КОРМОВОЙ ПРОДУКТ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАССТРОЙСТВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ИЗБЫТОЧНОЙ МАССОЙ ЖИВОТНЫХ

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение охватывает композиции и способы лечения расстройств и заболеваний, ассоциированных с ожирением. Изобретение также охватывает гены, дифференциально экспрессируемые у животных, и, в частности, относится к генам, которые дифференциально экспрессируются у животных, страдающих ожирением, в сравнении с худыми животными. Изобретение также охватывает композиции и способы модулирования количества жира у животных с помощью целенаправленного питания, которое предназначено для того, чтобы наряду с прочим оказывать влияние на ключевые гены, вовлеченные в метаболизм жиров. В изобретении, кроме того, определены биологически активные компоненты пищи, которые по отдельности или вместе могут влиять на экспрессию и активность ключевых генов, вовлеченных в метаболизм жиров.

Уровень техники

В научных кругах общепринято, что регуляция экспрессии генов играет ключевую роль в развитии некоторых заболеваний или состояний, которые влияют на здоровье и самочувствие животного. Таким же образом, дифференциальная экспрессия генов является одним из факторов развития таких заболеваний и состояний, и оценка картин генной экспрессии признана очень важной для понимания развития и борьбы с такими заболеваниями и состояниями на молекулярном уровне. Для развития представлений о генах и их связи с заболеванием, разработан ряд способов исследования дифференциальной генной экспрессии, например, микроматрицы ДНК, маркерные экспрессируемые последовательности (EST), серийный анализ экспрессии генов (SAGE), вычитающая гибридизация, вычитающее клонирование и дифференциальный дисплей (DD) мРНК, ПЦР с произвольными РНК-праймерами (RAP-PCR), репрезентативный разностный анализ (RDA), двухмерный гель-электрофорез, масс-спектрометрия, обращенно-фазовая белковая матрица и матрицы.

Экспрессию генов у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными совершенно не исследовали. Поэтому существует необходимость в идентификации генов и белков, которые экспрессируются иначе у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными. Такие гены, белки и их фрагменты могут быть использованы для составления прогноза вероятности появлении ожирения у животного, для постановки диагноза ожирения у животного, для скрининга веществ с целью определения того, можно ли их применять для модулирования количества жировой ткани у животного, и для применения таких веществ для модулирования количества жировой ткани у животного.

Животными с избыточной массой можно считать таких животных, которые имеют избыток жировой ткани в организме. Как правило, такие животные, как человек, собаки и кошки, у которых масса превышена более чем на 15% от их идеальной массы тела, считаются тучными. Наиболее общей причиной ожирения животного является чрезмерное потребление пищи, которое приводит к избыточному потреблению калорий. Однако имеются другие факторы, которые могут увеличивать вероятность появления ожирения у животного, например, образ жизни, состояние здоровья, привычки, связанные с питанием, порода, удаление яичников и кастрирование. Также, частота появления избыточной массы у животных, как правило, возрастает с увеличением возраста вследствие общего снижения скорости метаболизма и физической активности. В ходе исследований установлено, что 25% собак в Соединенных Штатах, которые посещают ветеринарные клиники, являются тучными на грани ожирения. Исследования показали, что для животных с избыточной массой значимо выше риск таких заболеваний, как артрит, болезнь сердца, респираторное заболевание, диабет, злокачественная опухоль мочевого пузыря, гипотиреоидизм и панкреатит.

Модулирование количества жировой ткани у животного, включая профилактику появления избыточной массы у животного или лечение животного с избыточной массой, чтобы уменьшить количество жировой ткани у животного, или лечение худого животного, чтобы увеличить количество жировой ткани у животного, является сложным. Увеличение количества жировой ткани у животного обычно вызывается увеличением количества потребляемой пищи. Наиболее эффективным и легким путем профилактики появления избыточной массы у животного или уменьшения количества жира у животного является ограничение пищи и физическая нагрузка. Однако часто трудно гарантировать соблюдение программ питания и физической нагрузки. Другие способы заключаются в применении лекарственных средств, таких как фентермин, фенфлурамин, сибутрамин, орлистат и фенилпропаноламин. К сожалению, при использовании таких лекарственных средств возникают побочные эффекты. Например, введение фенфлурамина и фентермина для лечения ожирения у человека может приводить к повреждению сердечных клапанов у человека. Сибутрамин может увеличивать давление крови, и орлистат может иметь неприятные побочные эффекты в желудочно-кишечном тракте.

Учитывая проблемы, связанные с современными способами, имеющими отношение к жировой ткани животного, авторы изобретения разработали способы и композиции, которые можно использовать для лечения заболеваний и расстройств у животных, и для составления прогноза вероятности появления ожирения у животного, для постановки диагноза ожирения у животного, для скрининга веществ с целью определения того, можно ли их применять для модулирования количества жировой ткани у животного, и для применения таких веществ для модулирования количества жировой ткани у животного.

Сущность изобретения

Изобретение относится к композициям и способам, которые можно использовать для лечения расстройств у домашних животных, нуждающихся в таком лечении.

В одном варианте осуществления изобретение относится к композиции корма для собак, содержащей эффективное количество одного или нескольких ингредиентов, которые препятствуют экспрессии одного или нескольких генов, иначе экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, где указанный один или несколько ингредиентов, которые препятствуют экспрессии одного или нескольких генов, содержат от 26% масс. до 35% масс. сырого белка из расчета на сухую массу, от 7,5% масс. до 8,5% масс. сырого жира из расчета на сухую массу, от 20% масс. до 30% масс. суммарных пищевых волокон из расчета на сухую массу и от 10% масс. до 20% масс. сырых волокон из расчета на сухую массу.

В другом варианте осуществления изобретение относится к композиции корма для кошек, содержащей эффективное количество одного или нескольких ингредиентов, которые препятствуют экспрессии одного или нескольких генов по иному экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, где указанный один или несколько ингредиентов, которые препятствуют экспрессии одного или нескольких генов, содержат: от 30% масс. до 37% масс. сырого белка из расчета на сухую массу, от 7,5% масс. до 9% масс. сырого жира из расчета на сухую массу, от 30% масс. до 35% масс. суммарных пищевых волокон из расчета на сухую массу и от 20% масс. до 25% масс. сырых волокон из расчета на сухую массу.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики резистентности к инсулину у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики панкреатита у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики гипотиреоидизма у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики остеоартрита у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики дислипидемии у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики гипертензии у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики глазных расстройств у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики измененной функции почек у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики респираторного заболевания у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики атеросклероза у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики сахарного диабета у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики заболевания мочевыводящих путей у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики липидоза печени у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики дислипидемиии печени у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики липидоза печени у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики неоплазии у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики заболевания ротовой полости/зубов у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики дерматопатии у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики хромоты у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики гиперлипидемии у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики расстройств метаболизма глюкозы у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения или профилактики коронарной болезни у домашнего животного, нуждающегося в таком лечении, например, у собаки или кошки, композицией настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления изобретения охватывает один или несколько генов или участков генов, которые иначе экспрессируются у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными.

Другой вариант осуществления изобретения относится к комбинации двух или более полинуклеотидов или полипептидов, которые дифференциально экспрессируются у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными.

Другой вариант осуществления изобретения относится к композициям двух или более полинуклеотидных или полипептидных зондов, подходящих для выявления экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, и таким устройствам, как матрицы на подложках, содержащие зонды.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способам и композициям для выявления в образце дифференциальной экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способам измерения влияния тестируемого вещества на профиль экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в качестве способа скрининга тестируемого вещества с целью определения вероятной применимости такого вещества для модулирования количества жировой ткани у животного.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способам составления прогноза возможного появления избыточной массы у животного или постановки диагноза наличия ожирения у животного.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способам и композициям для модулирования экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, или для модулирования количества жировой ткани у животного.

Один или несколько таких вариантов осуществления достигаются при использовании новых комбинаций 433 полинуклеотидных зондов, представляющих гены и участки генов, которые дифференциально экспрессируются в жировой ткани животных с избыточной массой по сравнению с жировой тканью худых животных (таблица 1). Кроме того, один или несколько таких вариантов осуществления достигаются при использовании новых комбинаций 1703 полинуклеотидных зондов, представляющих гены и участки генов, которые дифференциально экспрессируются в лимфоцитах, взятых от животных с избыточной массой, по сравнению с лимфоцитами, взятыми от худых животных (таблица 2). Кроме того, один или несколько таких вариантов осуществления достигаются при использовании новых комбинаций полинуклеотидных зондов, представляющих гены и участки генов, которые дифференциально экспрессируются у собак с избыточной массой и худых собак, и которые считаются ключевыми генами метаболизма жирных кислот (таблица 3). Полинуклеотиды используют для получения композиций, зондов, устройств, основанных на таких зондах, и в способах определения статуса полинуклеотидов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, используемых для достижения указанных выше целей, например для прогнозирования и диагностики состояний, связанных с жировой тканью животного, и для скрининга веществ с целью определения их возможной применимости для модулирования количества жировой ткани у животного. Такие вещества после идентификации можно использовать для модулирования количества жировой ткани у животного. Также предлагаются различные наборы, содержащие комбинации зондов, устройства, в которых используются такие зонды, и вещества.

Также один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к способам модулирования количества жировой ткани у животного in vivo путем введения композиции настоящего изобретения, которая, как показано, модулирует экспрессию генов, вовлеченных в метаболизм жиров.

Также вариант осуществления изобретения относится к модулированию различных биомаркеров собак, связанных с ожирением, посредством введения композиции настоящего изобретения животному, нуждающемуся в таком модулировании, в количестве, эффективном для модулирования биомаркера. Примерами биомаркеров, связанных с ожирением, которые можно модулировать, являются, но без ограничения, глюкоза, инсулин, GLP-1, IGF-1, холестерин, триглицериды, ЛПНП, хиломикроны, щелочная фосфатаза, синтез хряща типа-2, лептин, грелин и их комбинации.

Другие и дополнительные цели, признаки и преимущества настоящего изобретения будут легко понятны специалистам в данной области.

Краткое описание фигур

На фиг.1 показан результат потери массы у собак, которых кормили композицией состава настоящего изобретения, по сравнению с потерей массы при кормлении контрольным составом.

На фиг.2 показан сдвиг профиля генов у собак с ожирением, которых кормили композицией состава настоящего изобретения, по сравнению с худыми собаками.

Подробное описание изобретения

Определения

Термин «животное» означает человека или другое животное, включая птиц, коров, собак, лошадей, кошек, коз, мышей, овец и свиней, которые имеют жировую ткань. Когда термин используют в контексте сравнения животных с избыточной массой с худыми животными, то животные, которых сравнивают, являются животными одного и того же вида и по возможности одной и той же расы или породы. В предпочтительных вариантах осуществления животным является собака или кошка, наиболее предпочтительно собака.

