Результат интеллектуальной деятельности: ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ И НЕКРОБАКТЕРИОЗА ЖИВОТНЫХ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЕЕ

Изобретение относится к области ветеринарии и биотехнологии и касается получения вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных.

Известна вакцина для профилактики некробактериоза рогатого скота, содержащая в равных объемных соотношениях инактивированные формалином эндотоксин и экзотоксин, полученные из местных эпизоотических культур возбудителя некробактериоза, и адъювант на основе минерального масла и ланолина (Патент RU 1816348, А61К 39/00, 1995).

Однако известная вакцина не достаточно иммуногенна, так как требует двукратного введения и обеспечивает иммунитет только против некробактериоза в течение 3,5-4 мес. Кроме того, при получении вакцины осуществляют предварительный подбор местных штаммов для каждого конкретного хозяйства, что невозможно при промышленном производстве.

Известна вакцина против сибирской язвы животных, содержащая суспензию живых спор бескапсульного авирулентного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы (ТУ 9388-004-00008064-99). Известна также инактивированная вакцина против некробактериоза животных, содержащая инактивированные формалином эндотоксин и экзотоксин, полученные из производственного штамма "0-1" ВИЭВ возбудителя некробактериоза, и адъювант на основе минерального масла и ланолина (Патент RU 2109519, А61К 39/02, 1998).

Существующие моновакцины применяют независимо друг от друга и не создают иммунитет у животных одновременно против сибирской язвы и некробактериоза. Использование этих вакцин в отдельности требует удвоенного количества трудозатрат и оказывает более сильное стрессовое состояние животных.

Известна ассоциированная вакцина против сибирской язвы, анаэробной дизентерии и инфекционной энтеротоксемии овец, содержащая суспензию жизнеспособных спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ в исходной концентрации (3-4)×10⁸ спор в 1 см³, анатоксины Cl. perfringens типов С с исходной активностью 100-150 ЕС в 1 см³ и Д с исходной активностью 60-80 ЕС в 1 см³ и физиологический раствор (Патент RU №2191599, МПК⁷ А61К 39/116, 2002).

Однако известная ассоциированная вакцина не обеспечивает создание достаточного иммунитета против сибирской язвы и некробактериоза.

Известны также вакцина против сибирской язвы и некробактериоза, содержащая инактивированный формалином лейкоцидин - экзотоксин, полученный из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, представляющий собой высокоочищенный белок с молекулярной массой 18-20 кДа и адсорбированный на гидроокиси алюминия, а также суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ в физиологическом растворе и адъювант, причем инактивированный формалином лейкоцидин - экзотоксин адсорбирован 12-15% гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4-8,6, взятом в конечной концентрации 1,8-2,0%, суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ используют с исходной концентрацией (5-5,2)×10⁷ в 1 см³ физиологического раствора, а в качестве адъюванта содержит сапонин при определенном соотношении компонентов (Патент РФ №2480237, МПК А61К 39/116, опубл. БИ№10, 2013), и способ ее получения.

Задачей изобретения является повышение эффективности вакцины против сибирской язвы и некробактериоза за счет увеличения сроков иммунитета животных.

Технический результат изобретения достигается в вакцине против сибирской язвы и некробактериоза, содержащей инактивированный формалином лейкоцидин - экзотоксин, полученный из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, представляющий собой высокоочищенный белок с молекулярной массой 18-20 кДа и адсорбированный на гидроокиси алюминия, а также суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ в физиологическом растворе и адъювант, отличающейся тем, что суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ используют с исходной концентрацией (2,5-3,0)×10⁷ в 1 см³ физиологического раствора, дополнительно содержит 1-10% инактивированной бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием 7,0-7,7 млрд клеток в 1 см, глицерин и смесь минерального масла Маркол-52 и эмульгатора, взятых в весовых соотношениях 1:(0,9-1,1), соответственно при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Технический результат изобретения достигается также в вакцине против сибирской язвы и некробактериоза, отличающейся тем, что в качестве эмульгатора содержит эмульгатор-139 или оксиэтилированный С₇-С₁₀ алкилфенол.

