СПОСОБ СИНТЕЗА N-ЗАМЕЩЕННЫХ АКРИЛАМИДОВ И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Rhodococcus erythropolis ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ (ВАРИАНТЫ)

Заявляемая группа изобретений относится к биотехнологии и касается рекомбинантных штаммов Rhodococcus erythropolis, а также способа синтеза N-замещенных акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида, с использованием клеток этих штаммов в качестве биокатализатора.

N-замещенные алифатические акриламиды находят широкое применение как мономеры для получения широкой гаммы водорастворимых полимеров, используемых в качестве флокулянтов, адсорбентов и структурообразователей в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства (Полиакриламид. - М., 1992).

Традиционный способ промышленного производства N-замещенных акриламидов осуществляют путем химического синтеза, основанного на ацилировании алифатических аминов хлорангидридами акриловой и метакриловой кислот (MacWilliams D.S. Functional monomers. Their preparation, polymerization, and application. New York: M.Decker, 1973). Недостатком такого способа является использование крайне ядовитых хлорангидридов, а также токсичных органических растворителей.

Альтернативным подходом к синтезу N-замещенных акриламидов является биокаталитический синтез, протекающий в водной среде. Известен способ биокаталитического синтеза N-замещенных акриламидов с помощью биокатализатора - клеток штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793, обладающих ацилирующей активностью (RU 2399672), обусловленной наличием в них фермента ациламидазы.

Штамм Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793 (RU 2399672) рассмотрим в качестве ближайшего аналога заявляемого штамма, а способ биокаталитического синтеза N-замещенных акриламидов с использованием в качестве биокатализатора клеток штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793 (RU 2399672) - в качестве ближайшего аналога заявляемого способа.

Недостатком штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793 является то, что его ацилирующая активность является индуцибельной, то есть требует наличия в среде культивирования дорогостоящего индуктора - ацетанилида. Это повышает стоимость и снижает конкурентоспособность способа - ближайшего аналога, основанного на использовании штамма ВКПМ Ас-1793 в качестве биокатализатора.

В патенте RU 2439154 представлена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК DAA37 из Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793, кодирующего фермент ациламидазу. Эти сведения открыли перспективы для конструирования более совершенных биокатализаторов с ацилирующей активностью методами генетической инженерии.

Задачей заявляемой группы изобретений является создание рекомбинантных штаммов Rhodococcus erythropolis, конститутивно синтезирующих ациламидазу и разработка биокаталитических способов синтеза N-замещенных акриламидов с использованием клеток этих штаммов в качестве биокатализатора.

Задача решена путем:

- разработки способа синтеза N-замещенных акриламидов с использованием в качестве биокатализатора бактерий Rhodococcus erythropolis с конститутивной ацилирующей активностью;

- конструирования штамма с конститутивной ацилирующей активностью Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ac-1937, путем введения фрагмента ДНК DAA37 в составе гибридной плазмиды p16-Ami в реципиентный штамм Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793 для осуществления заявляемого способа;

- конструирования штамма с конститутивной ацилирующей активностью Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938, путем введения фрагмента ДНК DAA37 в составе гибридной плазмиды p16-Ami в реципиентный штамм Rhodococcus erythropolis НХ7 ВКПМ Ас-1267 для осуществления заявляемого способа.

Штаммы Rhodоcoccus erythropolis, в которые введена плазмида с фрагментом ДНК DAA37 из Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793, приобретают конститутивную ацилирующую активность и способность синтезировать N-замещенные алифатические акриламиды. При смешивании водных растворов акриламида и аминов в присутствии клеток Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ac-1937 и Rhodococcus erythropolis HX7 p16-Ami ВКПМ Ac-1938 (используемых в качестве биокатализатора) происходит синтез N-замещенных акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида.

Характеристика заявляемых штаммов.

Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ac-193 7 является производным штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793, в который введена плазмида с фрагментом ДНК DAA37, кодирующим синтез ациламидазы. Штамм Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ac-1937 дополнительно приобрел маркер устойчивости к апрамицину.

Rhodococcus erythropolis HX7 p16-Ami ВКПМ Ac-1938 является производным штамма Rhodococcus erythropolis HX7 ВКПМ Ac-1267, в который введена плазмида с фрагментом ДНК DAA37, кодирующим синтез ациламидазы. Штамм Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938 дополнительно приобрел маркер устойчивости к апрамицину.

Оптимальные условия культивирования.

Для получения клеток заявляемых штаммов в больших количествах и с высокой активностью ациламидазы штаммы выращивают при 25-30°C в течение 24-72 часов на синтетических средах, содержащих в качестве источника углерода сахарозу, ацетат или мелассу в концентрациях 0.1-4%, а в качестве источника азота аммонийные или нитратные соли в концентрациях 0.4-2%.

Получение биокатализатора.

Клетки биокатализаторов - рекомбинантных штаммов Rhodococcus erythropolis, обладающие конститутивной ацилирующей активностью, получают следующим образом.

