Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПЕРИММУННОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ АНАЭРОБНОЙ ЭНТЕРОТОКСЕМИИ И ЭШЕРИХИОЗНОЙ ДИАРЕИ ТЕЛЯТ

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности к способу получения гипериммунной сыворотки против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят.Сыворотка предназначена для лечения и пассивной иммунопрофилактики анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят.

Желудочно-кишечные болезни сельскохозяйственных животных занимают одно из ведущих мест по частоте, массовости проявления и величине наносимого хозяйствам экономического ущерба вследствие высокой заболеваемости и падежа молодняка, недополучения привеса, а также больших затрат на лечебно-профилактические мероприятия.

В этиологии этих болезней в большинстве случаях регистрируется ассоциация бактерий: эшерихий коли, сальмонелл, стрептококков, клостридий, протея и других (Пирожков М.К., Ленев С.В., Викторова Е.В. и др. Диагностика, специфическая профилактика и лечение при бактериальных болезнях животных // Ветеринария. - 2011. - №1. - С.24-28.; Шахов А.Г. Этиология и профилактика желудочно-кишечных и респираторных болезней телят и поросят // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. Материалы межд. научн.-практ. конф. - Воронеж, 2002, С.3-8).

Анализ литературных данных и результаты многолетних исследований сотрудников нашего центра свидетельствуют о том, что в хозяйствах, стационарно неблагополучных по желудочно-кишечным болезням, анаэробная энтеротоксемия у телят наиболее часто проявляется в виде смешанной инфекции с эшерихиозом (Казимир А.Н. Эпизоотология, этиология, фаготерапия и специфическая профилактика анаэробной энтеротоксемии телят в хозяйствах Ульяновсой области: автореф. дис. канд. вет. наук. - Казань, 1997. - 22 с.; Салимов В.А. Патологоанатомическая и дифференциальная диагностика эшерихиозов, сальмонеллезов, пастереллезов, анаэробных энтеротоксемий, кандидамикоза, их ассоциаций и осложнений у молодняка сельскохозяйственных животных. - М.: Колос, 2001. - 75 с.; Спиридонов Г.Н., Махмутов А.Ф., Хурамшина М.Т., Спиридонов А.Г. Инфекционная энтеротоксемия молодняка сельскохозяйственных животных в регионе Среднего Поволжья и Предуралья // Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири: Матер. науч.-практ. конф. - Краснообск, 2010. - С.134-139).

Анаэробную энтеротоксемию вызывают бактерии C1. perfringens, которых подразделяют на шесть типов: A, B, C, D, E, F, отличающихся друг от друга антигенной структурой и вырабатываемыми ими токсинами. У телят анаэробную энтеротоксемию вызывают возбудители серотипов A, C и D (Куриленко А.Н., Крупальник В.Л., Пименов Н.В. Бактериальные и вирусные болезни молодняка сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 2006. - 296 с.; Спиридонов А.Г. Разработка и оценка эффективности вакцины ассоциированной против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят: автореф. дис. канд. биолог. наук. - Казань, 2013. - 18 с.).

Эшерихиозную диарею вызывают энтеротоксигенные штаммы E. coli, синтезирующие адгезивные антигены K88, K99, 987P, F41, A20, Att25. У телят в более 80% случаях болезнь вызывается Е. coli, продуцирующими адгезивные антигены A20 и K99 (Гаффаров Х.З., Иванов А.В. и др. Моно- и смешанные инфекционные диареи новорожденных телят и поросят. - Казань: Изд-во «Фэн», 2002. - 592 с.; Зароза В.Г., Бурова Г.А., Буров В.Г. Возбудители колибактериоза животных и их лабораторная идентификация // Ветеринария. - 2008. - №3. - С.29-32).

