Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ РАПСА К ИНТЕНСИВНОМУ ХЛОРИДНОМУ ЗАСОЛЕНИЮ

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве при химической защите растений на открытом грунте или в сооружениях защищенного грунта; при химической защите растений от неблагоприятных факторов.

Большинство сельскохозяйственных угодий России находится в зоне рискованного земледелия с суровыми климатическими условиями. Засоление почв является одной из основных негативных проблем, приводящей к снижению продуктивности агро- и биоценозов, падению биоразнообразия и, как следствие, к значительным экономическим потерям (1. Kuznetsov Vl.V., Shevyakova N.I., 2010). Губительное воздействие засоления на растения обусловлено снижением водного потенциала почвенного раствора, что затрудняет доступность воды для растений; увеличением концентрации ионов и их токсическим действием на клеточный метаболизм, а также изменением структуры почвы, что приводит к снижению ее водопроницаемости и аэрируемости. Причинами засоления почвы могут быть начальное засоление материнской породы, наступление морской воды на прибрежные районы, использование солесодержащей воды для полива, ограниченный дренаж, низкий уровень осадков и высокий уровень испарения (2. Shahid S.A., Rahman К., 2011).

Изучение механизмов устойчивости растений к повреждающему действию абиотических факторов имеет важное значение для сохранения продуктивности агроценозов и является одной из фундаментальных проблем современной биологии. Рапс является ценной масличной культурой, представляющей большой практический интерес как растение пищевого и технического назначения. Повышение интенсивности засоления посевных площадей и относительно низкая солеустойчивость рапса делают его идеальной моделью для изучения путей повышения устойчивости к хлоридному засолению.

Среди эффективных способов защиты растений от хлоридного засоления можно отметить их обработку фитогормонами.

Известны способы повышения солеустойчивости растений окисленным крахмалсодержащим продуктом. Семена культурных растений (свеклы, рапса, сафлоры и сорго) замачивали в водном растворе пероксида водорода в концентрации 5·10^-4-1·10^-3 М (1,7·10^-2-3,4·10^-1 г/л) с последующим подсушиванием, затем семена обрабатывали полусухим методом 10-20%-ным водным раствором окисленного крахмалсодержащего продукта (ОКР), полученного окислением крахмалсодержащего сырья в щелочном растворе в присутствии медного катализатора и подсушивали до сыпучего состояния (3. Пат. RU 2445759. Способ повышения солеустойчивости растений (варианты), 2012).

Среди недостатков способа-аналога можно отметить то, что используемая концентрация действующего вещества - окисленного крахмалсодержащего продукта -очень высока - 10-20%, что экономически не выгодно. Анализируемая концентрация NaCl мала (от 85 мМ до 120 мМ). В случае с семенами рапса хлоридное засоление составляло 100 мМ, данная концентрация обычно не вызывает выраженного повреждения и, соответственно, не может вызывать значительные экономические потери. Кроме того, способ-аналог учитывает только процент выживших растений, не принимая в расчет их физиологическое состояние и продуктивность.

Известно, что опрыскивание растений перца раствором эпибрассинолида (ЭБЛ) при хлоридном засолении способствует частичному восстановлению ростовых показателей и снижению утечки электролитов через мембрану (4. Houimli S.M., Denden M., Mouhandes B.D., EurAsia J. BioSci. 2010. Vol.4. P.96-104, принято за прототип).

Основной недостаток способа-прототипа - использование высокой концентрации ЭБЛ 0,5 мг/л (~1 мкМ) при незначительном засолении 4 г/л NaCl (68 мМ). Действие NaCl и ЭБЛ на растения перца оценивали по ростовым показателям, утечке электролитов, содержанию хлорофиллов и пролина. Ряд других показателей, отражающий физиологическое состояние растений при засолении, не учитывали.

Задачей изобретения является разработка экономичного способа повышения устойчивости растений рапса к повреждающему действию интенсивного хлоридного засоления.

Поставленная задача решается тем, что в способе, включающем культивирование растений рапса в условиях хлоридного засоления и обработку растений раствором биологически активного вещества, через 3 недели культивирования растений рапса на жидкой питательной среде Хогланда-Снайдер растения подвергают засолению хлоридом натрия при концентрации приблизительно 175 мМ с двукратным внесением в раствор 24-эпибрассинолида в концентрации 10^-10 M, в первый день засоления и через 7 суток после засоления.

Сущность изобретения состоит в снижении негативного влияния интенсивного хлоридного засоления на растения рапса экологически чистым фитогормоном - 24-эпибрассинолидом.

