10.08.2014
216.012.e7d4

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОФАГА

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Представленный способ получения бактериофага включает: засев бактериальной культуры штамма-хозяина в титре 10-10 КОЕ/мл в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивирование в течение 3-3,5 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг в титре 10-10 БОЕ/мл и культивируют в течение 13-15 часов при оптимальной температуре и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм. Получают фаголизат и отсасывают в стерильную емкость, добавляют хлороформ, выдерживают в течение 30-45 минут при непрерывном шуттелировании. Центрифугируют и стерилизуют надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм. Охарактеризованное решение обеспечивает универсальную возможность получения фаголизата с использованием различных бактериофагов, стабильность титра бактериофагов в фаголизате и возможность его применения для использования в пищевой промышленности 2 з.п. ф-лы, 3 пр.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в биотехнологии получения продукции, содержащей бактериофаги.

Бактериофаги - это вирусы, характеризующиеся специфической способностью к избирательному инфицированию бактериальных клеток, принадлежащих к одному штамму или антигенно-гомологичным штаммам одного вида или рода с последующим лизисом (после внутриклеточной репликации) клетки-хозяина - вирулентные фаги или интегрированием в бактериальный геном с образованием лизогенов - умеренные фаги (Adams H.M. Bacteriophages. - New York: Interscience Publishers, Inc., London: Interscience Publishers ltd., 1959. - 592 p.). По многочисленным данным литературы, фаги могут быть использованы в качестве природных антимикробных агентов для борьбы с бактериальными инфекциями у людей, животных и сельскохозяйственных культур (Alisky J., Iczkowski К., Rapoport,A., Troitsky N. Bacterio-phages show promise as antimicrobial agents // The Journal of infection. - 1998. - Vol.36, №1. P.5-15; Brussow H. Phage therapy: the Escherichia coli experience // Microbiology. - 2005. - Vol.151, Pt.7. - P.2133-2140; Бондаренко В.М. Клинический эффект и пути рационального использования лечебных бактериофагов в медицинской практике // Приложение к Журналу инфектологии. - 2011. - Т.3, №3. - С.15-19). Ряд авторов допускают возможность практического применения бактериофагов как средств деконтаминации в пищевой промышленности как безопасной для человека и безвредной для окружающей среды альтернативы химическим и физическим методам элиминации бактерий (Greer G.G. Bacteriophage control of foodborne bacteria // Journal of food protection. - 2005. - Vol.68, №5. - P.1102-1111; Lang L.H. FDA approves use of bacteriophages to be added to meat and poultry products // Gastroenterology. - 2006. - Vol.131, №5. - P.1370-1372; Алешкин А.В., Зейгарник М.В. Возможности применения бактериофагов в качестве пробиотических средств деконтаминации в области питания // Вопросы диетологии. - 2012. - Т. 2, №4. - С.24-34).

Одним из приоритетных показателей производства фагосодержащей продукции является получение фаголизатов с исходно высоким титром бактериофагов (Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. - М.: Медгиз, 1961. - С.17-19).

Известным, предложенным для различных бактериофагов способом получения фаголизатов с высоким титром бактериофагов является культивирование бактерий штамма-хозяина с бактериофагом на плотной питательной среде с последующим получением суспендированного фаголизата с поверхности плотной питательной среды (SU 64612, 30.04.1945; Кузьмин Н.А., Комаров Б.А. Способ быстрого получения сибиреязвенных фагов в высоких концентрациях // Лабораторное дело. - 1967. - №12. - С.741-743).

Основными недостатками данных аналогов заявляемого изобретения являются недостаточная универсальность способа для получения продукции с использованием различных бактериофагов, недостаточная стабильность титра бактериофагов в фаголизате и отсутствие или недостаточность очистки фаголизата для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении фаголизата с титром бактериофага 1011-1013 БОЕ/мл.

Наиболее близким аналогом - прототипом - является способ получения концентрированных препаратов фага, заключающийся в посеве на чашки с агаром смеси из концентрированной культуры бактерий и фага в количестве, достаточном для получения сплошного лизиса. После инкубации при 37°C в течение 12-18 часов в чашки наливают 3-5 мл бульона и оставляют на 20 минут. Затем бульон сливают и центрифугируют. Надосадочную жидкость отсасывают. Согласно прототипу приготовленный таком образом фаг может содержать 1011-1012 частичек на 1 мл (Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. - М.: Медгиз, 1961. - С.18).

Основными недостатками прототипа являются недостаточная универсальность способа для получения продукции с использованием различных бактериофагов, недостаточная стабильность титра бактериофагов в фаголизате и недостаточность очистки фаголизата для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении очищенного фаголизата с титром бактериофага 1011-1013 БОЕ/мл.

Главной задачей заявляемого изобретения является обеспечение универсальности способа получения фаголизата с использованием различных бактериофагов, стабильности титра бактериофагов в фаголизате с его очисткой для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении очищенного фаголизата с титром бактериофага 1011-1013 БОЕ/мл.