В РФ разработана ассоциированная вакцина против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят на основе инактивированных антигенов бактерий CI. perfringens (серотипы A, С, Д) и Е. coli, синтезирующих адгезивные антигены К99, А20, а также их ТЛ- и ТС-анатоксинов. Вакцина предназначена для иммунизации глубокостельных коров и нетелей с целью создания колострального иммунитета у потомства через материнское молозиво, а также для иммунизации молодняка 18-20-и дневного возраста, полученных от иммунизированных маток (Патент РФ на изобретение №2428202 от 10.09.2011 г.). Антитела, полученные с молозивом матери, обеспечивают защиту новорожденных телят от заболеваний до тех пор, пока у них не выработаются собственные механизмы иммунитета. По различным причинам некоторые животные после рождения не получают в необходимом количестве эту естественную защиту, что связано с недостаточным поступлением антител с молозивом матери или нарушением механизма абсорбции иммуноглобулинов молозива кишечником новорожденных. Отмечено также, что не все животные по разным причинам после профилактической вакцинации приобретают достаточно напряженный иммунитет. Гипериммунная сыворотка также необходима для купирования свежих очагов инфекции. В связи с этим разработка гипериммунной сыворотки против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят является весьма актуальной. В настоящее время биопредприятиями Российской Федерации выпускаются несколько видов гипериммунных сывороток для специфической профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний телят: «Сыворотка антиадгезивная, антитоксическая против эшерихиоза сельскохозяйственных животных», «Поливалентная антитоксическая сыворотка против паратифа и колибациллеза телят, ягнят, овец и птиц» и др. (Справочник ветеринарных препаратов под редакцией П.П. Достоевского. - Киев. - Урожай. -1986. - С.248-250 Каталог лекарственных средств для животных, Торговый дом «Биопром». - М. - 2005. - С.191). Гипериммунная сыворотка, предназначенная для специфической терапии и пассивной иммунопрофилактики анаэробной энтеротоксемии телят, в РФ не разработана и биологической промышленностью не выпускается.

Известна сыворотка антиадгезивная, антитоксическая против эшерихиоза сельскохозяйственных животных, содержащая комплекс антител против соматических 09, 078, 0141, белковых адгезивных K88, K99, 987P, F41, полисахаридных капсульных K30, K80, K87 антигенов и консервант фенол (патент RU №2043772 C1, A61K 39/108, K 39/40, опуб. 20.09.1995 г.).

Основным недостатком этой сыворотки является узкий ее спектр действия из-за отсутствия в ее составе специфических антител против бактерий C1. perfringens - возбудителей анаэробной энтеротоксемии телят, часто проявляющих патогенное действие в ассоциации с бактериями E.coli. Следовательно, она не позволяет получить лечебно-профилактический эффект при анаэробной энтеротоксемии телят, а также при смешанном ее течении с эшерихиозом.

В связи с вышеизложенным изыскание эффективных средств специфической терапии и пассивной иммунопрофилактики анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят является актуальной задачей ветеринарной науки и практики.

Задачей изобретения является разработка способа получения гипериммунной сыворотки, обеспечивающей лечение и профилактику смешанной инфекции - анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят.