Термин «антитело» означает любой иммуноглобулин, который связывает специфический антиген, включая антитела IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Термин включает поликлональные, моноклональные, моновалентные, гуманизированные, гетероконьюгаты, композиции антител с полиэпитопной специфичностью, химерные, биспецифичные антитела, диантитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител, такие как Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv, или другие антигенсвязывающие фрагменты.

Термин «матрица» означает упорядоченное расположение по меньшей мере двух зондов на подложке. По меньшей мере один из зондов является контрольным или стандартным и по меньшей мере один из зондов является диагностическим зондом. Расположение двух или более зондов (в настоящее время существуют матрицы, чипы и другие основания, которые превышают 40000 зондов) на подложке гарантирует, что размер и интенсивность сигнала каждого меченого комплекса, образованного между зондом и полинуклеотидом или полипептидом в образце, можно по-отдельности отличать.

Термин «оценка упитанности тела» (BCS) означает способ анализа состава тела на основе размера и формы тела животного. Специалистам в данной области известно несколько способов, например, способы, описанные в патенте США 6691639 и в публикации, озаглавленной «Small Animal Clinical Nutrition», 4^th Edition, в главе 13 (ISBN 0-945837-05-4).

Термин «индекс массы тела» (ИМТ) означает массу животного (в килограммах), разделенную на его рост (в метрах) в квадрате.

Термин «DEXA» означает двухэнергетическую рентгеновскую абсорциометрию для анализа состава тела.

Термин «дифференциальная экспрессия» или «дифференциально экспрессируемый» означает повышенную экспрессию генов или повышающую регуляцию экспрессии генов или означает пониженную экспрессию генов или понижающую регуляцию экспрессии генов, которые выявляют по отсутствию, наличию или по меньшей мере 1,3-кратному изменению количества транскрибируемой матричной РНК или транслированного белка в образце.

Термин «тучный» применимо к животному означает любое животное, у которого определяют наличие избыточного количества жировой ткани в организме, или животное, у которого определяют склонность к развитию избыточного количества жировой ткани в организме с использованием методик и способов, известных медицинским работникам и другим специалистам в данной области. Животное является склонным к приобретению избыточной массы, если животное имеет склонность или более высокую вероятность развития избыточной жировой ткани по сравнению со средним животным в общей популяции. Обычно, но без ограничения, считают, что животное имеет избыточную массу, если (1) животное имеет ИМТ 25 или больше (число, которое, как полагают, включает «избыточную массу» и «ожирение» в некоторых способах характеристики состояний животных), (2) масса животного на 15% или больше превышает его «идеальную» массу тела, что определено работниками здравоохранения или подобными специалистами в данной области, (3) процентное содержание жира в организме животного составляет 27% или больше на основании определения с использованием DEXA, или (4) животное имеет оценку упитанности тела больше 3, которая определена специалистами с использованием способа, описанного в «Small Animal Clinical Nutrition», 4^th Edition, в главе 13 (ISBN 0-945837-05-4), или эквивалентно другим используемым способам определения BCS.

Термин «ассоциированные с ожирением гены» означает все или подгруппу генов, указанных в таблицах 1 и 2, в частности гены, представленные последовательностями 433 зондов, которые дифференциально экспрессируются в жировой ткани, взятой от животных с избыточной массой, и в жировой ткани, взятых от худых животных, а также гены, представленные 1703 последовательностями зондов, которые дифференциально экспрессируются в лимфоцитах, взятых от животных с избыточной массой, и в лимфоцитах, взятых от худых животных.

Термин «ключевые гены» означает все или подгруппу генов, указанных в таблице 3.

Термин «кратный» при использовании в качестве меры дифференциальной экспрессии генов означает количество генной экспрессии у животного, которое является многократным или составляет долю от генной экспрессии при сравнении с количеством генной экспрессии у используемого для сравнения животного, например, у животных с избыточной массой по сравнению с худым животным. Например, ген, который экспрессируется в три раза больше у данного животного, чем у используемого для сравнения животного, имеет 3-кратную дифференциальную экспрессию гена, и говорят, что ген подвергается повышающей регуляции. С другой стороны, ген, экспрессия которого у данного животного составляет одну треть от экспрессии у используемого для сравнения животного, также имеет 3-кратную дифференциальную генную экспрессию, и говорят, что ген подвергается понижающей регуляции.

Термин «фрагмент» означает (1) олигонуклеотидную или полинуклеотидную последовательность, которая составляет часть полной последовательности, и которая обладает такой же или сходной активностью для конкретного применения, как и полная полинуклеотидная последовательность, или (2) пептидную или полипептидную последовательность, которая составляет часть полной последовательности, и которая обладает такой же или сходной активностью для конкретного применения, как и полная полипептидная последовательность. Такие фрагменты могут содержать любое количество нуклеотидов или аминокислот, которое, как считают, является подходящим для конкретного применения. Как правило, олигонуклеотидные или полинуклеотидные фрагменты содержат по меньшей мере 10, 50, 100 или 1000 нуклеотидов, и полипептидные фрагменты содержат по меньшей мере 4, 10, 20 или 50 следующих друг за другом аминокислот из полной последовательности. Термин охватывает полинуклеотидные и полипептидные варианты таких фрагментов.

Термин «ген» или «гены» означает полный или частичный участок ДНК, вовлеченный в продуцирование полипептида, включая области, предшествующие и следующие за кодирующей областью (лидер и концевой участок), и вставочные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими участками (экзонами). Термин охватывает любую последовательность ДНК, которая гибридизуется с комплементом кодирующих последовательностей гена.

Термин «гены дифференциально экспрессируемые у животных с избыточной массой» означает гены, количество экспрессируемой мРНК которых или количество генного продукта, транслируемого с мРНК, явно отличается, является либо больше, либо меньше, в ткани животных с избыточной массой тела по сравнению с худыми животными.

Термин «гомолог» означает (1) полинуклеотид, включая полинуклеотиды того же или другого вида животного, имеющий сходство последовательностей, составляющее более 30%, 50%, 70% или 90% с полинуклеотидом, указанным в таблицах 1, 2, 3 и 5, и обладающий такими же или по существу такими же свойствами и осуществляющий такую же или по существу такую же функцию, как и полный полинуклеотид, или обладающий способностью специфически гибридизоваться с полинуклеотидом, указанным в таблицах 1, 2, 3 и 5 в жестких условиях; или (2) полипептид, включая полипептиды того же или другого вида животного, имеющий сходство последовательностей, составляющее более 30%, 50%, 70% или 90% с полипептидом, идентифицированным по экспрессии полинуклеотидов, указанных в таблицах 1, 2, 3 и 5, и обладающий такими же или по существу такими же свойствами и осуществляющий такую же или по существу такую же функцию, как и полный полипептид, или обладающий способностью специфически связываться с полипептидом, идентифицированным по экспрессии полинуклеотидов, указанных в таблицах 1, 2, 3 и 5. Сходство последовательностей двух полипептидных последовательностей или двух полинуклеотидных последовательностей определяют, используя способы, известные специалистам в данной области, например алгоритм Karlin и Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268 (1990)). Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST Altschul et al., (J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Чтобы получить выравнивание с пробелами для сравнения, можно использовать программу Gapped Blast, как описано у Altschul et al., в (Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). При использовании программ BLAST и Gapped BLAST применяют параметры соответствующих программ по умолчанию (например, XBLAST и NBLAST). См. .

Термин «комплекс гибридизации» означает комплекс, который образуется между полинуклеотидами в образце, когда пурины одного полинуклеотида связываются водородной связью с пиримидинами комплементарного полинуклеотида, например, 5'-A-G-T-C-3' образует пары оснований с 3'-T-C-A-G-5'. Степень комплементарности и использование аналогов нуклеотидов влияет на эффективность и жесткость реакций гибридизации.

Термин «совместно с» означает, что лекарственное средство, пищевое или другое вещество вводят животному (1) вместе в композиции, в частности, пищевой композиции, или (2) отдельно с одинаковой или разной частотой, используя одинаковые или различные пути введения, в одно и то же время или периодически. «Периодически» означает, что вещество вводят по схеме дозирования, приемлемой для конкретного вещества, «одно и то же время» обычно означает, что вещества (пищу или лекарственное средство) вводят одновременно или с интервалом в пределах 72 часов друг от друга. Термин «совместно с» специально включает схемы введения, согласно которым вещества, такие как лекарственные средства, вводят в течение предписанного периода времени, и композиции настоящего изобретения вводят нечетко ограниченно.

Термин «худое», который применяют по отношению к животному, означает любое животное, которое не имеет избыточной массы, судя по определению с использованием методик и способов, известных специалистам, обеспечивающим медицинское обслуживание, и другим специалистам, имеющим отношение к данной области. Обычно, не ограничивая определения, животное считают худым, если (1) животное имеет ИМТ меньше 25 или (2) масса животного на 15% или более меньше его «идеальной» массы тела, что определено специалистами, обеспечивающими медицинское обслуживание, или специалистами, имеющими отношение к данной области, (3) процентное содержание жира в организме животного составляет меньше 27%, как определено DEXA, или (4) животное имеет оценку упитанности тела 3 или меньше, как определено специалистами с использованием способа, описанного в «Small Animal Clinical Nutrition», 4^th Edition, в главе 13 (ISBN 0-945837-05-4), или эквивалентно с использованием других способов определения BCS.

Термин «модулирование количества жировой ткани у животного» означает вызывание у животного потери жировой ткани, вызывание у животного увеличения жировой ткани или вызывание у животного сохранения количества жировой ткани, если животное склонно к увеличению или потере жировой ткани. Таким образом, модулирование количества жировой ткани у животного охватывает профилактику возникновения у худого животного избыточной массы и лечение животного с избыточной массой, чтобы снизить количество жировой ткани у животного, а также лечение худого животного, чтобы увеличить количество жировой ткани в соответствующих случаях, например, в случае лечения худого животного, у которого, как определено специалистами, такой недостаток массы, что требуется увеличение жировой ткани. Можно использовать обычные способы, чтобы оценить количество жировой ткани у животного, а также определить мышечную массу худого животного и/или содержание минеральных веществ в костях, информацию, которая может иметь значение для такой оценки.