Посевной материал, представляющий собой культуру бактерий Rhodococcus erythropolis, несущих плазмиду p16-Ami, выращивают в жидкой среде Лурия Бертани (ЛБ), имеющей состав в мас.%: триптон 0,5, дрожжевой экстракт 0,25, NaCl 0,5, вода - остальное) с апрамицином 100-200 мкг/мл при 20-30°C до достижения оптической плотности 4-5 единиц при 540 нм. После инкубации в течение 24-30 часов клетки осаждают, промывают и используют в качестве биокатализатора.

Полученные клетки хранят и используют в виде водной суспензии, полученной путем отделения клеток от культуральной жидкости центрифугированием при 5-16 тыс. об/мин и последующим суспендированием в 10 мМ фосфатном буфере pH 7,0-8,0 до концентрации 20-40 г сухого веса/л.

Ацилирующую активность штаммов определяют по скорости синтеза N-изопропилакриламида по следующей методике:

Смешивают 300 мкл 10% водного раствора акриламида, 250 мкл 10% водного раствора изопропиламина (pH 10), 450 мкл культуры. Инкубируют при 37°C 2 часа, отделяют клетки центрифугированием в течение 1 минуты при 10 тыс. об/мин, определяют содержание N-изопропилакриламида с помощью газовой хроматографии.

Активность культуры выражают в мМ ИПАА, синтезированного за 1 час на л культуры.

Отличительная особенность заявляемых штаммов состоит в их способности синтезировать фермент ациламидазу конститутивно, т.е. в отсутствие в среде известных индукторов, таких как ацетанилид (табл.1). При этом рекомбинатные штаммы Rhodococcus erythropolis проявляют более высокую активность, чем штаммы-реципиенты Rhodococcus erythropolis, не содержащие фрагмент ДНК DAA37, кодирующий синтез ациламидазы, в составе рекомбинантной плазмиды р16-Ami.

* выращен как в примере 4;

**выращен на средах следующего состава (мас.%):

среда с индуктором: ацетанилид-4, NH₄NO₃ - 2, K₂HPO₄*3H₂O - 7, KH₂PO₄ - 3, MgSO₄ - 0.5, FeSO₄ - 0.005, вода деионизированная - остальное;

среда без индуктора: сахароза - 4, NH₄NO₃ - 2, K₂HPO₄*3H₂O - 7, KH₂PO₄ - 3, MgSO₄ - 0.5, FeSO₄ - 0.005, вода деионизированная - остальное.

Способ синтеза N-замещенных акриламидов в общем виде

Синтез N-замещенных акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида, осуществляют смешиванием водных растворов акриламида и алифатических первичных аминов, в частности изопропиламина и диметиламинопропиламина, в концентрациях от 1% до 10% с суспензией биокатализатора (от 1 до 10 г клеток по сухой массе на 1 л реакционной смеси) в термостатируемом сосуде (при температуре от 20 до 40°C, предпочтительнее от 25 до 30°C) и последующим перемешиванием (от 100 до 250 об/мин) в течение 1-48 ч. Значение pH варьирует от 8,5 до 11, предпочтительнее от 9 до 11.

Содержание конечного продукта - N-замещенного акриламида определяют с помощью газовой хроматографии

Заявляемый способ позволяет получать растворы, содержащие от 1 до 20 г/л N-замещенных акриламидов.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды p16-Ami.

Рекомбинантная плазмида p16-Ami является производной плазмиды pN30, содержащей репликон для автономной репликации в родококках (Рябченко Л.Е., Новиков А.Д., Голышин П.Н., Яненко А.С. Определение нуклеотидной последовательности и структурный анализ криптической плазмиды pN30 из нефтеокисляющего штамма Rhodococcus erythropolis. Генетика, 2005, том 41, N12, стр.1725-1727), и плазмиды pBlueScript, содержащей репликон для автономной репликации в Е. coli (М.А. Alting-Mees, J.A. Sorge, J.M. Short. pBluescriptll: Multifunctional cloning and mapping vectors. Methods in Enzymology, Volume 216, 1992, Pages 483-495). Плазмида pl6-Ami также содержит ген ациламидазы из Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793 и регуляторную область гена нитрилгидратазы из штамма Rhodococcus rhodochrous М8 (Вейко В., Яненко А., Алексеева М., Синтин А., Гулько Л., Ратманова К., Овчарова И., Андреева Л., Астаурова О., Полякова И., Пауков В., Воронин С, Дебабов В. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности гена нитрилгидратазы из Rhodococcus rhodochrous М8. // Биотехнология. 1995. №5-6. С.3-5). Фрагменты ДНК, содержащие ген ациламидазы и регуляторную область получают с помощью ПЦР-амплификации. Для получения гена ациламидазы в качестве матрицы используется ДНК плазмиды pET16b-ami, в которой этот ген клонирован без флангов (RU 2439154), а в качестве праймеров - олигонуклеотиды, гомологичные концам гена ациламидазы с добавлением сайтов эндунуклеаз NcoI и EcoRI. Для получения фрагмента ДНК, содержащего регуляторную область гена нитрилгидратазы в качестве матрицы используют хромосому штамма М8, а в качестве праймеров - олигонуклеотиды, гомологичные концам регуляторной области гена нитрилгидратазы с добавлением сайтов эндунуклеаз PstI и Ncol.