Поставленная задача решается тем, что способ получения гипериммунной сыворотки против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят включает гипериммунизацию быков-продуцентов инактивированными антигенами C1. perfringens, содержащими анатоксины и соматические антигены бактерий серотипов А, С и Д в культуральной среде при следующем соотношении компонентов на 1 л антигена: анатоксин и соматический антиген штамма №28 (тип А) в культуральной среде с концентрацией 9·10¹²-10·10¹² м.к. в 1 см³, см³ - 300,0-350,0; анатоксин и соматический антиген штамма №392 (тип С) в культуральной среде с концентрацией 9·10¹²-10·10¹² м.к. в 1 см³, см³ - 300,0-350,0; анатоксин и соматический антиген штамма №213 (тип Д) в культуральной среде с концентрацией 9·10¹²-10·10¹² м.к. в 1 см³, см³ -300,0-350,0; формалин, см³ - 4,0-5,0, проводят дополнительную гипериммунизацию быков-продуцентов инактивированными антигенами E.coli, содержащими соматические и адгезивные антигены K99, A20 в физиологическом растворе, ТЛ-, ТС-анатоксины E.coli в среде культивирования при следующем соотношении компонентов на 1 л антигена: соматический и адгезивный антиген штамма КВ-1 (K99) в физиологическом растворе с концентрацией 14·10¹²-15·10¹² м.к. в 1 см³, см³ - 300,0-350,0; соматический и адгезивный антиген штамма ПЗ-З (А20) в физиологическом растворе с концентрацией 14·10¹²-15·10¹² м.к. в 1 см³, см³ - 300,0-350,0; формалин, см³ - 4,0-5,0; термостабильные и термолабильные анатоксины штаммов Е.coli КВ-1 и ПЗ-З в культуральной среде с титрами в РДП 1:8-1:16, л. - до 1, а гипериммунизацию быков-продуцентов проводят четырехкратно путем подкожного введения дозы в область шеи с одной стороны антигена C1. perfringens и в область шеи с другой стороны - дозы антигена E.coli по следующей схеме: в первый день - по 8 см³, через 14 дней - по 10 см³, через 28 дней - по 15 см³ и через 42 дня - по 20 см³ с последующим взятием крови, отделением и консервированием полученной сыворотки.

Предлагаемые наборы антигенов позволяют получить высокоэффективную лечебно-профилактическую сыворотку с широким спектром действия против C1. perfringens (типы А, С, Д) и Е. coli (K99, A20). В качестве иммунизирующего антигена применяют любые из производственных или местных штаммов C1. perfringens серотипов А, С, Д, а также Е. coli, активно продуцирующие термостабильные и термолабильные токсины, а также адгезивные антигены K99 и A20.

Пример 1. Способ получения антигенов C1. perfringens.

В качестве производственных штаммов при получении гипериммунной сыворотки используют производственные штаммы C1. perfringens серотипа А (№28), серотипа С (№392) и серотипа Д (№213). Для получения анатоксинов и соматических антигенов производственные штаммы C1. perfringens №28, №392 и №213 выращивают отдельно на мясо-печеночно-казеиновой среде в реакторе в течение 6-8 часов при температуре 37-38°C до накопления не менее 4·10¹² м.к. в 1 см³. Проверяют токсичность выращенной культуры на белых мышах, которые должны погибнуть после внутрибрюшинного введения культуры в дозе 0,5 см³ в течение 24 ч.

В реактор с выращенной культурой добавляют формалин до 0,5%-ной концентрации, выдерживают 8 суток при температуре 37-38°C, затем вносят 6%-ный раствор гидроокиси алюминия до 5%-ной концентрации, выдерживают 3-5 суток и удаляют 2/3 от общего объема надосадочной жидкости, устанавливали pH 7,2-7,4. Полученные анатоксины и соматические антигены производственных штаммов, содержащие не менее 9·10¹²-10·10¹² м.к. в 1 см³, объединяют в равных соотношениях и используют для гипериммунизации быков-продуцентов.

Пример 2. Способ получения эшерихиозных антигенов.

В качестве производственных штаммов при получении гипериммунной сыворотки используют производственные энтеротоксигенные штаммы Е.coli: «KB-1» - синтезирующий адгезивный антиген К99, «ПЗ-3» -синтезирующий адгезивный антиген A20, вызывающие гибель белых мышей в течение 24 ч после внутрибрюшинного заражения в дозе 500 млн. м.к. Для получения бактериальной массы Е.coli используют мясопептонный агар (для штамма «ПЗ-З») и среду Минка (для штамма «КВ-1»). С этой целью указанные питательные среды разливают в матровые колбы по 300 см³ и стерилизуют при 0,5 атм. (110°C) в течение 15 минут. После застывания сред делают посев указанных культур. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37-38°C. Через 24 часа выросшие колонии культур Е.coli смывают 0,85%-ным стерильным раствором хлорида натрия, готовят суспензию в концентрации 14·10¹²-15·10¹² м.к. в 1 см³ по бактерийному или оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Инактивацию бактериальной взвеси осуществляют формалином. Для этого в взвесь добавляют формалин до 0,5% конечной концентрации и выдерживают 4-5 суток в термостате при температуре 37-38°C. Затем проверяют полноту инактивации путем посева на соответствующие питательные среды.