Термин «полинуклеотид» или «олигонуклеотид» означает полимер из нуклеотидов. Термин охватывает молекулы ДНК и РНК (включая кДНК и мРНК), либо однонитевые, либо двунитевые, и если они являются однонитевыми, то их комплементарную последовательность в линейной или кольцевой форме. Термин также охватывает фрагменты, варианты, гомологи и аллели, которые соответствуют последовательностям, которые обладают такими же или по существу такими же свойствами и выполняют такую же или по существу такую же функцию, как и исходная последовательность. Последовательности могут быть полностью комплементарными (без ошибочных спариваний) при выравнивании или могут иметь до 30% несовпадений последовательностей. Предпочтительно в случае полинуклеотидов цепь содержит от 50 до 10000 нуклеотидов, более предпочтительно от 150 до 3500 нуклеотидов. Предпочтительно в случае олигонуклеотидов цепь содержит от 2 до 100 нуклеотидов, более предпочтительно от 6 до 30 нуклеотидов. Точный размер полинуклеотида или олигонуклеотида будет зависеть от разных факторов и от конкретного применения и использования полинуклеотида или олигонуклеотида. Термин включает нуклеотидные полимеры, которые синтезируют и которые выделяют и очищают из природных источников. Термин «полинуклеотид» включает «олигонуклеотид».

Термин «полипептид», «пептид» или «белок» означает полимер, состоящий из аминокислот. Термин охватывает встречающиеся в природе и не встречающиеся в природе (синтетические) полимеры и полимеры, в которых одна или несколько аминокислот заменены искусственными химическими миметиками. Термин также охватывает фрагменты, варианты и гомологи, которые обладают такими же или по существу такими же свойствами и выполняют такую же или по существу такую же функцию, как и исходная последовательность. Термин охватывает полимеры любой длины, предпочтительно полимеры, содержащие от 2 до 1000 аминокислот, более предпочтительно от 5 до 500 аминокислот. Термин включает полимеры из аминокислот, которые синтезируют и которые выделяют и очищают из природных источников.

Термин «зонд» означает (1) олигонуклеотид или полинуклеотид, либо РНК, либо ДНК, либо встречающийся в природе, как в очищенном продукте расщепления ферментами рестрикции, либо полученный синтетически, который способен к отжигу или специфической гибридизации с полинуклеотидом с последовательностями, комплементарными зонду, или (2) пептид или полипептид, способный специфически связывать конкретный белок или белковый фрагмент, по существу, исключая другие белки или белковые фрагменты. Олигонуклеотидный или полинуклеотидный зонд может быть либо однонитевым, либо двунитевым. Точная длина зонда будет зависеть от многих факторов, включая температуру, источник и применение. Например, для диагностических применений в зависимости от сложности последовательности-мишени олигонуклеотидный зонд обычно содержит 10-100, 15-50 или 15-25 нуклеотидов. В случае некоторых диагностических применений полинуклеотидный зонд содержит 100-1000, 300-600 нуклеотидов, предпочтительно 300 нуклеотидов. Зонды в данном случае выбирают так, чтобы они были «по существу» комплементарными разным нитям конкретной последовательности-мишени. Это значит, что зонды должны быть в достаточной степени комплементарными, чтобы специфически гибридизоваться или отжигаться с соответствующими последовательностями-мишенями в предварительно определенных условиях. Следовательно, последовательность зонда не должна точно отражать комплементарную последовательность мишени. Например, некомплементарный нуклеотидный фрагмент может быть связан с 5'- или 3'-концом зонда, при этом остальная часть последовательности зонда является комплементарной последовательности-мишени. Альтернативно, некомплементарные основания или более длинные последовательности могут быть рассеяны по зонду, при условии, что последовательность зонда имеет достаточную комплементарность с последовательностью полинуклеотида-мишени для специфического отжига с полинуклеотидом-мишенью. Пептидный или полипептидный зонд может представлять собой любую молекулу, с которой белок или пептид специфически связывается, включая ДНК (в случае ДНК-связывающих белков), антитела, рецепторы клеточных мембран, пептиды, кофакторы, лектины, сахара, полисахариды, клетки, клеточные мембраны, органеллы и мембраны органелл.

Термин «образец» означает любую ткань или жидкость животного, содержащую, например, полинуклеотиды, полипептиды, антитела, метаболиты и тому подобное, включая клетки и другую ткань, содержащую ДНК и РНК. Примерами являются жировая ткань, кровь, хрящ, соединительная, эпителиальная, лимфоидная, мышечная, нервная ткань, слюна и тому подобное. Образец может быть твердым или жидким и может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, жидкости организма, такие как кровь или моча, клетки, клеточные препараты или растворимые фракции или аликвоты их сред, хромосомы, органеллы и тому подобное.

Термин «отдельная упаковка» означает, что компоненты набора физически ассоциированы в одном или нескольких или с одним или несколькими контейнерами и считаются единицей производства, распространения, продажи или применения. Контейнеры представляют собой, но без ограничения, пакеты, коробки, бутылки, упаковку в термоусадочной пленке, скрепленные скобками или иным образом скрепленные компоненты или их комбинации. Отдельная упаковка может представлять собой контейнеры с отдельными пищевыми композициями, физически ассоциированными так, что они считаются единицей производства, распространения, продажи или применения.

Термин «применимые вариации» означает (1) в случае полинуклеотида комплементы полинуклеотида; гомологи полинуклеотида и их комплементы; варианты полинуклеотида, их комплементы и их гомологи; и фрагменты полинуклеотида, их комплементы, их гомологи и их варианты и (2) в случае полипептида гомологи полипептида; варианты полипептида и их гомологи; и фрагменты полипептида, их гомологи и их варианты.

Термин «виртуальная упаковка» означает, что компоненты снабжены инструкциями, относящимися к одному или нескольким физическим или виртуальным компонентам набора, информирующими пользователя о том, как получить другие компоненты, например, в пакете, содержащем один компонент, и инструкции, информирующие пользователя о необходимости знакомства с Интернет-сайтом, знакомства с записанным сообщением, просмотра визуального сообщения или обращения к лицу, осуществляющему уход за больным, или инструктору для получения инструкций о том, каким образом пользоваться набором.

Термин «стандарт» означает (1) контрольный образец, который содержит ткань худого животного, если исследованию подвергают животное с избыточной массой, или ткань животного с избыточной массой, если исследованию подвергают худое животное, или (2) контрольный образец, который содержит ткань подвергаемого исследованию худого животного или животного с избыточной массой, которое не было подвергнуто воздействию тестируемого вещества, исследуемого в соответствующем худом животном или животном с избыточной массой, чтобы определить, вызывает ли тестируемое вещество дифференциальную экспрессию генов, которая является подходящей в контексте его применения.

Термин «жесткие условия» означает (1) гибридизацию в 50% (об./об.) формамиде с 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% фикола, 0,1% поливинилпирролидона, 50 мМ натрий-фосфатного буфера, pH 6,5, содержащего 750 мМ NaCl, 75 мМ цитрат натрия, при 42°C, (2) гибридизацию в растворе, содержащем 50% формамида, 5× SSC (0,75М NaCl, 0,075М цитрата натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5× раствор Денхардта, обработанную ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфат декстрана, при 42°C; с промывками при 42°C в 0,2× SSC и 0,1% SDS или промывками в 0,015М NaCl, 0,0015М цитрате натрия, 0,1% Na₂SO₄ при 50°C, или сходные способы с использованием сходной низкой ионной силы и средств для промывки при высокой температуре и сходных денатурирующих средств.

Термин «вещество» означает элемент, соединение, молекулу или их смесь или любое другое вещество, которое потенциально может быть использовано для диагностики, прогноза или модулирования количества жировой ткани у животных, включая любое лекарственное средство, химический объект или биологический объект.

Термин «миРНК» означает полинуклеотид, который образует двунитевую РНК, которая снижает или ингибирует экспрессию гена, когда миРНК экспрессируется в той же клетке, что и ген. Термин охватывает двунитевую РНК, образованную комплементарными нитями. Комплементарные части миРНК, которые гибридизуются с образованием двунитевой молекулы, обычно имеют существенную или полную идентичность. Обычно миРНК содержит по меньшей мере 15-50 нуклеотидов, и двунитевая миРНК содержит 15-50 пар оснований, предпочтительно 20-30 нуклеотидов и пар оснований.

Термин «специфически связывает» означает особое и точное взаимодействие между двумя молекулами, которое зависит от их структуры, в частности, от боковых групп молекулы. Например, интеркаляция регуляторного белка в главную бороздку молекулы ДНК, образование водородных связей вдоль остова между двумя однонитевыми нуклеиновыми кислотами или связывание между эпитопом белка и агонистом, антагонистом или антителом.

Термин «специфически гибридизоваться» означает ассоциацию между двумя однонитевыми полинуклеотидами с достаточной комплементарностью последовательностей для того, чтобы осуществить такую гибридизацию в предварительно определенных условиях, обычно используемых в данной области (иногда называемых «комплементарными в значительной степени»). Например, термин может относиться к гибридизации полинуклеотидного зонда с последовательностью, комплементарной ему в значительной степени, находящейся в однонитевой молекуле ДНК или РНК согласно одному аспекту настоящего изобретения, по существу, при исключении гибридизации полинуклеотидного зонда с однонитевыми полинуклеотидами некомплементарной последовательности.

Термин «вариант» означает (1) полинуклеотидную последовательность, содержащую любую замену, изменение, модификацию, перестановку, делецию или добавление одного или нескольких нуклеотидов в полинуклеотидной последовательности, и которая обладает такими же или по существу такими же свойствами и осуществляет такую же или по существу такую же функцию, как и исходная последовательность; и (2) полипептидную последовательность, содержащую любую замену, изменение, модификацию, перестановку, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот в полипептидной последовательности, и которая обладает такими же или по существу такими же свойствами и осуществляет такую же или по существу такую же функцию, как и исходная последовательность. Таким образом, термин включает однонуклеотидный полиморфизм (SNP) и аллельные варианты и включает консервативные и неконсервативные аминокислотные замены в полипептидах. Термин также в соответствующих случаях охватывает химическое образование производных полинуклеотида или полипептида и замену нуклеотидов или аминокислот нуклеотидами или аминокислотами, которые не встречаются в природе.

Изобретение не ограничено конкретной методикой, протоколами и реагентами, описанными в настоящем описании, так как они могут варьировать. Кроме того, терминология, используемая в настоящем описании, использована только в целях описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения. В используемом в настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения смысле формы единственного числа включают указание и на множественное число, если контекст ясно не указывает иное, например, указание «вариант» включает множество вариантов. Кроме того, определенные термины включают изменения терминов, используемые в правильном грамматическом контексте, например, термин «специфически связывает» включает «специфическое связывание» и другие формы термина. Подобным образом, слова «содержат», «содержит» и «содержащий» необходимо интерпретировать включительно, а не исключительно.

