными группами окисленных белков. После каждого промывания раствором этанол-этилацетатом (1:1) осадок подсушивали на водяной бане 10 минут с целью устранения оставшегося растворителя этанол-этилацетат и затем растворяли в 2,5 мл 8 М раствора мочевины, выдерживая пробы в кипящей водяной бане в течение 10 минут до полного растворения.

2. В эритроцитах.

Для проведения анализа в эритроцитах кровь (брали с ЭДТА) центрифугировали при 3000 оборотов в минуту в течении 15 минут, плазму отсасывали, и эритроциты промывали 3 раза физиологическим раствором (9 мл). Далее аналогично проводили ход метода, как и в сыворотке крови.

3. В моче.

Ход метода в целом аналогичен его осуществлению в сыворотке крови. Однако для определения ОМБ брали не осадок денатурированных белков, т.к. он образовывался слабо, а 0,5 мл жидкости из пробирки. Стадия промывания раствором этанол-этилацетат (1:1) отсутствовала. Далее делали все в соответствии с методом: добавляли 2,5 мл 8 М раствора мочевины, выдерживая пробы в кипящей водяной бане в течение 10 минут.

Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов (в сыворотке крови, эритроцитах, моче) регистрировали на спектрофотометре при следующих длинах волн: 356, 370, 430, 530 нм (против воды). Полученные результаты представлены в таблицах 2-4.

Динамику молекул средней массы (МСМ) и окислительной модификации белков (ОМБ) анализировали на фоне общепринятых критериев эндогенной интоксикации - лейкоцитарных индексов интоксикации (ЛИИ) и индекса ядерного сдвига (таблица 5).

Полученные данные обследования свидетельствовали о наличии эндогенной интоксикации у пациентки, что проявлялось повышенными уровнями ЛИИ до 1 суток наблюдений, на 5 сутки после операции их величины приближались к норме (за исключением ЛИИ по Химич, который был ниже нормы в 1,5 раза).

При этом уровни МСМ и ОМБ сыворотки крови, эритроцитов и мочи проявили себя как более чувствительные тесты эндотоксикоза: к 5 суткам наблюдений ряд их показателей отличались от нормы. МСМ были повышены: в сыворотке крови - в 1,4 раза, в эритроцитах - в 1,6 раза, в моче - в 1,7 раза. Уровень ОМБ при 530 нм, предлагаемой нами в качестве базовой длины волны для исследования, в сыворотке крови был меньше нормы в 1,2 раза, в эритроцитах и моче - выше в 1,5 раза и 1,6 раза соответственно. Это может свидетельствовать о некотором дисбалансе ОМБ в исследуемых биологических средах организма при хроническом холецистите.

Пример 2. Больная К., 51 год, поступила в Городскую клиническую больницу скорой медицинской помощи им. Г.А.Захарьина г.Пензы (ГКБ СМП им. Г.А.Захарьина) с диагнозом - острый холецистит.

У больной была произведена венепункция и сбор утренней мочи, натощак. Тяжелое состояние пациентки и подготовка к лапороскопической холецистэктомии (ЛХЭ) требовали всестороннего лабораторного обследования. Для оценки выраженности эндогенной интоксикации определяли уровни МСМ и окислительной модификации белков (ОМБ) в сыворотке крови, эритроцитах на этапах сразу после ЛХЭ, на 3 и 5 сутки наблюдений, в моче - на 5 сутки после операции. Для получения сыворотки крови и эритроцитов взятую кровь делили на две порции: в ту пробирку, в которой планировалось получение эритроцитов, добавляли ЭДТА.

Окислительную модификацию белков сыворотки крови человека в пуле веществ средней молекулярной массы определяли следующим образом.

1. В сыворотке крови.

Взятую кровь центрифугировали для отделения сыворотки от форменных элементов. Проводили разведение сыворотки крови в 10 раз (в стеклянных пробирках, в том числе все этапы далее) путем прибавления к 0,1 мл сыворотки крови 0,9 мл физиологического раствора. Затем для осаждения белков к пробе приливали 0,5 мл 10% раствор трихлоруксусной кислоты и производится перемешивание. Проводили центрифугирование 15 минут при 1000 оборотов в минуту.

Надосадочную жидкость отбирали в количестве 0,5 мл, прибавляли 4,5 мл дистиллированной воды и определяли оптическую плотность полученного раствора при длине волны 254 нм. Величина экстинкции пробы соответствовала уровню молекул средней массы, содержание которых выражали в единицах оптической плотности (ед.опт.пл.).

К осадку денатурированных белков добавляли 1 мл 0,05 М 2,4-ДФГ, растворенного в 2 М HCl. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем пробы центрифугировали при 1000 об/мин. 20 минут.