Для получения анатоксина каждый штамм Е.coli засевают отдельно в реактор с бульоном Хоттингера, выращивают 5-7 суток при температуре 37-38°C. Определяют концентрацию ТЛ-, ТС-токсинов в реакции диффузионной преципитации. Титр ТЛ-, ТС-токсинов в культуральной жидкости должен быть не менее 1:4-1:8. Затем к культуре добавляют формалин до 0,4-0,5% и выдерживают при температуре 37-38°C в течение 10-12 суток, затем добавляют 6%-ную гидроокиси алюминия до 5%-ной концентрации, выдерживают 3 суток и удаляют 2/3 общего объема надосадочной жидкости, устанавливают pH 7,2-7,4.

Пример 3. Гипериммунизация быков-продуцентов. Животных, предназначенных для гипериммунизации, карантинируют и подвергают исследованию и необходимой обработке против инфекционных болезней согласно действующей инструкции «О порядке заготовки и санитарной обработки животных, используемых для производства биопрепаратов». К эксплуатации допускают животных 18-24 мес. возраста с живой массой 350-400 кг.

Гипериммунизацию животных проводят по схеме, приведенной в таблице 1. При этом антиген C1. perfringens вводится подкожно в нарастающих дозах в область шеи с одной стороны, эшерихиозный антиген подкожно с другой стороны шеи.

Пример 4. Взятие и обработка крови.

Производственное взятие крови разрешается при наличии антител в сыворотке крови продуцентов к C1. perfringens в титрах не менее 1:12800 в ИФА, к эшерихиям, продуцирующим адгезивные антигены K99, A20 - не менее 1:1600 в РА, к термостабильному и термолабильному анатоксину Е.coli - не менее 1:8 в РДП и при условии, если общая температура тела животных не превышает 39,5°C, а также после предварительной выдержки животных на голодной диете в течение 12 ч при неограниченном водопое.

Кровь для получения сыворотки берут у быков-продуцентов в убойном цехе мясокомбината при помощи закрытой системы, исключающей контакт крови с атмосферным воздухом. Система включает в себя полый нож длиной 40 см, диаметром 3,5 см из нержавеющей стали, соединенный герметично через силиконовый шланг и резиновую пробку с 10-литровой бутылью, которая сообщается с атмосферным воздухом через ватный фильтр. Предварительно в бутыли наливают 100 см³ 5%-ного раствора натрия хлорида, после чего система монтируется и автоклавируется при 1,5 атм. в течение 40 минут. Взятие крови у животных производится непосредственно из сердца. После наполнения бутыли кровью примерно наполовину шланг перекрывается зажимом и нож вынимается из сердца. Бутыли с кровью в вертикальном положении оставляют при комнатной температуре на 1-2 ч до образования плотного сгустка, после чего их размешают под углом 30° в холодильную камеру при температуре 2-4°C. Отстой сыворотки продолжается 48-72 ч. Сыворотку из бутылей отсасывают над пламенем горелки при помощи изогнутой стеклянной трубки длиной 45-50 см, диаметром 1 см, которая посредством силиконового шланга соединена с емкостью, в которую собирают сыворотку. В емкости для сбора сыворотки создается отрицательное давление отсасывающим компрессором. Эта система также стерильна, закрытого типа. Собранную сыворотку сначала пропускают через глубинные фильтры EKS 1 или EKS 2, консервируют 5%-ным раствором фенола до концентрации его в общем объеме сыворотки 0,5%. После этого сыворотку перекачивают в отстойник и выдерживают 2-2,5 месяца при 2-4°C. Затем сыворотку пропускают через мембранные миллипоровые фильтры с убывающим размером пор (от 1,2 до 0,22 мкм) и разливают в стеклянные флаконы по 100-200 см³, закрывают резиновыми пробками, обкатывают алюминиевыми колпачками, этикетируют.