Если не указано иное, все технические и научные термины и любые акронимы, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, которое обычно понимают специалисты в области, к которой относится изобретение. Хотя при практическом осуществлении настоящего изобретения можно использовать любые композиции, способы, изделия производства или другие средства или вещества, сходные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем описании, описаны и предпочтительные композиции, способы, изделия производства или другие средства или вещества.

Все патенты, патентные заявки, публикации и другие ссылки, цитированные или указанные в данном описании, включены в настоящее описание в рамках, определяемых законодательством. Обсуждение таких публикаций предназначено только для суммирования приведенных в них данных. Не допускается, чтобы любые такие патенты, патентные заявки, публикации или ссылки или любая их часть, считались как относящиеся к прототипу настоящего изобретения и в частности сохраняется право на сомнение в отношении правильности и значимости таких патентов, патентных заявок, публикаций и других ссылок.

Модулирование генной экспрессии белка

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к одному или нескольким генам или участкам генов («гены» имеют значение, определенное в настоящем описании), которые дифференциально экспрессируются в жировой ткани и/или лимфоцитах животных с избыточной массой по сравнению с жировой тканью и/или лимфоцитами худых животных. Изобретение основано на открытии того, что дифференциально экспрессируемые гены, которые представлены 445 полинуклеотидами в жировой ткани животных с избыточной массой по сравнению с жировой тканью худых животных и 1767 полинуклеотидами в лимфоцитах, взятых у животных с избыточной массой, по сравнению с лимфоцитами, взятыми у худых животных. Кроме того, изобретение основано на идентификации 7 ключевых генов, вовлеченных в метаболизм жирных кислот, которые дифференциально экспрессируются у животных с избыточной массой и худых животных, которые перечислены в таблице 3. Такие ключевые гены представляют членов семейства киназы пируватдегидрогеназы, семейства карнитинпальмитоилтрансферазы и семейства растворимых переносчиков 27 (переносчики жирных кислот) и гены, ассоциированные с элонгацией длинноцепочечных жирных кислот, при этом семейство киназ пируватдегидрогеназы и семейство карнитинпальмитоилтрансферазы являются наиболее важными и в некоторых случаях ограничивающими скорость ферментами. Гены идентифицировали путем сравнения экспрессии генов в жировой ткани и лимфоцитах, взятых от животных, у которых диагностировано наличие избыточной массы, с генами в жировой ткани и лимфоцитах от животных, которые диагностированы как худые с использованием методики Affymetrix GcneChip®. Полинуклеотиды показаны в таблице 1, 2 и 3. В таблицах представлена информация об идентификационном номере зонда Affymetrix (в настоящем описании «APIN»), p-значение, q-значение, кратная экспрессия (тучные/худые), верхняя аннотация BLAST к данному зонду, номер доступа наилучшего совпадения BLAST, символ гена и, наконец, в последней колонке приведено описание гена. Описание предполагаемого или реального гена может быть в некоторых случаях получено из базы данных BLAST с использованием способов, известных специалистам в данной области. Как правило, функцию предполагаемого или реального гена определяют посредством (1) идентификации APIN для каждого гена, который имеет 1,3-кратную или более высокую генную экспрессию у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, (2) определения нуклеотидной последовательности каждого такого гена путем ввода APIN в общедоступную базу данных Affymetrix, которая соотносит номера AIPN с последовательностями, и (3) ввода нуклеотидной последовательности в базу данных BLAST, предоставленную Национальными институтами здравоохранения, и определения функции предполагаемого или реального гена на основе совпадений полученной последовательности с гомологичными последовательностями в базе данных.

Полинуклеотиды и гены идентифицируют, измеряя различия между генной экспрессией в жировой ткани и лимфоцитах собак, у которых диагностирована избыточная масса, и генной экспрессией в жировой ткани и лимфоцитах собак, которые диагностированы как худые. Изменения в генной экспрессии могут быть определены любым способом, известным специалистам в данной области. Как правило, изменения в генной экспрессии определяют путем измерения транскрипции (определения количества мРНК, продуцируемой геном) или измерения трансляции (определения количества белка, продуцируемого геном). Количество РНК или белка, продуцируемых геном, может быть определено с использованием любого способа, известного специалистам в данной области, предназначенного для количественной оценки полинуклеотидов и белков. Как правило, экспрессию РНК определяют с использованием способов, включая, но без ограничения, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (включая, но без ограничения, ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и количественную ПЦР в режиме реального времени PCR (кПЦР)), защиту от РНКаз, нозерн-блоттинг и другие способы гибридизации. Измеряемая РНК обычно имеет форму мРНК или обратно транскрибированной мРНК или комплементарной ДНК (кДНК). Экспрессию белка или полипептида определяют, используя различные колориметрические, флуоресцентные и спектроскопические анализы и способы, включая, но без ограничения, вестерн-блоттинг, ELISA, мониторинг множественных реакций, обращенно-фазовые матрицы и матрицы антител. В предпочтительном способе изменения в генной экспрессии определяют, используя чипы GeneChip® Affymetrix Canine-1 и Canine-2, которые можно приобрести у Affymetrix, Inc., и инструкции по применению таких чипов для определения генной экспрессии.

Обычно, дифференциальную экспрессию генов у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными определяют посредством измерения экспрессии по меньшей мере одного гена. Предпочтительно измеряют экспрессию двух или более дифференциально экспрессируемых генов, чтобы получить картину генной экспрессии или профиль генной экспрессии. Более предпочтительно измеряют экспрессию множества дифференциально экспрессируемых генов.

Полинуклеотиды, гены, белки, кодируемые полинуклеотидами и генами, и комплементы, гомологи, варианты или фрагменты, основанные на таких последовательностях, могут быть использованы в различных прогностических и диагностических анализах, относящихся к количеству жировой ткани у животного, и для скрининга тестируемых веществ для определения того, могут ли быть полезны данные вещества для модулирования количества жировой ткани у животного. Другие применения будут понятны из описания настоящего изобретения.

В другом аспекте изобретение относится к комбинации двух или более полинуклеотидов, которые дифференциально экспрессируются у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, или двух или более белков, продуцируемых в результате экспрессии двух или более полинуклеотидов, которые дифференциально экспрессируются у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными. В одном варианте осуществления комбинация включает два или более полинуклеотидов или белков, экспрессированных из полинуклеотидов, выбранных из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3. Предпочтительно комбинации включают множество полинуклеотидов или белков, экспрессированных из полинуклеотидов, указанных в таблицах 1 и 2, и предпочтительно в таблице 3, обычно 10, 20, 50, 100, 200 или более полинуклеотидов или белков, в соответствии с конкретной группой и применением. Когда в комбинацию входит один или несколько фрагментов, фрагменты могут представлять собой фрагменты любого размера, которые сохраняют свойства и функцию исходного полинуклеотида или белка, предпочтительно 30%, 60% или 90% от исходных. Полинуклеотиды и белки могут быть из любого животного, предпочтительно собаки и кошки, наиболее предпочтительно собаки.

В другом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей два или более олигонуклеотидных или полинуклеотидных зондов, подходящих для выявления экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными. В одном варианте осуществления зонды содержат полинуклеотиды, выбранные из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3. В другом случае зонды содержат применимые варианты таких полинуклеотидов. Зонды содержат достаточное количество нуклеотидов, чтобы специфически гибридизоваться, по существу исключительно с соответствующими комплементарными полинуклеотидами. В некоторых вариантах осуществления зонды содержат по меньшей мере 10, 15, 20, 25 или 30 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления зонды содержат больше нуклеотидов и содержат по меньшей мере 30, 50, 70, 90 или 100 нуклеотидов или более. Зонды могут содержать полноразмерные функциональные гены настоящего изобретения. Предпочтительно композиция содержит множество полинуклеотидных зондов, подходящих для выявления генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, обычно 10, 50, 200, 500, 1000 или 2000 или более зондов. Полинуклеотидные зонды создают или получают, используя способы, известные специалистам в данной области, например, синтез in vitro из нуклеотидов, выделение и очистка из природных источников или ферментативное расщепление генов настоящего изобретения.

В другом аспекте изобретение относится к устройству, подходящему для выявления экспрессии множества генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными. Устройство содержит подложку, имеющую множество олигонуклеотидных или полинуклеотидных зондов настоящего изобретения, прикрепленных к подложке в определенных известных местах. Устройство по существу представляет собой иммобилизованный вариант олигонуклеотидных или полинуклеотидных зондов, описанных в настоящем описании. Устройство может быть использовано для быстрого и специфического выявления генов и полинуклеотидов и картин и профилей их экспрессии. Обычно такие зонды связаны с подложкой или сходной твердой основой, и образец, содержащий один или несколько полинуклеотидов (например, ген, продукт ПЦР, продукт лигазной цепной реакции (LCR), последовательность ДНК, которая была синтезирована с использованием методики амплификации или их смесь) подвергают воздействию зондов таким образом, чтобы полинуклеотид или полинуклеотиды в образце могли гибридизоваться с зондами. Либо зонды, либо полинуклеотид(ды) в образце, либо и то и другое метят, обычно флуорофором или другой меткой, такой как стрептавидин, и выявляют с использованием способов, известных специалистам в данной области. Если в образце метят полинуклеотиды, то гибридизация может быть выявлена путем регистрации связанной флуоресценции. Если метят зонды, то гибридизацию обычно выявляют по гашению метки. Если в образце метят как зонд, так и полинуклеотид(ды), то гибридизацию обычно выявляют путем мониторинга сдвига окраски в результате близости двух связанных меток. Множество методик мечения и меток известно специалистам в данной области, в частности, флуоресцирующих меток. Предпочтительно зонды иммобилизуют на подложках, подходящих для создания матрицы (известной под разными названиями, включая микроматрицу ДНК, генный чип, биочип, ДНК-чип и генную матрицу), сравнимой с матрицами, известными в данной области.

В другом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей два или более пептидных или полипептидных зондов, подходящих для выявления экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными. В одном варианте осуществления зонды содержат пептиды или полипептиды, которые специфически связываются с белками, продуцируемыми в результате экспрессии одного или нескольких полинуклеотидов, содержащих последовательности, выбранные из таблиц 1 и 2. В другом случае зонды содержат пептиды или полипептиды, которые специфически связываются с белками, продуцируемыми в результате экспрессии одного или нескольких полинуклеотидов, содержащих последовательности, выбранные из таблицы 3. В другом случае зонды содержат пептиды или полипептиды, которые специфически связываются с белками, продуцируемыми в результате экспрессии одного или нескольких применимых вариантов таких полипептидов. Зонды содержат достаточное количество аминокислот для специфического связывания с соответствующими полипептидами. Предпочтительно зонды содержат по меньшей мере 4, 10, 20, 40 или 80 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления зонды содержат несколько аминокислот и содержат по меньшей мере 100 или более аминокислот. Зонды могут содержать полноразмерные функциональные белки, полученные в результате экспрессии полноразмерных функциональных генов, идентифицированных настоящим изобретением. Предпочтительно изобретение относится к множеству полипептидных зондов, подходящих для выявления генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, более предпочтительно к совокупности 10, 50, 100, 500 или 1000 или более таких зондов. В одном варианте осуществления зонды представляют собой антитела, предпочтительно моноклональные антитела.