Осадок промывали последовательно 2 раза раствором этанол-этилацетата (1:1) для экстракции липидов и 2,4-ДФГ, который не реагировал с карбонильными группами окисленных белков. После каждого промывания раствора этанол-этилацетат (1:1) осадок подсушивали на водяной бане 10 минут с целью устранения оставшегося растворителя этанол-этилацетат и затем растворяли в 2,5 мл 8 М раствора мочевины, выдерживая пробы в кипящей водяной бане в течение 10 минут до полного растворения.

2. В эритроцитах.

Для проведения анализа в эритроцитах кровь (брали с ЭДТА) центрифугировали при 3000 оборотов в минуту в течении 15 минут, плазму отсасывали, и эритроциты промывали 3 раза физиологическим раствором (9 мл). Далее аналогично проводили ход метода, как и в сыворотке крови.

3. В моче.

Ход метода в целом аналогичен его осуществлению в сыворотке крови. Однако для определения ОМБ брали не осадок денатурированных белков, т.к. он образовывался слабо, а 0,5 мл жидкости из пробирки. Стадия промывания раствором этанол-этилацетата (1:1) отсутствовала. Далее делали все в соответствии с методом: добавляли 2,5 мл 8 М раствора мочевины, выдерживая пробы в кипящей водяной бане в течение 10 минут.

Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов (в сыворотке крови, эритроцитах, моче) регистрировали на спектрофотометре при следующих длинах волн: 356, 370, 430, 530 нм (против воды). Полученные результаты представлены в таблицах 6-8.

Динамику МСМ и ОМБ анализировали на фоне общепринятых критериев эндогенной интоксикации - лейкоцитарных индексов интоксикации (ЛИИ) и индекса ядерного сдвига (таблица 9).

Полученные данные обследования свидетельствовали о наличии эндогенной интоксикации у пациентки, что проявлялось повышенными уровнями ЛИИ до 3 суток наблюдений, на 5 сутки после операции их величины приближались к норме (за исключением - ЛИИ по Кальф-Калифу, снизившегося в 2,2 раза, и индекса ядерного сдвига, повышенного в 4,2 раза).

При этом уровни МСМ и ОМБ сыворотки крови, эритроцитов и мочи проявили себя как более чувствительные тесты эндотоксикоза: к 5 суткам наблюдений ряд их показателей отличались от нормы. МСМ были повышены: в эритроцитах - в 1,3 раза, в моче - в 1,9 раза. Уровень ОМБ при 530 нм, предлагаемой нами в качестве базовой длины волны для исследования, был выше нормы в эритроцитах и моче - в 1,4 раза и 1,9 раза соответственно. Это может свидетельствовать о дисбалансе ОМБ в исследуемых биологических средах организма при остром холецистите.

С помощью предлагаемого способа обследовано 12 больных холециститом, в том числе 5 больных острым и 7 больных хроническим холециститом. Это больные, которым были проведены лапароскопические холецистэктомии (ЛХЭ). Наблюдения в исследуемых группах проводились до и сразу после ЛХЭ, на 1, 3, 5 сутки послеоперационного периода.

Исследования проведены на клинической базе кафедры анестезиологии-реаниматологии и скорой медицинской помощи (АРиСМП) Государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Пензенский институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ДПО ПИУВ Минздравсоцразвития России) - в Городской клинической больнице скорой медицинской помощи им. Г.А.Захарьина г.Пензы (ГКБ СМП им. Г.А.Захарьина) в хирургическом отделении. Подготовка биологического материала к анализу проводилась в экспресс-лаборатории отделения реанимации и интенсивной терапии ГКБ СМП им. Г.А.Захарьина, также являющейся одной из клинических баз кафедры АРиСМП ГБОУ ДПО ПИУВ Минздравсоцразвития России.

Величины МСМ определялись на спектрофотометре СФ-2000, уровень ОМБ оценивали с помощью КФК-3 в лаборатории кафедры биохимии ПГПУ им. В.Г.Белинского.

Предлагаемый способ позволяет увеличить информативность биохимического теста - определение уровня молекул средней массы в сыворотке крови, плазме, эритроцитах и в моче, являющегося одним из наиболее часто используемых маркеров эндогенной интоксикации. Данное предложение позволит расширить представления о механизмах окислительной модификации белков у больных в критических состояниях, в частности использовать его в экспресс-лабораториях отделений реанимации и интенсивной терапии, при малом объеме полученной биологической среды (крови, мочи) и времени проведения анализа.

Источники информации:

1. Рябов Г.А., Азизов Ю.М., Дорохов С.И., Кулабухов В.В., Титова И.А., Пасечник И.Н., Бражник Т.Б., Рыбинцев В.Ю. Окислительная модификация белков плазмы крови у больных в критических состояниях // Анестезиология и реаниматология. - 2000. - №2. - с.72-75.

2. Изобретение «СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ» патент №2193780, приоритет от 26.04.2001 г., опубликовано 27.11.2002.

3. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А., Поротов И.Г. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопросы медицинской химии. - 1995. - №1. - с.24-26.