Пример 5. Контроль сыворотки на внешний вид, стерильность, безвредность и активность.

Для определения внешнего вида, цвета, наличия посторонних примесей, не разбивающихся хлопьев, герметичности укупорки все флаконы с сывороткой встряхивают, просматривают в проходящем свете и переворачивают пробками вниз.

Стерильность проверяют путем высева сыворотки на МПА, МПБ, Сабура, регенерированную среду Китта-Тароцци. Посевы выдерживают при 37-38°C. Через 48 ч из жидких сред делают пересевы на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом. Первичные посевы выдерживают 10, вторичные -8 суток. Роста на питательных средах не должно быть.

Безвредность сыворотки проверяют на 10 белых мышах, которым препарат вводят подкожно в дозе 0,5 см³. Сыворотку считают безвредной, если все животные остаются клинически здоровыми в течение 10 суток.

Уровень содержания специфических антител в гипериммунной сыворотке проверяют к C1. perfringens в ИФА, к Е.coli в РА, к ТЛ- и ТС-токсинам Е.coli в РДП. Показатели специфической активности экспериментальных серий гипериммунной сыворотки приведены в табл.2.

Превентивные свойства гипериммунной сыворотки изучают на 100 белых мышах с массой 14-16 г, разделенных на 2 группы по 50 гол в каждой. Мышей первой группы иммунизируют гипериммунной сывороткой, полученной от быков-продуцентов, мыши второй группы служат контролем, т.е. сыворотка им не вводятся. Сыворотку вводят мышам 1 группы подкожно, введя каждой белой мыши по 0,5 см свежеприготовленной сыворотки, взятой в равном объеме от пяти быков. Заражение мышей проводят внутрибрюшинно через 24 ч после введения сыворотки подтитрованными смертельными дозами Е.coli (K99 и A20) и C1. perfringens (серотипы А, С и Д). Результаты этих исследований представлены в таблице 3.

Пример 6. Производственное испытание экспериментальных серий гипериммунной сыворотки.

За 2011-2012 г в лаборатории по изучению болезней молодняка ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» изготовлено 4 серии сыворотки в количестве 115 л. Результаты лабораторного контроля сыворотки показали, что все ее серии были стерильны, безвредны, ареактогенны и обладали выраженными лечебно-профилактическими свойствами.

Оценка лечебно-профилактической эффективности полиспецифической гипериммунной сыворотки проводилась в 2 скотоводческих хозяйствах Республики Татарстан, неблагополучных по анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят. С профилактической целью новорожденным телятам сыворотку вводили внутримышечно дозе 2 см³ на 1 кг массы тела. С лечебной целью сыворотку применяли внутримышечно в дозе 2,5 см³ на 1 кг массы тела. При тяжелом течении болезни сыворотку вводили повторно через 1-3 дня в тех же дозах внутрибрюшинно. Суточную лечебную дозу сыворотки вводили в 2 приема с интервалом 6 часов.

Результаты производственного испытания сыворотки представлены в таблицах 4 и 5, из которых следует, что гипериммунная сыворотка обладает выраженными лечебно-профилактическими свойствами. Так, например, в группе телят, обработанной гипериммунной сывороткой, заболело всего 29,6%, пало 5,7% телят, тогда как в контрольной (интактной) группе эти показатели составили 82,7% и 17,3% соответственно. При этом сохранность телят в опытной группе составила 94,3% против 82,7% в контрольной группе. Применение сыворотки в лечебных дозах позволило вылечить 93,0% больных телят, тогда как в контрольной группе, где в качестве лечебных средств применялись антибиотики и сульфаниламидные препараты, сохранность телят составила лишь 79,4%, что на 13,6% ниже, чем в опытной группе.