Полипептидные зонды могут быть получены согласно обычным способам, например, с использованием данных о нуклеотидных последовательностях, полученных для полинуклеотидов настоящего изобретения, и способов, известных в данной области. Такие способы включают, но без ограничения, выделение полипептида непосредственно из клеток, выделение или синтез ДНК или РНК, кодирующей полипептиды, и использованием ДНК или РНК для получения рекомбинантных продуктов, химический синтез полипептидов из отдельных аминокислот и получение полипептидных фрагментов химическим расщеплением существующих полипептидов.

В другом аспекте изобретение относится к устройству, подходящему для выявления экспрессии множества генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными. Устройство содержит подложку, имеющую множество пептидных или полипептидных зондов настоящего изобретения, прикрепленных к подложке в определенных известных местах. Устройство по существу представляет собой иммобилизованный вариант пептидных или полипептидных зондов, описанных в настоящем описании. Устройство может быть использовано для быстрого и специфического выявления белков и картин их экспрессии. Обычно такие зонды связаны с подложкой, и образец, содержащий один или несколько белков, подвергают воздействию зондов таким образом, чтобы белки в образце могли гибридизоваться с зондами. В некоторых вариантах осуществления либо зонды, либо белки в образце, либо и то и другое метят и выявляют, обычно используя флуорофор или другое средство, известное специалистам в данной области. Как правило, некоторые способы и измерительные устройства, используемые для регистрации полинуклеотидных микроматриц, применяют к белковым матрицам. Предпочтительно зонды иммобилизуют на подложке, подходящей для создания матрицы.

Способы определения количества или концентрации белка в образце известны специалистам в данной области. Такие способы включают радиоиммуноанализы, анализы конкурентного связывания, вестерн-блот-анализы и анализы ELISA. Подходящими являются способы, в которых используют антитела, поликлональные и моноклональные антитела. Такие антитела могут быть иммунологически специфическими по отношению к белку, эпитопу белка или фрагменту белка.

В некоторых вариантах осуществления изобретения используют антитела для выявления и количественного анализа белков, продуцируемых в результате экспрессии полинуклеотидов настоящего изобретения. Хотя белки могут быть выявлены с использованием иммунопреципитации, аффинного разделения, вестерн-блот-анализа, белковых матриц и подобного, в предпочтительном способе используют методику ELISA, в которой антитело иммобилизуют на твердой подложке, и белок-мишень или пептид-мишень экспонируют с иммобилизованным антителом. Либо зонд, либо мишень, либо и то и другое можно метить с использованием известных способов.

В некоторых вариантах осуществления картины или профили экспрессии множества генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, исследуют, используя матрицу зондов для выявления полинуклеотидов или полипептидов. В одном варианте осуществления можно использовать матрицы олигонуклеотидных или полинуклеотидных зондов, тогда как в другом варианте осуществления можно использовать матрицы антител или других белков, которые специфически связываются с дифференциально экспрессируемыми генными продуктами настоящего изобретения. Такие матрицы могут быть коммерчески доступными, или они могут быть изготовлены по заказу способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием синтеза in-situ на твердой подложке или связывания предварительно синтезированных зондов на твердой подложке с применением методики микропечати. В различных вариантах осуществления матрицы полинуклеотидных или полипептидных зондов изготавливают специально, чтобы специфически выявлять транскрипты или белки, продуцируемые дифференциально экспрессируемыми генами настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления матрицы полинуклеотидных или полипептидных зондов изготавливают специально, чтобы специфически выявлять транскрипты или белки, продуцируемые двумя или более полинуклеотидами или генами, указанными в таблице 2. Такие зонды конструируют для выявления генов, ассоциированных с путями метаболизма липидов и глюкозы у животных. В другом варианте осуществления матрицы полинуклеотидных или полипептидных зондов специально изготавливают для того, чтобы специфически выявлять транскрипты или белки, продуцируемые двумя или более полинуклеотидами или генами, указанными в таблице 3. Такие зонды конструируют с целью выявления генов, которые в большей степени имеют отношение к животным с избыточной массой по сравнению с худыми животными.

В следующем аспекте изобретение относится к способу выявления в образце дифференциальной экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными. Способ включает (a) гибридизацию совокупности множества полинуклеотидных зондов, которые дифференциально экспрессируются у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, с полинуклеотидами в образце с образованием одного или нескольких комплексов гибридизации; (b) необязательно гибридизацию совокупности множества полинуклеотидных зондов, которые дифференциально экспрессируются у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, с полинуклеотидами в стандартном образце с образованием одного или нескольких комплексов гибридизации; (c) регистрацию комплексов гибридизации в образце и необязательно в стандартном образце со стадии (b); и (d) сравнение комплексов гибридизации в образце с комплексами гибридизации в стандартном образце, где разница в количестве комплексов гибридизации между стандартом и образцом свидетельствует о дифференциальной экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в образце. В различных вариантах осуществления множество полинуклеотидных зондов выбирают из зондов, указанных в таблицах 1 и 2, и предпочтительно в таблице 3. Такие полинуклеотиды используют для получения зондов, которые гибридизуются с полинуклеотидами в образце с образованием комплексов гибридизации, которые регистрируют и сравнивают с комплексами в стандартном образце. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды в образце перед гибридизацией амплифицируют. В некоторых вариантах осуществления зонды связывают с подложкой, предпочтительно в виде матрицы.

Стадия (b) и часть стадии (c) являются необязательными, и их используют, если необходимо провести относительно одновременное сравнение двух или более тест-систем. Однако в предпочтительном варианте осуществления стандарт, используемый для сравнения, основан на данных, полученных ранее с использованием настоящего способа.

Такие зонды подвергают взаимодействию с образцом с образованием комплексов гибридизации, которые регистрируют и сравнивают с комплексами гибридизации в стандартном образце. Различие между комплексами гибридизации в образце и стандарте свидетельствует о дифференциальной экспрессии полинуклеотидов и, следовательно, о наличии в образце генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными. В предпочтительном варианте осуществления получают зонды для специфического выявления полинуклеотидов или их фрагментов, продуцируемых одним или несколькими генами или генными фрагментами, идентифицированными по настоящему изобретению. Способы регистрации комплексов гибридизации известны специалистам в данной области.

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает воздействие на животного или образец тестируемым веществом перед гибридизацией. Затем, сравнение является показателем того, изменяет ли тестируемое вещество экспрессию генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в частности, ассоциированных с жирами генов, в образце.

В другом аспекте изобретение относится к способу выявления в образце дифференциальной экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными. Способ включает (a) взаимодействие совокупности множества полипептидных зондов с белками в образце в условиях, которые обеспечивают специфическое связывание между зондами и белками, где белки, связанные с зондами, являются дифференциально экспрессируемыми у животного с избыточной массой по сравнению с худым животным; (b) необязательно взаимодействие совокупности множества полипептидных зондов с белками в стандартном образце в условиях, которые обеспечивают специфическое связывание между зондами и белками, где белки, связанные с зондами, являются дифференциально экспрессируемыми у животного с избыточной массой по сравнению с худым животным; (c) регистрацию специфического связывания в образце и необязательно в стандартном образце со стадии (b); и (d) сравнение специфического связывания в образце со связыванием стандарта, где различие между специфическим связыванием в стандартном образце и в данном образце свидетельствует о дифференциальной экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными в образце.

В различных вариантах осуществления множество полипептидных зондов представляют собой зонды, которые специфически связываются с белками, продуцируемыми в результате экспрессии одного или нескольких полинуклеотидов, выбранных из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3, и применимых вариантов таких полинуклеотидов. Такие полинуклеотиды используют для получения зондов, которые специфически связываются с белками, которые выявляют и сравнивают с белками стандарта. В некоторых вариантах осуществления зонды связывают с подложкой, предпочтительно в виде матрицы. В одном варианте осуществления зонды представляют собой антитела.

Стадия (b) и часть стадии (c) являются необязательными, и их используют, если необходимо провести относительно одновременное сравнение двух или более тест-систем. Однако в предпочтительном варианте осуществления стандарт, используемый для сравнения, основан на данных, полученных ранее с использованием настоящего способа.

Такие зонды подвергают взаимодействию с образцом для получения специфического связывания, которое регистрируют и сравнивают со связыванием в стандартном образце. Различие между специфическим связыванием в образце и стандарте свидетельствует о дифференциальной экспрессии белков и, следовательно, о наличии в образце генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в частности, ассоциированных с жирами генов. В предпочтительном варианте осуществления получают зонды для специфического выявления белков или их фрагментов, продуцируемых одним или несколькими генами или генными фрагментами, идентифицированными по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает воздействие на животного или образец тестируемым веществом перед взаимодействием полипептидов с белками. Затем, сравнение является показателем того, изменяет ли тестируемое вещество экспрессию генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в частности, ассоциированных с жирами генов, в образце.

В другом аспекте способ выявления в образце экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, используют для мониторинга прогресса у животного при попытках модулировать количество жировой ткани у животного в ответ на программу модулирования жировой ткани. Способ осуществляют с интервалами, предпочтительно используя множество интервалов на протяжении программы модулирования, и за прогрессом у животного наблюдают путем сравнения результатов применения способа в двух или более точках в ходе программы модулирования. Изменение экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в частности, ассоциированных с жирами генов, или картины генной экспрессии, или отсутствие какого-либо изменения, определенное в результате сравнения, свидетельствует об эффективности программы модулирования. Например, можно провести мониторинг программы модулирования жировой ткани, предназначенного для уменьшения количества жировой ткани у животного, и показать, что она эффективна, если количество генной экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в частности, ассоциированных с жирами генов, снижается с течением времени в ответ на стимул в программе. Подобным образом, программа увеличения жировой ткани у худого или чрезмерно худого животного должна увеличивать профиль экспрессии таких генов. Может быть разработана программа модулирования для того, чтобы модулировать количество жировой ткани у животного, такая как программа питания, физической нагрузки, применения лекарственных средств или другая сходная программа.