Технический результат изобретения достигается также в способе получения вакцины против сибирской язвы и некробактериоза путем культивирования штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, инактивирования его формалином, отделения бактериальной массы от культуральной жидкости центрифугированием, выделения из культуральной жидкости экзотоксина - лейкоцидина, его очистки, концентрирования ультрафильтрацией на полых волокнах и адсорбции на гидроокиси алюминия в гликолевом буфере, добавления суспензии живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и сапонина, отличающемся тем, что перед адсорбцией на гидроокиси алюминия к экзотоксину добавляют 1-10% инактивированной бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием 7,0-7,7 млрд клеток в 1 см³, а глицерин и смесь минерального масла Маркол-52 и эмульгатора, взятых в весовых соотношениях 1:(0,9-1,1), соответственно, добавляют после добавления сапонина.

Известно использование в качестве адъюванта смеси Маркола-52 с эмульгатором-139 в соотношении 9:1 (Патент RU №2337706, МПК А61К 39/00, бюл. №31, опубл. 10.11.2008).

Известно также использование в качестве эмульгатора ОП-7 и ОП-10 (ГОСТ 8433-81, Патент RU №2134964, МПК А01N 25/00, опубл. 27.08.1999) - оксиэтилированные С₇-С₁₀ алкилфенолы, используются для приготовления концентрированных эмульсий нерастворимых в воде ингредиентов.

Ассоциированную вакцину вводят однократно крупному рогатому скоту, овцам, козам, свиньям и северным оленям внутрикожно при помощи безыгольного инъектора в объеме 0,2-0,4 см³.

Предлагаемая ассоциированная вакцина против сибирской язвы и некробактериоза создает длительный иммунитет у привитых животных, при этом по иммуногенности она превосходит известную вакцину против сибирской язвы и некробактериоза. Вакцина безвредна и авирулентна для лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Вакцину против сибирской язвы и некробактериоза готовят следующим образом.

Пример 1. Для получения некробактериозного антигена - лейкоцидин - экзотоксин берут производственный штамм Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, культивируют, инактивируют формалином в конечной концентрации 0,4%, отделяют бакмассу от культуральной жидкости центрифугированием, из культуральной жидкости выделяют экзотоксин, подвергают его высокой очистке ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 13-17 кДа и концентрируют до содержания белка (по Лоури) 5,5-7,0 мг% с молекулярной массой 18-20 кДа. Далее к полученному антигену - лейкоцидин - эндотоксин добавляют 1-10% инактивированной бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием 7,0-7,7 млрд клеток в 1 см³, затем сорбируют на 12-15% гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4-8,6, взятой в конечной концентрации 1,8-3,0%. После сорбции антигена на гидрате окиси алюминия проверяют нейтрализацию остаточного количества формалина.

К 54,0 г инактивированного формалином лейкоцидина - экзотоксина с м.м. 18-20 кДа из штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием белка 5,5 мг%, адсорбированного 12% гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4, взятой в конечной концентрации 1,8%, добавляют 1,0 г суспензии живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией (2,5-3,0)×10⁷ в 1 см³ физиологического раствора, 10,0 г сапонина, 20,0 г глицерина и 15,0 г смеси минерального масла Маркол-52 и эмульгатора-139, взятых в весовых соотношениях 1:0,9, получая состав 1 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Вакцину эмульгируют в гомогенизаторе при 3500 об/мин в течение 15 мин.

Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета.

Пример 2. Для получения некробактериозного антигена - лейкоцидин - экзотоксин берут производственный штамм Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, культивируют, инактивируют формалином в конечной концентрации 0,4%, отделяют бакмассу от культуральной жидкости центрифугированием, из культуральной жидкости выделяют экзотоксин, подвергают его высокой очистке ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 13-17 кДа и концентрируют до содержания белка (по Лоури) 5,5-7,0 мг% с молекулярной массой 18-20 кДа. Далее к полученному антигену - лейкоцидин - эндотоксин добавляют 1-10% инактивированной бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием 7,0-7,1 млрд клеток в 1 см³, затем сорбируют на 12-15% гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4-8,6, взятой в конечной концентрации 1,8-3,0%. После сорбции антигена на гидрате окиси алюминия проверяют нейтрализацию остаточного количества формалина.