В способе по изобретению растения рапса подвергают воздействию NaCl при концентрации в 2,5 раза выше, чем в способе-прототипе, а концентрация вещества с выраженным протекторным действием (эпибрассинолида) мала и составляет 10^-10 M, т.е. на три порядка ниже, чем в способе-прототипе, что отражает экономическую выгоду предложенного способа.

Эпибрассинолид является одним из брассиностероидов, обладающим высокой биологической активностью (5. Карначук Р.А., Головацкая И.О., Ефимова М.В. и др., 2002; 6. Ефимова М.В., Хасан Ж., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В., 2012). Активное использование брассиностероидов в качестве принципиально новых препаратов сельскохозяйственного назначения обусловлено их экологической безопасностью и способностью снижать накопление нитратов, тяжелых металлов и радионуклидов. На уровне целого растения брассиностероиды способствуют повышению фотосинтетического потенциала, усилению роста и урожайности сельскохозяйственных культур (7. Khripach V.A., Zhabinskii V.N., Kamachuk R.A., 2004; 8. Efimova M.V. et al., 2012a; 9. Efimova M.V. et al., 2012b). Среди преимуществ брассиностероидов можно отметить их экологическую безопасность и способность вызывать эффекты в очень низких концентрациях, по сравнению с другими гормонами растений. Вместе с тем, механизмы стресс-протекторного действия стероидных фитогормонов, остаются в настоящее время практически не исследованными (10. Gomes M.M.A., 2011).

Протекторное действие эпибрассинолида в отношении растений рапса при интенсивном хлоридном воздействии (засолении) иллюстрируется рисунками.

На фиг.1 и 2 приведены ростовые показатели растений рапса. Снятие ростовых показателей проводили на 7 и 14 сутки от начала воздействия. На фиг.1 показано влияние эпибрассинолида (10^-10 М ЭБЛ) и хлоридного засоления (175 мМ NaCl) на рост стебля, а на фиг.2 - на рост листьев (указана суммарная листовая поверхность одного растения).

На фиг.3 и 4 показано влияние эпибрассинолида и хлоридного засоления на аккумуляцию массы надземной части растений рапса. Измерения проводили на 7 и 14 сутки от начала воздействия.

Фиг.3 - накопление сырой и сухой биомассы растениями рапса.

Фиг.4 - процентное содержание сухой массы растений рапса по отношение к сырой массе.

На фиг.5-10 показаны гистограммы, отражающие влияние эпибрассинолида и хлоридного засоления на физиологическое состояние растений рапса на основании следующих показателей: фотосинтетических пигментов, пролина, осмотического потенциала, общих растворимых фенолов, мевалонового диальдегида. Взятие биологических проб и образцов проводили на 7 и 14 сутки от начала воздействия.

Фиг.5 - содержание фотосинтетических пигментов в растениях рапса.

Фиг.6 - содержание пролина в растениях рапса.

Фиг.7 - осмотический потенциал клеточного содержимого растений рапса.

Фиг.8 - содержание общих растворимых фенолов в растениях рапса.

Фиг.9 - содержание флавоноидов в растениях рапса.

Фиг.10 - содержание мевалонового диальдегида (МДА) в растениях рапса.

Реализация способа показана на примере, иллюстрирующем способность фитогормона эпибрассинолида (ЭБЛ) снимать негативное воздействие засоления на ростовые и физиологические показатели рапса.

Пример. Опыты проведены на растениях Brassica napus L. сорта Вестар. Растения рапса в возрасте 20 дней подвергали 2-недельному хлоридному засолению (175 мМ NaCl). Как показал анализ (опыт и контроль), обработка рапса раствором ЭБЛ (10^-10 М) способствует стабилизации физиологических показателей растений - фотосинтетических пигментов, пролина, осмотического потенциала, общих растворимых фенолов, в том числе флавоноидов. Данные изменения, в конечном итоге, способствуют снижению отрицательного влияния засоления на фотосинтетический аппарат и рост (развитие) растений.

Для оценки уровня фотосинтетических пигментов листья рапса растирали в 96%-ном этаноле и центрифугировали (10 мин при 8 тыс об/мин, центрифуга MiniSpin «Eppendorf», Германия). Оптическую плотность пробы (супернатанта) оценивали на спектрофотометре Genesys 10 ThermoElectron (Германия). Концентрацию пигментов в спиртовой вытяжке рассчитывали согласно Lichtenthaler (11. Lichtenthaler H.K. 1987). Экстракцию и определение свободного пролина проводили по методу Bates (12 Bates L.S., Waldran R.P., Teare I.D., 1973).

Осмотический потенциал клеточного экссудата определяли на криоскопическом осмометре Osmomat 030 (Gonotec, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Клеточный экссудат выжимали из размороженных образцов листьев растений.