В следующем аспекте изобретение относится к способу измерения влияния тестируемого вещества на профиль экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, и к способу скрининга тестируемого вещества, чтобы определить, возможно ли его применение для модулирования количества жировой ткани у животного. Способы включают (a) определение первого профиля экспрессии посредством измерения продуктов транскрипции или трансляции двух или более полинуклеотидов, выбранных из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3, или их применимых вариантов в тест-системе в отсутствие тестируемого вещества; (b) определение второго профиля экспрессии посредством измерения продуктов транскрипции или трансляции двух или более полинуклеотидов, выбранных из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3, или их применимых вариантов в тест-системе в присутствии тестируемого вещества; и (c) сравнение первого профиля экспрессии со вторым профилем экспрессии.

Изменение во втором профиле экспрессии по сравнению с первым профилем экспрессии в 1,3 раза или более свидетельствует о том, что тестируемое вещество влияет на экспрессию генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, и что тестируемое вещество вероятно может быть использовано для модулирования количества жировой ткани у животного. В предпочтительном варианте осуществления генами, дифференциально экспрессируемыми у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, являются ключевые гены, ассоциированные с метаболизмом жирных кислот, и изменение является 1,3-кратным или большим изменением экспрессии по меньшей мере двух генов в первом профиле экспрессии по сравнению со вторым профилем экспрессии. Изобретение также относится к веществам, идентифицированным с использованием такого способа.

В одном варианте осуществления полинуклеотиды выбирают из полинуклеотидов, указанных в таблице 3, или их применимых вариантов, и изменение является 1,3-кратным или большим.

В одном варианте осуществления тест-система представляет собой тест-систему in vitro, такую как культура ткани, клеточный экстракт или клеточная линия. В другом случае тест-система представляет собой тест-систему in vivo, т.е. животное, такое как собака. В других вариантах осуществления тест-система представляет собой тканевую систему ex vivo или виртуальную систему.

Тестируемым веществом может быть любое вещество, которое может влиять на полинуклеотиды или гены, дифференциально экспрессируемые у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в частности, на ассоциированные с жирами гены. Тестируемые вещества включают, но без ограничения, аминокислоты, белки, пептиды, полипептиды, нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, малые молекулы, макромолекулы, витамины, минералы, простые сахара, сложные сахара, полисахариды, углеводы, триглицериды со средней длиной цепи (MCT); триацилглицериды (TAG); n-3 (омега-3) жирные кислоты, включая ДГК, ЭПК, АЛК; n-6 (омега-6) жирные кислоты, включая ЛК, γ-линоленовую кислоту (ГЛК) и АРК; СК, МК, конъюгированную линолевую кислоту (КЛК); источники холина, такие как лецитин; жирорастворимые витамины, включая витамин A и его предшественники, такие как каротиноиды (например, β-каротин), источники витамина D, такие как витамин D₂ (эргокальциферол) и витамин D₃ (холекальциферол), источники витамина E, такие как токоферолы (например, α-токоферол) и токотриенолы, и источники витамина K, такие как витамин K₁ (филлохинон) и витамин K₂ (менадион); водорастворимые витамины, включая витамины B, такие как рибофлавин, ниацин (включая никотинамид и никотиновую кислоту), пиридоксин, пантотеновая кислота, фолиевая кислота, биотин и кобаламин; и витамин C (аскорбиновую кислоту); антиоксиданты, включая некоторые витамины, перечисленные выше, особенно витамины E и C; также биофлавоноиды, такие как катехин, кверцетин и теафлавин; хиноны, такие как убихинон; каротиноиды, такие как ликопен и ликоксантин; ресвератрол; и α-липоевую кислоту; L-карнитин; D-лимонен; глюкозамин; S-аденозилметионин; и хитозан. В предпочтительном варианте осуществления тестируемыми веществами являются питательные вещества, которые можно добавлять к пище или употреблять в виде добавок. Примерами, но без ограничения, являются жирные кислоты, такие как жирные кислоты омега-3 (например, ДГК и ЭПК) и жирные кислоты омега-6 (например, АРК), карнитин, метионин, витамин C, витамин E и витамин D.

В предпочтительном варианте осуществления вещества, полезные для оказания воздействия на экспрессию генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в частности, ассоциированных с жирами генов, могут быть идентифицированы с использованием способов, описанных в совместно рассматриваемой предварительной патентной заявке США No. 60/657980, поданной 2 марта 2005, и любой более поздней патентной заявке США или иностранной патентной заявке, по которым испрашивается приоритет на эту тему.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к способу составления прогноза, по которому животное вероятно будет иметь избыточную массу, или постановки диагноза наличия ожирения у животного. Способ включает определение того, имеется ли дифференциальная экспрессия одного или нескольких полинуклеотидов, выбранных из таблиц 1 и 2, или их применимых вариантов, или одного или нескольких полипептидов, которые специфически связываются с белками, продуцируемыми в результате экспрессии одного или нескольких полинуклеотидов, выбранных из таблиц 1, 2, или их применимых вариантов, у данного животного по сравнению с одним или несколькими худыми животными. Животного определяют как животное, которое может приобрести избыточную массу, или определяют как животное, имеющее избыточную массу, если сравнение показывает, что полинуклеотиды дифференциально экспрессируются у данного животного по сравнению с худыми животными с кратностью 1,3 или более.

В различных вариантах осуществления прогноз или диагноз основан на полинуклеотидах, выбранных из таблицы 3, или применимых вариантах осуществления таких полинуклеотидов.

Профиль экспрессии для худых животных, используемых для сравнения, можно получить для одного или нескольких худых животных одновременно с получением профиля экспрессии для тестируемого животного, или из базы данных профилей экспрессии для худых животных. Предпочтительно база данных относительно профилей экспрессии для худых животных, накопленных в течение определенного периода времени, может быть использована в качестве эталона.

Определение того, экспрессируются ли дифференциально полинуклеотиды или полипептиды, можно осуществить посредством выявления полинуклеотидов или полипептидов с использованием способов, известных специалистам в данной области, некоторые из которых описаны в настоящем описании.

В другом аспекте изобретение относится к способу воздействия на геном или экспрессию генома животного, в частности, животного, отличного от человека. Способ включает нарушение экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, предпочтительно с использованием олигонуклеотидов или полинуклеотидов, сконструированных с использованием полинуклеотидов, выбранных из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3, или их применимых вариантов.

Способы воздействия на геном известны специалистам в данной области. Такие способы включают получение трансгенных и нокаутированных животных и нарушение транскрипции или трансляции. В одном варианте осуществления один или несколько полинуклеотидов, выбранных таблиц 1 и 2, или их применимых вариантов, используют для получения конструкта, используемого для нарушения или «нокаута» соответствующего эндогенного гена у животного. Такой способ позволяет получать животное, имеющее нуль-мутацию в таком генном локусе. В других вариантах осуществления у животных наблюдают снижение или полное исключение экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в частности, ассоциированных с жирами генов. Изобретение также относится к животному, полученному с применением такого способа. В различных вариантах осуществления на геном воздействуют, используя один или несколько полинуклеотидов, выбранных из таблицы 3, или применимых вариантов таких последовательностей. Трансгенными животными предпочтительно являются млекопитающие, например, грызуны, такие как мыши и крысы, но может быть другое млекопитающее, такое как кошки и собаки.

Способы воздействия на экспрессию генома известны специалистам в данной области. Такие способы включают использование антисмысловых молекул или молекул миРНК, и применение таких молекул для нарушения трансляции или транскрипции генома. В одном варианте осуществления один или несколько полинуклеотидов, выбранных из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3, или их применимых вариантов, используют для получения антисмысловых и сходных ДНК-связывающих молекул, которые применимы для нарушения транскрипции, или для получения коротких (малых) интерферирующих РНК (миРНК), применимых для функционального нарушения трансляции. Коротко, экспрессию генов ингибируют антисмысловыми молекулами благодаря связыванию с ДНК и предотвращению транскрипции, и молекулами миРНК посредством интерференции РНК (РНК-и) или посттранскрипционному сайленсингу гена (PTGS). Мишени молекул миРНК гомологичны молекулам мРНК для разрушения путем расщепления молекулы мРНК в области, охватываемой молекулой миРНК. Соответственно, миРНК, способные целенаправленно воздействовать и расщеплять мРНК, транскрибированную из ассоциированного с жирами гена, используют для снижения или исключения экспрессии одного или нескольких таких генов. В других вариантах осуществления используют антисмысловые молекулы, способные к связыванию с ДНК, и миРНК, способные целенаправленно воздействовать и расщеплять мРНК, транскрибированную с одного или нескольких полинуклеотидов или генов, выбранных из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3, или их применимых вариантов.

В другом аспекте изобретение относится к композиции, подходящей для воздействия на геном животного. Композиция содержит одно или несколько веществ, которые препятствуют экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в частности, ассоциированных с жирами генов. Предпочтительно вещества содержат олигонуклеотиды или полинуклеотиды, которые связываются с одним или несколькими генами или продуктами их транскрипции и препятствуют их репликации, транскрипции или трансляции, наиболее предпочтительно олигонуклеотиды или полинуклеотиды, сконструированные с использованием полинуклеотидов, выбранных из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3, или их применимых вариантов. В различных вариантах осуществления вещества содержат антисмысловые молекулы или миРНК.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу модулирования экспрессия одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в частности, ассоциированных с жирами генов, или модулирования количества жировой ткани у животного, включающий введение животному модулирующего генную экспрессию или ткань количества композиции, содержащей один или несколько из следующих веществ: ДГК, ЭПК, ЭПК и ДГК, АЛК, ЛК, АРК, СК и МК. В предпочтительных вариантах осуществления композиция содержит, в миллиграммах на килограмм массы тела в сутки (мг/кг/сутки), ДГК в количестве от 1 до 30, предпочтительно от 3 до 15; ЭПК в количестве от 1 до 30, предпочтительно от 3 до 15; комбинированные ЭПК/ДГК (соотношение 1,5:1) в количестве от 4/2 до 30/45, предпочтительно от 9/6 до 18/12; АЛК в количестве от 10 до 100, предпочтительно от 30 до 60; ЛК в количестве от 30 до 600, предпочтительно от 60 до 300; АРК в количестве от 5 до 50, предпочтительно от 15 до 30; СК в количестве от 3 до 60, предпочтительно от 6 до 30; МК в количестве от 3 до 60, предпочтительно от 6 до 30; и КЛК (в качестве контроля) в количестве от 6 до 120, предпочтительно от 12 до 60. Композиция может быть введена животному любым способом или в любой форме, подходящей для такой композиции. Предпочтительно композицию вводят животному перорально в форме пищевой композиции или добавки. Пищевая композиция может быть в любой форме, например, сбалансированной по питательным веществам пищевой композицией, известной в данной области, такой как сухие корма, полувлажные корма и влажные корма для животных, в частности, для домашних животных, таких как кошачьи и собачьи животные. Добавки включают дозированные формы, такие как таблетки, капсулы и подобные формы. В следующем аспекте композицию вводят в комбинации с одним или несколькими лекарственными средствами или другими веществами, которые модулируют количество жировой ткани у животного. Лекарственные средства или вещества включают, но без ограничения, вещества, которые подавляют аппетит, усиливают метаболизм или препятствуют всасыванию конкретных питательных веществ, в частности, из пищи. Примерами, но без ограничения, являются орлистат (блокирует расщепление и всасывание жиров), анорексигенные средства, такие как декседрин (подавляет аппетит), анорексические средства, такие как фенфлурамин и фентермин, и сибутрамин, и фенилпропаноламин.

