Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ НАСТУПЛЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для повышения частоты наступления беременности у групп высокого тромбогенного риска, нуждающихся в антикоагулянтной терапии в программе вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) при проведении экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Одной из актуальных проблем медицины является бесплодный брак, который по своей социальной значимости занимает одно из ведущих мест в современном акушерстве. В связи с этим большое распространение в мире получил метод лечения бесплодия путем ЭКО. При этом эффективность программы ЭКО по частоте наступления беременности остается в мире на уровне 30-40%. Неудачи ЭКО могут быть обусловлены многими факторами, однако к числу наиболее важных причин высокая тромбогенность самой репродуктивной технологии вследствие эстрогенгестагеновой гормональной нагрузки, наличии других (исходных, до ЭКО) факторов тромбогенного риска. В настоящее время нет точных и объективных лабораторных критериев для отбора женщин высокого тромбогенного риска, нуждающихся в гепаринотерапии для улучшения исходов ЭКО по частоте наступления беременности.

Известен способ выбора применения гепарина для профилактики тромботических осложнений (Патент №2408288 от 10.01.2011), который был предложен для снижения тромбогенности по уровню растворимых фибринмономерных комплексов при беременности.

Однако недостатком известного способа является то, что он не позволяет отобрать группу тромбогенного риска при проведении ЭКО.

Наиболее близким по достигаемому техническому результату является способ прогнозирования наступления беременности при проведении ЭКО (прототип), отражающий количество и качество ооцитов путем определения овариального резерва по измерению базального уровня фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), определяемого на 3-4-й день менструального цикла (Серов В.В., Прилепская В.Н., Овсянникова Т.В. Гинекологическая эндокринология. М: Медпресс-информ, 2006. - 528 с.).

Недостатком известного способа является низкая информативность в прогнозировании вероятности наступления беременности при проведении ЭКО.

Авторы предлагают способ определения высокого тромбогенного риска у беременных при проведении ЭКО, позволяющий повысить частоту наступления беременности.

Техническим результатом заявляемого способа является повышение информативности наступления беременности при проведении ЭКО.

Технический результат достигается тем, что определяют пиковую концентрацию тромбина в тесте генерации тромбина и при его значении свыше 360 нмоль/л беременную относят в группу высокого тромбогенного риска и за 2-3 дня до выполнения пункции фолликулов яичника проводят гепаринотерапию.

Способ осуществляют следующим образом

Заявляемый способ проиллюстрирован фигурами 1, 2 в виде таблиц.

На фигуре 1 представлены исходы ЭКО по динамике концентрации пика тромбина.

На фигуре 2 дана оценка результатов ЭКО в зависимости от динамики пика тромбина при лечении фраксипарином.

Кровь берут утром натощак из локтевой вены иглой без шприца (самотеком) и немедленно смешивают с 3,8% раствором цитрата натрия. Стабилизированную кровь до центрифугирования (в том числе и в процессе транспортировки) хранят при комнатной температуре (+18…+25°) не более 1 ч. Исследование крови со сгустками или гемолизом не допускается. Стабилизированную кровь центрифугируют на центрифуге, например «Eppendorf 581R», Германия, при 1000 об/мин (140-160 g) в течение 5-7 мин. Богатую тромбоцитами плазму с помощью пипетки переносят в другую пробирку, в которой ее дополнительно центрифугируют при 3000-4000 об/мин (1200-1400 g) в течение 15 минут, в результате получают бедную тромбоцитами плазму (БТП).

Материал для исследования и реактивы

БТП замораживают при температуре минус 40°-70°C на срок до 1 суток. Размораживают плазму на водяной бане при +37°C, после чего проводят исследование.

Исследование плазмы крови выполняют на планшетном флюориметре Fluoroskan Ascent «ThermoFisher SCIENTIFIC» (Финляндия), оснащенным диспенсером, с программным обеспечением «Thrombinoscope 3.0.0.26». В лунки 96-луночного планшета добавляют 20 мкл тканевого фактора (5 рМ), 20 мкл калибратора тромбина и 80 мкл исследуемой плазмы крови. Затем смесь инкубируют 10 мин. После инкубации смеси при температуре +37°C в лунки вносят 1000 мкл буфера, содержащий ионизированный кальций и флуорогенный субстрат. Образующийся тромбин расщепляет субстрат, в результате чего высвобождается флуорофор. Его излучение автоматически регистрируется через равные промежутки времени, причем интенсивность свечения пропорциональна концентрации образовавшегося тромбина. По данной кривой автоматически расчитывается пик тромбина (пиковая концентрация тромбина, нмоль/л) - максимальная концентрация тромбина в единицу времени.