Содержание мевалонового диальдегида (МДА) в листьях растений оценивали спектрофотометрическим методом, основанном на образовании окрашенного комплекса МДА с тиобарбитуровой кислотой при нагревании (13. Buege J.A., Aust S.D., 1978).

Интенсивное засоление 175 мМ NaCl подавляет рост стебля растений рапса на 30% (фиг.1) и вызывает значительное сокращение листовой поверхности (в 2,5 раза) (фиг.2). Сырая и сухая масса растений по сравнению с контролем уменьшается примерно в 2-2,5 раза (фиг.3), оводненность тканей снижается, о чем свидетельствует увеличение соотношения сухой массы растений к сырой массе (фиг.4). Обработка растений экзогенным 24-эпибрассинолидом в концентрации 10^-10 М способствует снижению негативной нагрузки засоления на ростовые показатели растений рапса. Рост стебля полностью восстанавливается (фиг.1), ассимилирующая поверхность рапса увеличивается примерно до 60-70% от контрольной площади листьев (фиг.2), сырая и сухая масса, а также соотношение сухой массы к сырой доходит до 90-95% от контроля (фиг.3 и 4).

Негативное воздействие хлоридного засоления отражается и на физиологическом состоянии растений рапса. Содержание зеленых пигментов (хлорофилла а и b) снижается, наибольший эффект достигнут через 14 суток после начала засоления; уровень хлорофилла а уменьшился на 30%, хлорофилла b - в два раза. В условиях интенсивного засоления экзогенный эпибрассинолид полностью восстанавливает уровень некоторых фотосинтетических пигментов до контрольного, на седьмые сутки - хлорофиллов а и b, на четырнадцатые - хлорофилла а (фиг.5). Брассиностероиды в больших концентрациях могут подавлять процессы в растениях. В стрессовых условиях именно заявленная концентрация 24-эпибрассинолида проявляет себя наилучшим образом.

Известно, что засоление вызывает у растений водный дефицит. Поддержание оптимального водного статуса и интактной структуры биополимеров при стрессе является одним из необходимых условий выживания растений. При адаптации растений к действию водного дефицита важная роль принадлежит совместимым низкомолекулярным органическим осмолитам - аминокислотам, сахарам, сахаро-спиртам и бетаинам (14. Kuznetsov V.V., Shevyakova N.I., 2006; 15. Радюкина Н.Л. и др., 2007). Аминокислота пролин является самым распространенным совместимым осмолитом высших растений. Свободный пролин при стрессе обладает полифункциональным биологическим эффектом, проявляющимся в осморегуляторной, антиоксидантной и энергетической функциях; помимо этого пролин защищает макромолекулы, являясь химическим шапероном (16. Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И., 1999). Засоление в течение 7 суток увеличивает уровень пролина примерно в 43 раза, через 14 суток уровень пролина превышает контрольный уже в 52 раза (фиг.6). Обработка эпибрассинолидом способствует значительному снижению эндогенного уровня пролина. Через 7 суток гормон снижает уровень пролина в 1,5 раза, через 14 суток - в 3 раза по сравнению с содержанием пролина при засолении (фиг.6).

При формировании защитных механизмов на фоне хлоридного засоления важно не только обеспечить растения высокой концентрацией совместимых осмолитов за короткий промежуток времени, но и сохранить энергетические ресурсы растения. Для реализации последнего необходимо сократить синтез пролина и активировать другие защитные системы растения, что достигается действием эпибрассинолида. Кроме того, падение уровня пролина при засолении под действием эпибрассинолида однозначно свидетельствует о том, что гормон снижает степень повреждения растений рапса хлористым натрием.

Концентрация пролина в клетках растений отражается на осмотическом потенциале клеточного сока. Засоление понижает осмотический потенциал в два раза по сравнению с контрольными растениями, но эпибрассинолид частично снимает индуцированное солью падение осмотического потенциала содержимого клеток (фиг.7).

При засолении снижается содержание общих растворимых фенолов (фиг.8), в частности флавоноидов (фиг.9). Эпибрассинолид проявляет протекторное действие на растения, увеличивая концентрацию фенольных соединений, проявляющих антиоксидантный эффект.

Одним из последствий действия засоления на растения рапса является окислительный стресс, связанный с нарушениями структуры мембран, процессов фотосинтеза и дыхания (17 Gill S.S., Tuteja N., 2010). Для оценки степени окислительных повреждений нами изучена динамика содержания мевалонового диальдегида (МДА) в листьях рапса. Интенсивное засоление повышает уровень МДА на 40%, что свидетельствует о развитии окислительного стресса, тогда как эпибрассинолид существенно снижает его интенсивность (фиг.10).