К 33,8 г инактивированного формалином лейкоцидина - экзотоксина с м.м. 18-20 кДа из штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием белка 7,0 мг%, адсорбированного 15% гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4-8,6, взятой в конечной концентрации 3,0%, добавляют 1,2 г суспензии живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией (2,5-3,0)×10⁷ в 1 см³ физиологического раствора, 15 г сапонина, 30,0 г глицерина и 20,0 г смеси минерального масла Маркол-52 и эмульгатора-139, взятых в весовых соотношениях 1:1,1, получая состав 2 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Вакцину эмульгируют в гомогенизаторе при 5000 об/мин в течение 20 мин.

Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета.

Пример 3. Для получения некробактериозного антигена - лейкоцидин - экзотоксин берут производственный штамм Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, культивируют, инактивируют формалином в конечной концентрации 0,4%, отделяют бакмассу от культуральной жидкости центрифугированием, из культуральной жидкости выделяют экзотоксин, подвергают его высокой очистке ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 13-17 кДа и концентрируют до содержания белка (по Лоури) 5,5-7,0 мг% с молекулярной массой 18-20 кДа. Далее к полученному антигену - лейкоцидин - эндотоксин добавляют 1-10% инактивированной бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием 7,0-7,7 млрд клеток в 1 см³, затем сорбируют на 12-15% гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4-8,6, взятой в конечной концентрации 1,8-3,0%. После сорбции антигена на гидрате окиси алюминия проверяют нейтрализацию остаточного количества формалина.

К 54,0 г инактивированного формалином лейкоцидина - экзотоксина с м.м. 18-20 кДа из штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием белка 5,5 мг%, адсорбированного 12% гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4, взятой в конечной концентрации 1,8%, добавляют 1,0 г суспензии живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией (2,5-3,0)×10⁷ в 1 см³ физиологического раствора, 10,0 г сапонина, 20,0 г глицерина и 15,0 г смеси минерального масла Маркол-52 и ОП-7, взятых в весовых соотношениях 1:0,9, получая состав 3 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Вакцину эмульгируют в гомогенизаторе при 3500 об/мин в течение 15 мин.

Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета.

Пример 4. Для получения некробактериозного антигена - лейкоцидин - экзотоксин берут производственный штамм Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, культивируют, инактивируют формалином в конечной концентрации 0,4%, отделяют бакмассу от культуральной жидкости центрифугированием, из культуральной жидкости выделяют экзотоксин, подвергают его высокой очистке ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 13-17 кДа и концентрируют до содержания белка (по Лоури) 5,5-7,0 мг% с молекулярной массой 18-20 кДа. Далее к полученному антигену - лейкоцидин - эндотоксин добавляют 1-10% инактивированной бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием 7,0-7,7 млрд клеток в 1 см³, затем сорбируют на 12-15% гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4-8,6, взятой в конечной концентрации 1,8-3,0%. После сорбции антигена на гидрате окиси алюминия проверяют нейтрализацию остаточного количества формалина.

К 33,8 г инактивированного формалином лейкоцидина - экзотоксина с м.м. 18-20 кДа из штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием белка 7,0 мг%, адсорбированного 15% гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4-8,6, взятой в конечной концентрации 3,0%, добавляют 1,2 г суспензии живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией (2,5-3,0)×10⁷ в 1 см³ физиологического раствора, 15 г сапонина, 30,0 г глицерина и 20,0 г смеси минерального масла Маркол-52 и ОП-7, взятых в весовых соотношениях 1:1,1, получая состав 4 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Вакцину эмульгируют в гомогенизаторе при 5000 об/мин в течение 20 мин.

Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета.