Задача решена тем, что бактериальную культуру штамма-хозяина в титре 108-109 КОЕ/мл засевают в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивируют в течение 3-3,5 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг в титре 105-106 БОЕ/мл, герметично закрывают сосуд для культивирования, культивируют в течение 13-15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм, получают фаголизат при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором или буферным раствором с pH 7,0-7,2 в количестве 0,04-0,045 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды, отсасывают фаголизат в стерильную емкость, добавляют хлороформ, выдерживают в течение 30-45 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугируют в течение 30-45 минут при 5000-6000 об./мин, стерилизуют надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм и пропускают полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину. После центрифугирования можно смешивать надосадочные жидкости, содержащие бактериофаги, затем стерилизовать смесь надосадочных жидкостей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм и пропускать полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину. В качестве сосуда для культивирования можно использовать стеклянный микробиологический матрац.

В результате впервые проведенных нами исследований была определена обеспечивающая решение поставленной задачи новая совокупность оригинальных отличительных признаков: установлены универсальные, промышленно применимые условия эффективного культивирования бактериофагов (форма и толщина слоя плотной питательной среды, толщина слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды, герметизация сосуда для культивирования), подобран титр маточного бактериофага, определены варианты и количества суспендирующего раствора, необходимые для обеспечения высокой концентрации бактериофагов в фаголизате и качественной очистки фагов, предложена оптимальная последовательность и продолжительность операций очистки фаголизата.

Из патентно-технической литературы и практики производства фагосодержащей продукции неизвестно о способе получения бактериофага с использованием культивирования бактериофагов на культуре бактерий на плотной питательной среде, который был бы идентичен заявляемому.

Отсюда правомерен вывод о соответствии заявляемого решения критерию «новизна».

Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для получения технического результата - обеспечения универсальности способа получения фаголизата с использованием различных бактериофагов, стабильности титра бактериофагов в фаголизате с его очисткой для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении очищенного фаголизата с титром бактериофага 1011-1013 БОЕ/мл.

Между существующими признаками и решаемой задачей существует причинно-следственная связь, где каждый признак необходим и влияет на получение технического результата, а вместе взятые признаки достаточны для его получения. Правомерен вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Предлагаемый способ может быть реализован многократно с использованием присущих ему существенных признаков, а значит, заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».

Заявляемое изобретение апробировано при получении вариантов очищенного фаголизата, содержащего различные бактериофаги. Ниже приводятся результаты этой апробации. При этом приведенные примеры получения бактериофагов показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.

Пример 1. Для получения бактериофага, активного в отношении Salmonella enterica серовар Typhimurium, бактериальную культуру штамма-хозяина - Salmonella enterica серовар Typhimurium - в титре 108 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.

Штамм-хозяин культивировали в течение 3,5 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Salmonella enterica серовар Typhimurium засевали маточный бактериофаг в титре 105 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 13 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором в количестве 0,04 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды.

Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 30 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 30 минут при 6000 об./мин, стерилизовали надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм и пропускали полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.

Полученный очищенный фаголизат в виде элюата содержал бактериофаги в титре 1013 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 единиц эндотоксина на 1 мл очищенного фаголизата (ЕЭ/мл).

Пример 2. Для получения бактериофага, активного в отношении Escherichia coli O104:H4, бактериальную культуру непатогенного штамма-хозяина - Escherichia coli К 12 С600 - в титре 109 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.

Штамм-хозяин культивировали в течение 3,2 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Escherichia coli К12 С600 засевали маточный бактериофаг в титре 106 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 14 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с pH 7,0 в количестве 0,042 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды.

Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 40 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 40 минут при 5500 об./мин.

Для получения бактериофага, активного в отношении Listeria monocytogenes, бактериальную культуру непатогенного штамма-хозяина - Listeria innocua - в титре 109 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.

Штамм-хозяин культивировали в течение 3 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Listeria innocua засевали маточный бактериофаг в титре 105 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+22°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с pH 7,2 в количестве 0,045 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды.

Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 45 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 45 минут при 5000 об./мин.

Смешивали надосадочные жидкости двух полученных фаголизатов.

Смесь надосадочных жидкостей стерилизовали фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и пропускали полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.

Полученная очищенная смесь (коктейль) фаголизатов в виде элюата содержала эшерихиозный бактериофаг в титре 101 БОЕ/мл и листериозный бактериофаг в титре 1011 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 ЕЭ/мл.

Пример 3. Для получения бактериофага, активного в отношении Salmonella enterica серовар Typhimurium, бактериальную культуру штамма-хозяина - Salmonella enterica серовар Typhimurium - в титре 108 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.

Штамм-хозяин культивировали в течение 3,5 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Salmonella enterica серовар Typhimurium засевали маточный бактериофаг в титре 105 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 13 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с pH 7,1 в количестве 0,042 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды.

Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 32 минуты при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 32 минуты при 6000 об./мин.