Амплифицированные таким образом фрагменты ДНК вставляют в плазмиду pRY16 по сайтам PstI и EcoRI (фиг.1) и используют ее для трансформации реципиентного штамма Е. coli XL1 Blue. Полученные трансформанты устойчивы к ампициллину 100 мкг/мл, содержат плазмиду p16-Ami, включающую ген ациламидазы и регуляторную область нитрилгидратазы из Rhodococcus rhodochrous М8.

Пример 2. Конструирование заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ас-1937

Плазмиду p16-Ami, полученную как в примере 1, вводят в штамм Rhodococcus erythropolis 37 с помощью электротрансформации. Трансформанты, отобранные на среде ЛБ с апрамицином (100 мкг/мл) после инкубации чашек в течение 48 ч при 30°C, являются штаммом Rhodococcus erythropolis 37, содержащим плазмиду р16-Ami. Такой штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1937.

Пример 3. Конструирование заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ НХ7 p16-Ami Ас-1938

Плазмиду p16-Ami, полученную как в примере 1, вводят в штамм Rhodococcus erythropolis НХ7 с помощью электротрансформации. Трансформанты, отобранные на среде ЛБ с апрамицином (100 мкг/мл) после инкубации чашек в течение 48 ч при 30°C, являются штаммом Rhodococcus erythropolis НХ7, содержащим плазмиду p16-Ami. Такой штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1938.

Пример 4. Получение биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis pl6-Ami ВКПМ Ас-1937

В колбу Эрленмейера (объемом 750 мл), содержащую 100 мл среды ЛБ, содержащей апрамицин в концентрации 100 мкг/мл, добавляют 1 мл культуры (109кл/мл) штамма Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ас-1937, предварительно выращенного на той же среде в течение 16 ч при 30°C с перемешиванием (300 об/мин). Затем колбу инкубируют с перемешиванием (300 об/мин) в течение 36 ч при 30°C. Полученная таким образом культура заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ас-1937 обладает ацилирующей активностью 5 мМ ИПАА/мл*ч. Биомассу клеток отделяют центрифугированием при 5 тыс. об/мин и хранят при +4°C.

Пример 5. Получение биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938

В колбу Эрленмейера (объемом 750 мл), содержащую 100 мл среды ЛБ, содержащей апрамицин в концентрации 100 мкг/мл, добавляют 1 мл культуры (109 кл./мл) штамма Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938, предварительно выращенного на той же среде в течение 16 ч при 30°C с перемешиванием (300 об/мин). Затем колбу инкубируют с перемешиванием (300 об/мин) в течение 36 ч при 30°C. Полученная таким образом культура заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938 обладает ацилирующей активностью 5 мМ ИПАА/мл*ч. Биомассу клеток отделяют центрифугированием при 5 тыс. об/мин и хранят при +4°C.

Пример 6. Синтез N-изопропилакриламида с использованием биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ас-1937

Водные растворы акриламида и изопропиламина (pH 10) смешивают, затем к реакционной смеси добавляют суспензию клеток штамма Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ас-1937, полученную как в примере 4. Концентрации акриламида и изопропиламина в смеси составляют 6% и 3% соответственно. Концентрация биокатализатора в смеси составляет 8 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°C в течение 7 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин). Концентрацию N-изопропилакриламида в реакционной смеси определяют с помощью газовой хроматографии. Концентрация N-изопропилакриламида в полученном образце составляет 10 г/л.

Пример 7. Синтез N-изопропилакриламида с использованием биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938

Синтез осуществляют как в примере 7, но в качестве катализатора используют суспензию клеток штамма Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938, полученную как в примере 5. Концентрация полученного раствора N-изопропилакриламида составляет 10 г/л.

Пример 8. Синтез N-диметиламинопропилакриламида с использованием биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis 37 pl6-Ami ВКПМ Ас-1937

Водные растворы акриламида и диметиламинопропиламина (pH 10) смешивают, затем к реакционной смеси в качестве биокатализатора добавляют суспензию клеток штамма Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ас-1937, полученную как в примере 4. Концентрации акриламида и диметиламинопропиламина в смеси составляют 6% и 2.5% соответственно. Концентрация клеток в смеси составляет 8 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°C в течение 24 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин) и количество конечного продукта определяют методом газовой хроматографии. Концентрация полученного раствора N-диметиламинопропилакриламида составляет 2 г/л.

Пример 9. Синтез N-диметиламинопропилакриламида с использованием биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938

Синтез осуществляют как в примере 9, но в качестве биокатализатора используют суспензию клеток штамма Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938, полученную как в примере 5. Концентрация полученного раствора N-диметиламинопропилакриламида составляет 2 г/л.

Таким образом, заявляемый способ синтеза N-замещенных акриламидов дешевле и эффективнее способа - ближайшего аналога, так как основан на использовании в качестве биокатализатора рекомбинантных штаммов бактерий Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1937 или Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1938, которые обладают конститутивной ацилирующей активностью в 2,5 раза превосходящей уровень активности исходного штамма (который является штаммом - ближайшим аналогом) и не требуют при выращивании наличия в среде дорогостоящего индуктора - ацетанилида.