Пример 7. Общие сведения, биологические свойства, порядок применения сыворотки гипериммунной против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят.

Общие сведения.

Сыворотка представляет собой прозрачную, слегка опалесцирующую жидкость желтовато-красного цвета. На дне флаконов, особенно при длительном хранении, выпадает незначительный белковый осадок, который при встряхивании легко разбивается в равномерную взвесь. Сыворотку расфасовывают по 100 и 200 см³ во флаконы стеклянные соответствующей вместимости, укупоривают резиновыми пробками, обкатывают алюминиевыми колпачками и этикетируют. На этикетке указывают: наименование организации-производителя, ее адрес и товарный знак, название сыворотки, количество во флаконе, дозу и способ применения, условия хранения, номер серии, номер госконтроля, дату изготовления (месяц, год), срок годности, обозначения ТУ, регистрационный номер, надпись «Для ветеринарного применения».

Флаконы с сывороткой упаковывают в ящики из фанеры, для обеспечения целостности флаконы обертывает бумагой или алигнином, в холодное время года - ватой или другими теплоизолирующими материалами. Внутрь каждого ящика вкладывают 3 экз. инструкции по применению сыворотки.

На упаковку с флаконами (транспортная тара) наклеивают этикетку, на которой указывают: наименование ведомства, наименование организации-производителя, ее адрес и товарный знак, название препарата, его количества в ящике, объем сыворотки во флаконе, номер серии, номер контроля, дату изготовления (месяц, год), срок годности, обозначение технических условий, регистрационный номер, надпись «Для ветеринарного применения».

Сыворотку транспортируют и хранят в сухом, защищенном от света месте при температуре от 4 до 8°C. Срок годности препарата 2 года со дня изготовления при соблюдении условий транспортировки и хранения.

Сыворотку с нарушенной целостностью флакона и подвергшихся замораживанию, без этикеток, наличием посторонних примесей, а также не использованную в день вскрытия флакона выбраковывают.

Биологические свойства.

Сыворотка получена из крови быков-продуцентов, гипериммунизированных инактивированными антигенами C1. perfringens (типы А, С, Д) и Е.coli (K99, A20)

У животных, привитых сывороткой, иммунитет формируется через сутки и сохраняется в течение 12-14 дней.

Порядок применения сыворотки.

Сыворотку применяют с профилактической и лечебной целью в угрожаемых и стационарно неблагополучных хозяйствах по анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят.

Перед применением флаконы с сывороткой необходимо тщательно встряхивать и подогревать в водяной бане до 37-38°C.

С профилактической целью новорожденным телятам сыворотку вводят внутримышечно дозе 2 см³ на 1 кг массы тела.

С лечебной целью сыворотку применяют внутримышечно в дозе 2,5 см³ на 1 кг массы тела. При тяжелом течении болезни сыворотку вводят повторно через 1-3 дня в тех же дозах внутрибрюшинно. Суточную лечебную дозу сыворотки следует вводить в 2-3 приема с интервалом 3-4 ч, что обеспечивает лучший терапевтический эффект.

При введении сыворотки необходимо соблюдать правила асептики и антисептики. Место введения сыворотки дезинфицируют 70% раствором этилового спирта. Шприцы и иглы перед применением стерилизуют кипячением, для каждого животного используют отдельную иглу. Наряду с применением сыворотки необходимо проводить в хозяйстве ветеринарно-санитарные мероприятия, направленные на уничтожение инфекционного начала.

Меры личной профилактики.

При применении сыворотки необходимо соблюдать правила личной гигиены, принятые при работе с лекарственными средствами. В местах работы должна находиться аптечка для оказания первой доврачебной помощи.

В случае попадания сыворотки на открытые участки тела или слизистые оболочки глаз, рта, носа и после окончания работы руки и другие открытые участки тела моют водой с мылом.

Сыворотка по истечении срока годности применению не подлежит.

Сыворотку следует хранить в местах, недоступных для детей.