В среднем, в норме уровень пика тромбина составляет 306,87±6,57 нмоль/л с пределами нормальных колебаний (±2σ) 276,87-336,87 нмоль/л. Апробация заявляемого способа включала в себя 2 этапа. На первом из них у 150 женщин с бесплодием (средний возраст 34,6±0,4 лет) определена динамика тромбогенности по концентрации пика тромбина: перед гормональной стимуляцией в цикле ЭКО, за 2-3 дня до выполнения пункции фолликулов и на 14 день после переноса эмбриона, в день определения наступления беременности по результатам ХГЧ и проанализирована частота наступления беременности (фигура 1). Результаты первого этапа показали, что у 52 женщин при наступлении беременности концентрация пика тромбина была 334,32±4,65, у 98 женщин беременность не наступила, пиковая концентрация тромбина была выше 360 нмоль/л, тогда как в контроле эти показатели не превышали 360 нмоль/л.

На втором этапе была сформирована группа высокого тромбогенного риска, состоящая из 19 женщин (средний возраст 33,1±0,7 лет) в процессе проведения процедуры ЭКО, у которых концентрация пика тромбина за 2-3 дня до пункции фолликулов яичников превышала 360 нмоль/л (фигура 2). Апробация заявляемого способа проведена на этих 19 пациентках, которым в связи с высоким пиком тромбина, более 360 нмоль/л, в течение 12-14 дней (после подсадки эмбриона и до определения наступления беременности по результатам ХГЧ) назначалась тромбопрофилактика лечебными дозами низкомолекулярных гепаринов: фраксипарин по 0,3 мл 2 раза в день подкожно в течение 14 дней. Как видно из фигуры 2, у 7 (36,8%) женщин при лечении лечебными дозами фраксипарина определено снижение пика концентрации тромбина в тесте генерации тромбина и у них наступила беременность по результатам ХГЧ. У 12 (63,1%) женщин снижения концентрации пика тромбина не произошло и беременность по показателям ХГЧ не наступила.

Клинический пример

Пациентка П.Н., 27 лет, обратилась 3.09.2011 г. в центр сохранения и восстановления репродуктивной функции Алтайской краевой клинической больницы по поводу бесплодия (трубного) для прохождения программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). У нее имелся регулярный менструальный цикл, противопоказаний к беременностям и родам не выявлено.

Для исследования системы гемостаза применялся тест генерации тромбина. Обследование проводилось в динамике, в образцах плазмы крови, полученных перед началом гормональной стимуляции (исходный фон - 1-й этап), за 2 дня до пункции яйцеклеток (2-й этап) и на 14 день после переноса эмбрионов (3-й этап). Анализы выполнялись на планшетном флюориметре Fluoroskan Ascent «ThermoFisher SCIENTIFIC».

До вхождения в цикл ЭКО (1-й этап) пиковая концентрация тромбина у женщины составила 340,22 нмоль/л (при норме 306,87±6,57 нмоль/л). На втором этапе наблюдений, перед пункцией яйцеклеток, значения пика тромбина оказалось равным 386,62 нмоль/л (при норме 346,32±4,65 нмоль/л).

С учетом полученных данных больной назначен курс лечения фраксипарином по 0,3 мл ×2 раза в день, в течение двух недель. На фоне проводимой гепаринотерапии в конце цикла ЭКО, на 3-м этапе наблюдений, пик тромбина составил 320,20 нмоль/л и соответствовал пределам нормальных колебаний данного показателя, что сопровождалось успешным наступлением беременности.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при концентрации тромбина свыше 360 нмоль/л (за 2-3 дня до выполнения пункции фолликулов яичника) необходимо назначение гепаринотерапии в лечебных дозах для повышения частоты наступления беременности при проведении экстракорпорального оплодотворения.

Таким образом, заявляемый способ определения высокого тромбогенного риска у беременных при проведении экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) обладает высокой информативностью и может быть использован в акушерстве и гинекологии.