В другом аспекте изобретение относится к композиции, подходящей для модулирования экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в частности, ассоциированных с жирами генов, или модулирования количества жировой ткани у животного. Композиция содержит модулирующее генную экспрессию или ткань количество одного или нескольких из следующих веществ: ДГК, ЭПК, ЭПК и ДГК, АЛК, ЛК, АРК, СК, МК. В различных вариантах осуществления композиция содержит, в мг/кг/сутки, ДГК в количестве, достаточном для введения животному от 1 до 30; ЭПК в количестве, достаточном для введения животному от 1 до 30; комбинированные ЭПК/ДГК (соотношение 1,5:1) в количестве, достаточном для введения животному от 4/2 до 30/45; АЛК в количестве, достаточном для введения животному от 10 до 100; ЛК в количестве, достаточном для введения животному от 30 до 600; АРК в количестве, достаточном для введения животному от 5 до 50; СК в количестве, достаточном для введения животному от 3 до 60; МК в количестве, достаточном для введения животному от 3 до 60, и КЛК (в качестве контроля) в количестве, достаточном для введения животному от 6 до 120. Такие вещества могут быть использованы для модулирования количества жировой ткани у животного. Предпочтительно вещества влияют на экспрессию множества таких генов. В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит одно или несколько лекарственных средств или других веществ, которые модулируют количество жировой ткани у животного.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способам отбора животного для включения в одну или несколько групп или подгрупп. Способ включает определение профиля экспрессии у животного в отношении (a) полинуклеотидов, выбранных из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3, или их применимых вариантов, или (b) полипептидов, каждый из которых специфически связывается с белками, продуцируемыми в результате экспрессии одного или нескольких полинуклеотидов, выбранных из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3, или их применимых вариантов, и отнесение животного к определенной группе на основании профиля экспрессии. Группы могут представлять собой любые используемые группы, предпочтительно группы, используемые в исследовательском эксперименте, испытании, клиническом испытании или другой сходной категории. Например, группы могут представлять собой группы, используемые в исследовательском эксперименте или клиническом испытании, в котором требуется одна или несколько контрольных групп и одна или несколько групп обработки. В одном варианте осуществления контрольная группа включает худых животных, и группа обработки включает животных с избыточной массой, или в другом случае наоборот. Можно определить профиль экспрессии для множества животных, и животных относят к контрольной группе или группе обработки на основании результатов исследовании профиля, т.е. животные с дифференциальной экспрессией, которая в 1,3 раза или более выше, чем в стандарте, относят к группе с избыточной массой, а животных с дифференциальной экспрессией, которая в 1,3 раза или менее ниже, чем в стандарте, относят к группе худых животных. Способ, в частности, может быть применен для распределения животных в клиническом испытании при тестировании потенциальных лекарственных средств или других веществ в отношении их способности снижать количество жировой ткани у животного.

В другом аспекте изобретение относится к компьютерной системе, подходящей для обработки данных, относящихся к одному или нескольким генам, дифференциально экспрессируемым у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в частности, ассоциированным с жирами генам. Система включает базу данных, содержащую информацию, характеризующую уровень экспрессии одного или нескольких полинуклеотидов, выбранных из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3, или их применимых вариантов, и/или полипептидов, которые специфически связываются с белками, продуцируемыми в результате экспрессии одного или нескольких полинуклеотидов, выбранных из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3, или их применимых вариантов, у худых животных и/или животных с избыточной массой, и пользовательский интерфейс для взаимодействия с базой данных, в частности для введения, обработки и просмотра информации для разных животных или категорий животных, например, худых животных или животных с избыточной массой. В одном варианте осуществления база данных дополнительно содержит информацию, характеризующую уровень активности одного или нескольких полипептидов, кодируемых одним или несколькими полинуклеотидами, выбранными из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3, или их применимых вариантов. В другом случае база данных дополнительно содержит информацию о последовательности одного или нескольких полинуклеотидов, выбранных из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3, или их применимых вариантов. В других вариантах осуществления база данных содержит дополнительную информацию, которая представляет собой предполагаемое описание генов у одного или нескольких видов животных. Компьютерная система представляет собой любое электронное устройство, способное хранить и обрабатывать данные и взаимодействовать с пользователем, например, обычный компьютер или аналитический прибор, предназначенный для облегчения применения настоящего изобретения и вывода результатов, относящихся к статусу животного.

В другом аспекте изобретение относится к способу применения компьютерной системы или настоящего изобретения для представления информации, характеризующей профиль экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в частности, ассоциированных с жирами генов. Способ включает сравнение уровня экспрессии двух или более полинуклеотидов или белков, экспрессированных из полинуклеотидов, выбранных из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3, из образца с профилем экспрессии полинуклеотидов или белков в компьютерной системе.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к наборам, подходящим для определения дифференциальной экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в частности, ассоциированных с жирами генов, в тест-системе. Наборы содержат в отдельных контейнерах в одной упаковке или в отдельных контейнерах в виртуальной упаковке, в зависимости от применения и компонента набора, два или более зондов, подходящих для определения экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, при этом зонды включают (a) полинуклеотиды, выбранные из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3, или их применимых вариантов, или (b) полипептиды, которые специфически связываются с белками, продуцируемыми в результате экспрессии одного или нескольких полинуклеотидов, выбранных из таблиц 1 и 2, и предпочтительно из таблицы 3, или их применимых вариантов, и по меньшей мере один из следующих компонентов (1) инструкции по применению зондов настоящего изобретения; (2) реагенты и оборудование, необходимое для применения зондов; (3) композицию, подходящую для модулирования экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными; (4) композицию, подходящую для нарушения экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными; (5) пищевую композицию, подходящую для модулирования количества жировой ткани у животного; и (6) одно или несколько лекарственных средств или других веществ, которые модулируют количество жировой ткани у животного. В одном предпочтительном варианте осуществления зонды связывают с подложкой, предпочтительно в виде матрицы.

Композиции настоящего изобретения

Изобретение относится к кормовым композициям для собак, содержащим от 26% масс. до 35% масс. сырого белка из расчета на сухую массу, от 7,5% масс. до 8,5% масс. сырого жира из расчета на сухую массу, от 20% масс. до 30% масс. суммарных пищевых волокон из расчета на сухую массу и от 10% масс. до 20% масс. сырых волокон из расчета на сухую массу.

Изобретение также относится к кормовым композициям для кошек, содержащим от 30% масс. до 37% масс. сырого белка из расчета на сухую массу, от 7,5% масс. до 9% масс. сырого жира из расчета на сухую массу, от 30% масс. до 35% масс. суммарных пищевых волокон из расчета на сухую массу и от 20% масс. до 25% масс. сырых волокон из расчета на сухую массу.

В некоторых вариантах осуществления композиции настоящего изобретения могут включать полиненасыщенные жирные кислоты омега-3 в количестве по меньшей мере 0,02% (или от 0,05% масс. до 10% масс., или от 0,1% масс. до 6% масс.) из расчета на сухую массу. В некоторых вариантах осуществления полиненасыщенной жирной кислотой омега-3 является ДГК. В других вариантах осуществления полиненасыщенной жирной кислотой омега-3 является ЭПК. В следующих вариантах осуществления полиненасыщенная жирная кислота омега-3 представляет собой смесь ДГК и ЭПК.

В других вариантах осуществления композиция, содержащая полиненасыщенную жирную кислоту омега-3, представляет собой корм. Хотя предлагаются как жидкие, так и твердые корма, обычно предпочтительными являются твердые корма. Корма включают как сухие корма, так и влажные корма. Некоторые компоненты кормов, не являющиеся полиненасыщенными жирными кислотами, и используемые количественные соотношения указаны ниже.

Композиции корма для собак

Композиции корма для кошек

В одном варианте осуществления композиции для собак настоящего изобретения содержат ингредиенты в количестве, эффективном для улучшения качества жизни животного. Такие композиции, как правило, содержат:

(a) от 26% масс. до 35% масс. сырого белка из расчета на сухую массу,

(b) от 7,5% масс. до 8.5% масс. сырого жира из расчета на сухую массу,

(c) от 20% масс. до 30% масс. суммарных пищевых волокон из расчета на сухую массу, и

(d) от 10% масс. до 20% масс. сырых волокон из расчета на сухую массу.

В другом варианте осуществления изобретение относится к композициям для кошек, которые, как правило, содержат:

(a) от 30% масс. до 37% масс. сырого белка из расчета на сухую массу,

(b) от 7,5% масс. до 9% масс. сырого жира из расчета на сухую массу,

(c) от 30% масс. до 35% масс. суммарных пищевых волокон из расчета на сухую массу, и

(d) от 20% масс. до 25% масс. сырых волокон из расчета на сухую массу.

В другом варианте осуществления композиции, как правило, содержат:

(a) по меньшей мере один из следующих компонентов:

(i) по меньшей мере 0,05% (или от 0,05% до 0,30%, или от 0,1% до 0,30%, или от 0,1% до 0,2%) ДГК, и

(ii) по меньшей мере 0,1% (или от 0,1% до 0,5%, или от 0,2% до 0,5%, или от 0,2% до 0,3%) ЭПК,

(b) по меньшей мере 15% (или от 15% до 55%, или от 30% до 55%, или от 33% до 36%) белка,

(c) по меньшей мере 9% (или от 9% до 35%, или от 18% до 35%, или от 18% до 24%) жира, и

(d) по меньшей мере один из следующих компонентов:

(i) по меньшей мере 250 МЕ/кг (или от 250 МЕ/кг до 1500 МЕ/кг или от 500 МЕ/кг до 1500 МЕ/кг, или от 500 МЕ/кг до 1100 МЕ/кг) витамина E,

(xii) по меньшей мере 50 ч./млн (или от 50 ч./млн до 300 ч./млн, или от 100 ч./млн до 300 ч./млн, или от 100 ч./млн до 200 ч./млн) витамина C,

(xiii) по меньшей мере 1100 ч./млн (или от 1100 ч./млн до 3500 ч./млн, или от 2300 ч./млн до 3500 ч./млн, или от 2300 ч./млн до 2350 ч./млн) таурина, и

(xiv) по меньшей мере 200 ч./млн (или от 200 до 750 ч./млн, или от 400 ч./млн до 750 ч./млн, или от 400 до 525 ч./млн) карнитина, и

(xv) по меньшей мере 0,05% (или от 0,05% до 0,6%, или от 0,1% до 0,6%, или от 0,1% до 0,4%) цистина.