Пример 5. Для получения некробактериозного антигена - лейкоцидин - экзотоксин берут производственный штамм Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, культивируют, инактивируют формалином в конечной концентрации 0,4%, отделяют бакмассу от культуральной жидкости центрифугированием, из культуральной жидкости выделяют экзотоксин, подвергают его высокой очистке ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 13-17 кДа и концентрируют до содержания белка (по Лоури) 5,5-7,0 мг% с молекулярной массой 18-20 кДа. Далее к полученному антигену - лейкоцидин - эндотоксин добавляют 1-10% инактивированной бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием 7,0-7,7 млрд клеток в 1 см³, затем сорбируют на 12-15% гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4-8,6, взятой в конечной концентрации 1,8-3,0%. После сорбции антигена на гидрате окиси алюминия проверяют нейтрализацию остаточного количества формалина.

К 54,0 г инактивированного формалином лейкоцидина - экзотоксина с м.м. 18-20 кДа из штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием белка 5,5 мг%, адсорбированного 12% гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4, взятой в конечной концентрации 1,8%, добавляют 1,0 г суспензии живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией (2,5-3,0)×10⁷ в 1 см³ физиологического раствора, 10,0 г сапонина, 20,0 г глицерина и 15,0 г смеси минерального масла Маркол-52 и ОП-10, взятых в весовых соотношениях 1:0,9, получая состав 5 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Вакцину эмульгируют в гомогенизаторе при 3500 об/мин в течение 15 мин.

Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета.

Пример 6. Для получения некробактериозного антигена - лейкоцидин - экзотоксин берут производственный штамм Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, культивируют, инактивируют формалином в конечной концентрации 0,4%, отделяют бакмассу от культуральной жидкости центрифугированием, из культуральной жидкости выделяют экзотоксин, подвергают его высокой очистке ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 13-17 кДа и концентрируют до содержания белка (по Лоури) 5,5-7,0 мг% с молекулярной массой 18-20 кДа. Далее к полученному антигену - лейкоцидин - эндотоксин добавляют 1-10% инактивированной бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием 7,0-7,7 млрд клеток в 1 см³, затем сорбируют на 12-15% гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4-8,6, взятой в конечной концентрации 1,8-3,0%. После сорбции антигена на гидрате окиси алюминия проверяют нейтрализацию остаточного количества формалина.

К 33,8 г инактивированного формалином лейкоцидина - экзотоксина с м.м. 18-20 кДа из штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием белка 7,0 мг%, адсорбированного 15% гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4-8,6, взятой в конечной концентрации 3,0%, добавляют 1,2 г суспензии живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией (2,5-3,0)×10⁷ в 1 см³ физиологического раствора, 15 г сапонина, 30,0 г глицерина и 20,0 г смеси минерального масла Маркол-52 и ОП-10, взятых в весовых соотношениях 1:1,1, получая состав 6 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Вакцину эмульгируют в гомогенизаторе при 5000 об/мин в течение 20 мин.

Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета.

Пример 7. Полученные по примерам 1-6 составы 1-6 применяют для профилактических и вынужденных прививок клинически здоровых животных однократно. Молодняк, не достигший 3-месячного возраста, прививать ассоциированной вакциной не разрешается. Вакцину вводят внутрикожно с помощью безыгольного инъектора в бесшерстный участок тела крупному рогатому скоту и свиньям по 0,4 см³ (2 раза по 0,2 см³), овцам, козам и северным оленям по 0,2 см.

Устойчивость к заражению сибирской язвой и некробактериозом сохраняется до 1,5 лет, что в 1,5 раза длительней, чем известная вакцина (полученная по прототипу) - что подтверждают данные таблицы.

Таблица. Сравнительная характеристика показателей иммуногенности известной и предлагаемой вакцины против сибирской язвы и некробактериоза через 1.5 года после вакцинации оленей в республике Саха (Якутия).

Таким образом, ассоциированная вакцина против сибирской язвы и некробактериоза является высокоэффективным препаратом, способным более длительно защитить животных одновременно от сибирской язвы и некробактериоза.