Таким образом, экспериментально показано, что экзогенный 24-эпибрассинолид не только снижает негативное воздействие хлоридов на ростовые показатели за счет стабилизации уровня фотосинтетических пигментов и общих растворимых фенолов, в частности флавоноидов, но и стабилизирует осмотический потенциал, уровень пролина и мевалонового диальдегида в условиях интенсивного хлоридного засоления. Эти результаты доказывают эффективность и промышленную применимость предложенного способа повышения устойчивости растений рапса к засолению согласно заявленной формуле изобретения.

Использованные источники

1. Kuznetsov Vl.V., Shevyakova N.I. Polyamines and plant adaptation to saline environments / Desert Plants. 2010. Heidelberg, Dordrecht, London, New York: Springer-Verlag. - P.261-298.

2. Shahid S.A., Rahman K. Soil salinity development, classification, assessment, and management in irrigated agriculture / Handbook of plant and crop stress. 3^rd edition. 2011. M. Pessarakli. Ed. CRC Press Taylor & Francis Group. - P.23-38.

3. Пат. RU 2445759, Способ повышения солеустойчивости растений (варианты), Апашева Л.М., Комиссаров Г.Г., Сахаров A.M., Сахаров П.А., Опубликовано: 27.03.2012.

4. Houimli S.M., Denden M., Mouhandes B.D. Effects of 24-epibrassinolide on growth, chlorophyll, electrolyte leakage and proline by pepper plants under NaCl-stress // EurAsia J. BioSci. 2010. Vol.4. P.96-104.

5. Карначук Р.А., Головацкая И.Ф., Ефимова М.В., Хрипач В.А. Действие эпибрассинолида на морфогенез и соотношение гормонов у проростков Ardbidopsis на зеленом свету // Физиология растений. 2002. Москва. Т.49. №4. С.591-595.

6. Ефимова М.В., Хасан Ж., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В. Влияние брассиностероидов на прорастание семян и рост рапса на начальных этапах онтогенеза при хлоридном засолении // Вестник РУДН. серия «Агрономия и животноводство». 2012. №3. С.12-20.

7. Khripach V.A., Zhabinskii V.N., Kamachuk R.A. Chemical probes in biology / Science at the interface of brassinosteroids: a new role of steroids as biosignaling molecules. 2004. M.P. Schneider. Ed. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. - Vol.129. - P.153-167. - NATO Science Series. 391 p.

8. Eflmova M.V., Kusnetsov V.V., Kravtsov A.K., Bartashevich D.A., Kamachuk R.A., Kovtun I.S., Kuznetsov V.V. Expression of plastid genome and development of Arabidopsis thaliana with disturbed synthesis of brassinosteroids // Russian Journal of Plant Physiology. - 2012a. - Vol.59(1). P.28-34.

9. Efimova M.V., Kusnetsov V.V., Kravtsov A.K., Kamachuk R.A., Khripach V.A., Kuznetsov V.V. Regulation of the transcription of plastid genes in plants by brassinosteroids // Doklady Biological Sciences. - 2012b. - Vol.445 (1). P.272-275.

10. Gomes M.M.A. Physiological effects related to brassinosteroid application in plants / Brassinosteroids: a class of plant hormone. 2011. S. Hayat, A. Ahmad. Eds. Springer Science + Business Media B.V. - P.193-242. p.462.

11. Lichtenthaler H.K. Chlorophylls and carotenoids, the pigments of photosynthetic biomembranes / Methods Enzymology. 1987. Eds. R. Douce, L. Packer. - New York: Academik. - P.-350-382.

12. Bates L.S., Waldran R.P., Teare I.D. Rapid detennination of free proline for water stress studies // Plant Soil. - 1973. - Vol.39. P.205-208.

13. Buege J.A., Aust S.D. Microsomal lipid peroxidation / Methods in Enzymology. 1978. Vol.52. P.302-310.

14. Kuznetsov V.V., Shevyakova N.I. Stress responses of tobacco cells to high temperature and salinity. Proline accumulation and phosphorylation of polypeptides // Physiologia Plantarum. - 2006. - Vol.100 (2). P.320-326.

15. Радюкина Н.Л., Иванов Ю.В., Карташов А.В., Шевякова Н.И., Ракитин В.Ю., Хрянин В.Н., Кузнецов Вл.В. Изучение индуцибельных и конститутивных механизмов устойчивости к солевому стрессу у гравилата городского // Физиология растений. - 2007. - Т.54. - №5. С.692-698.

16. Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиология растений. - 1999. - Т.46 (2). С.321-336.

17. Gill S.S., Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants // Plant Physiology and Biochemistry. - 2010. - Vol.48. P.909-930.