Для получения бактериофага, активного в отношении Listeria monocytogenes, бактериальную культуру непатогенного штамма-хозяина - Listeria innocua - в титре 109 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.

Штамм-хозяин культивировали в течение 3 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Listeria innocua засевали маточный бактериофаг в титре 105 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+24°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с pH 7,2 в количестве 0,045 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды.

Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 45 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 45 минут при 5000 об./мин.

Смешивали надосадочные жидкости двух полученных фаголизатов.

Смесь надосадочных жидкостей стерилизовали фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и пропускали полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.

Полученная очищенная смесь (коктейль) фаголизатов в виде элюата содержала сальмонеллезный бактериофаг в титре 1012 БОЕ/мл и листериозный бактериофаг в титре 1011 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 ЕЭ/мл.

Источник поступления информации: Роспатент

Всего документов: 87
18.07.2020
216.012.645f

Консорциум бифидобактерий для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок к пище, предназначенных для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет, и способ его получения, биологически активная добавка к пище для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет и бактериальный препарат для лечения дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет

Консорциум бифидобактерий содержит Bifidobacterium bifidum OV-19, В.bifidum 791, В.longum OV-20, В.longum Я-3, В.adolescentis ГО-13, используется для приготовления бактерийных препаратов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры людей старше 14 лет. Консорциум...

Вид РИД
Изобретение
Номер охранного документа
0002491332
Дата охранного документа
27.08.2013
Авторы и правообладатели
Показать авторов и правообладателей
18.07.2020
216.012.6460

Консорциум бифидобактерий для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок к пище, предназначенных для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта детей в возрасте до 3-х лет, и способ его получения, биологически активная добавка к пище для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта детей в возрасте до 3-х лет и бактериальный препарат для лечения дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта детей в возрасте до 3-х лет

Консорциум бифидобактерий содержит Bifidobacterium bifidum OV-19, В.bifidum 791, В.longum B379M, В.breve OV-12, В.infantis 73-15, используется для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры детей в возрасте до 3-х лет....

Вид РИД
Изобретение
Номер охранного документа
0002491333
Дата охранного документа
27.08.2013
Авторы и правообладатели
Показать авторов и правообладателей
18.07.2020
216.012.6463

Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры людей старше 14 лет, способ его получения, биологически активная добавка к пище для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет и бактериальный препарат для лечения дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет

Консорциум бифидобактерий и лактобацилл содержит Bifidobacterium bifidum OV-19, В.bifidum 791, В.longum OV-20, В.longum Я-3, В.adolescentis ГО-13, Lactobacillus helveticus К3ш24, L.helveticus NK-1, L.casei KHM-12, используется для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных...

Вид РИД
Изобретение
Номер охранного документа
0002491336
Дата охранного документа
27.08.2013
Авторы и правообладатели
Показать авторов и правообладателей
Всего документов: 107
18.07.2020
216.012.645f

Консорциум бифидобактерий для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок к пище, предназначенных для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет, и способ его получения, биологически активная добавка к пище для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет и бактериальный препарат для лечения дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет

Консорциум бифидобактерий содержит Bifidobacterium bifidum OV-19, В.bifidum 791, В.longum OV-20, В.longum Я-3, В.adolescentis ГО-13, используется для приготовления бактерийных препаратов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры людей старше 14 лет. Консорциум...

Вид РИД
Изобретение
Номер охранного документа
0002491332
Дата охранного документа
27.08.2013
Авторы и правообладатели
Показать авторов и правообладателей
18.07.2020
216.012.6460

Консорциум бифидобактерий для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок к пище, предназначенных для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта детей в возрасте до 3-х лет, и способ его получения, биологически активная добавка к пище для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта детей в возрасте до 3-х лет и бактериальный препарат для лечения дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта детей в возрасте до 3-х лет

Консорциум бифидобактерий содержит Bifidobacterium bifidum OV-19, В.bifidum 791, В.longum B379M, В.breve OV-12, В.infantis 73-15, используется для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры детей в возрасте до 3-х лет....

Вид РИД
Изобретение
Номер охранного документа
0002491333
Дата охранного документа
27.08.2013
Авторы и правообладатели
Показать авторов и правообладателей
18.07.2020
216.012.6463

Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры людей старше 14 лет, способ его получения, биологически активная добавка к пище для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет и бактериальный препарат для лечения дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет

Консорциум бифидобактерий и лактобацилл содержит Bifidobacterium bifidum OV-19, В.bifidum 791, В.longum OV-20, В.longum Я-3, В.adolescentis ГО-13, Lactobacillus helveticus К3ш24, L.helveticus NK-1, L.casei KHM-12, используется для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных...

Вид РИД
Изобретение
Номер охранного документа
0002491336
Дата охранного документа
27.08.2013
Авторы и правообладатели
Показать авторов и правообладателей

Похожие РИД в системе



Похожие не найдены