В другом варианте осуществления композиции, как правило, содержат:

(a) 0,02% (или от 0,05% до 10%, или от 0,1% до 6%), по меньшей мере одной полиненасыщенной жирной кислоты омега-3, и

(b) по меньшей мере один из следующих компонентов:

(xvi) от 10% до 55% (или от 18% до 30%, или от 33% до 55% или от 18% до 20% или от 33% до 36%) белка,

(xvii) от 7% до 35% (или от 18% до 35%, или от 7% до 24%, или от 14% до 24%, или от 14% до 16% или от 18% до 24%) жира,

(xviii) по меньшей мере 0,05 (или от 0,05 ч./млн до 7500 ч./млн, или от 250 ч./млн до 3600 ч./млн, или от 250 ч./млн до 1650 ч./млн, или от 5 ч./млн до 225 ч./млн, или от 0,05 ч./млн до 2,4 ч./млн) антиоксиданта, и

(xix) по меньшей мере 1000 ч./млн (или от 1000 ч./млн до 5000 ч./млн, от 3300 ч./млн до 5000 ч./млн, или от 2000 ч./млн до 3000 ч./млн, или от 3000 ч./млн до 4000 ч./млн) холина.

В другом варианте осуществления композиции, как правило, содержат:

(a) по меньшей мере один из следующих компонентов:

(i) по меньшей мере 0,02% (или от 0,02% до 0,3%, или от 0,05% до 0,3%, или от 0,05% до 0,2%) ДГК, и

(ii) по меньшей мере 0,1% (или от 0,1% до 0,5%, или от 0,2% до 0,5%, или от 0,2% до 0,3%) ЭПК,

(b) по меньшей мере 9% (или от 9% до 30%, или от 18% до 30%, или от 18% до 20%) белка,

(c) по меньшей мере 7% (или от 7% до 24%, или от 14% до 24%, или от 14% до 16%) жира,

(d) по меньшей мере один из следующих компонентов:

(i) по меньшей мере 250 МЕ/кг (или от 250 МЕ/кг до 1500 МЕ/кг, или от 500 МЕ/кг до 1500 МЕ/кг, или от 500 МЕ/кг до 1000 МЕ/кг) витамина E,

(xx) по меньшей мере 50 ч./млн (или от 50 ч./млн до 500 ч./млн, или от 100 ч./млн до 500 ч./млн, или от 100 ч./млн до 301 ч./млн) витамина C,

(xxi) по меньшей мере 600 ч./млн (или от 600 ч./млн до 2400 ч./млн, или от 1260 ч./млн до 2400 ч./млн, или от 1260 ч./млн до 1545 ч./млн) таурина, и

(xxii) по меньшей мере 50 ч./млн (или от 50 ч./млн до 200 ч./млн, или от 100 до 160, или от 100 до 155) липоевой кислоты, и

(xxiii) по меньшей мере 50 ч./млн (или от 50 ч./млн до 500 ч./млн, или от 200 ч./млн до 500 ч./млн, или от 200 ч./млн до 350 ч./млн) карнитина,

(e) по меньшей мере 1000 ч./млн (или от 1000 ч./млн до 3200 ч./млн, или от 2000 ч./млн до 3200 ч./млн, или от 2000 ч./млн до 2500 ч./млн) холина,

(f) по меньшей мере 50 ч./млн (или от 50 ч./млн до 150 ч./млн, или от 100 ч./млн до 150 ч./млн, или от 100 ч./млн до 110 ч./млн) марганца, и

(g) по меньшей мере 0,4% (или от 0,4% до 2%, или от 0,9% до 2%, или от 0,9% до 1,2%) лизина, и

(h) по меньшей мере от 0,4% до 1,5% метионина.

В другом варианте осуществления композиции, как правило, содержат:

(a) по меньшей мере один из следующих компонентов:

(i) по меньшей мере 0,02% (или от 0,02% до 0,3%, или от 0,05% до 0,3%, или от 0,05% до 0,2%) ДГК, и

(ii) по меньшей мере 0,1% (или от 0,1% до 0,5%, или от 0,2% до 0,5%, или от 0,2% до 0,3%) ЭПК,

(b) по меньшей мере 9% (или от 9% до 30%, или от 18% до 30%, или от 18% до 20%) белка,

(c) по меньшей мере 7% (или от 7% до 24%, или от 14% до 24%, или от 14% до 16%) жира,

(d) по меньшей мере один из следующих компонентов:

(i) по меньшей мере 250 МЕ/кг (или от 250 МЕ/кг до 1500 МЕ/кг, или от 500 МЕ/кг до 1500 МЕ/кг, или от 500 МЕ/кг до 1000 МЕ/кг) витамина E,

(xxiv) по меньшей мере 50 ч./млн (или от 50 ч./млн до 500 ч./млн, или от 100 ч./млн до 500 ч./млн, или от 100 ч./млн до 301 ч./млн) витамина C,

(xxv) по меньшей мере 600 ч./млн (или от 600 ч./млн до 2400 ч./млн, или от 1260 ч./млн до 2400 ч./млн, или от 1260 ч./млн до 1575 ч./млн) таурина, и

(xxvi) по меньшей мере 50 ч./млн (или от 50 ч./млн до 200 ч./млн, или от 100 до 160, или от 100 до 155) липоевой кислоты, и

(xxvii) по меньшей мере 50 ч./млн (или от 50 ч./млн до 500 ч./млн, или от 200 ч./млн до 500 ч./млн, или от 200 ч./млн до 350 ч./млн) карнитина,

(e) по меньшей мере 1000 ч./млн (или от 1000 ч./млн до 3200 ч./млн, или от 2000 ч./млн до 3200 ч./млн, или от 2000 ч./млн до 2500 ч./млн) холина,

(f) по меньшей мере 50 ч./млн (или от 50 ч./млн до 150 ч./млн, или от 100 ч./млн до 150 ч./млн, или от 100 ч./млн до 110 ч./млн) марганца, и

(g) по меньшей мере 0,4% (или от 0,4% до 2%, или от 0,9% до 2%, или от 0,9% до 1,2%) лизина, и

(h) по меньшей мере от 0,4% до 1,5% метионина.

В другом варианте осуществления композиции, как правило, содержат:

(a) по меньшей мере один из следующих компонентов:

(i) по меньшей мере 0,05% (или от 0,05% до 0,30%, или от 0,1% до 0,30%, или от 0,1% до 0,2%) ДГК, и

(ii) по меньшей мере 0,1% (или от 0,1% до 0,5%, или от 0,2% до 0,5%, или от 0,2% до 0,3%) ЭПК,

(b) по меньшей мере 15% (или от 15% до 55%, или от 30% до 55%, или от 33% до 36%) белка,

(c) по меньшей мере 9% (или от 9% до 35%, или от 18% до 35%, или от 18% до 24%) жира,

(d) по меньшей мере один из следующих компонентов:

(i) по меньшей мере 250 МЕ/кг (или от 250 МЕ/кг до 1500 МЕ/кг, или от 500 МЕ/кг до 1500 МЕ/кг, или от 500 МЕ/кг до 1100 МЕ/кг) витамина E,

(xxviii) по меньшей мере 50 ч./млн (или от 50 ч./млн до 300 ч./млн, или от 100 ч./млн до 300 ч./млн, или от 100 ч./млн до 200 ч./млн) витамина C,

(xxix) по меньшей мере 1100 ч./млн (или от 1100 ч./млн до 3500 ч./млн, или от 2300 ч./млн до 3500 ч./млн, или от 2300 ч./млн до 2350 ч./млн) таурина, и

(xxx) по меньшей мере 200 ч./млн (или от 200 до 750 ч./млн, или от 400 ч./млн до 750 ч./млн, или от 400 до 525 ч./млн) карнитина, и

(xxxi) по меньшей мере 0,05% (или от 0,05% до 0,6%, или от 0,1% до 0,6%, или от 0,1% до 0,4%) цистеина,

(e) по меньшей мере 1600 ч./млн (или от 1600 ч./млн до 5000 ч./млн, или от 3300 ч./млн до 5000 ч./млн, или от 3300 ч./млн до 3400 ч./млн) холина,

(f) по меньшей мере 50 ч./млн (или от 50 ч./млн до 150 ч./млн, или от 100 ч./млн до 150 ч./млн, или от 100 ч./млн до 110 ч./млн) марганца, и

(g) по меньшей мере 0,7% (или от 0,7% до 3%, или от 1,4% до 3%, или от 1,4% до 1,7%) лизина, и

(h) по меньшей мере от 0,4% до 1,5% метионина.

Способы лечения или профилактики заболеваний и расстройств

Изобретение относится к способам лечения или профилактики заболеваний и расстройств, включающим введение композиций настоящего изобретения, которые эффективны при модулировании экспрессии и/или активности белков, ассоциированных с ожирением у животных, как in vitro, так и in vivo. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что композиции настоящего изобретения являются эффективными в модулировании у животных белков, ассоциированных с ожирением. Не ограничиваясь какой-либо теорией, авторы полагают, что модулирование у животных экспрессии и/или активности белков, ассоциированных с ожирением, может быть использовано для лечения или профилактики расстройства, ассоциированного с аномальными уровнями глюкозы в крови, увеличением массы или уровнями жировых отложений. Изобретение, кроме того, относится к композициям и препаратам, которые могут быть использованы для модулирования активности белков у животных с избыточной массой и/или ожирением. Изобретение также относится к способам модулирования активности белков или генов, включающим введение субъекту, предпочтительно домашнему млекопитающему, нуждающемуся в указанном лечении или профилактике, терапевтически или профилактически эффективного количества композиции для модулирования у субъекта активности белка или гена, ассоциированного с ожирением. В иллюстративном варианте осуществления средством для модулирования киназной активности lyn является соединение настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления композицию настоящего изобретения вводят млекопитающему, предпочтительно домашнему животному, имеющему сердечнососудистое заболевание, дислипидемию, дислипопротеинемию, расстройство метаболизма глюкозы, метаболический синдром (т.е. синдром X), PPAR-ассоциированное расстройство, сепсис, тромботическое расстройство, диабет типа II, ожирение, панкреатит, гипертензию, заболевание почек или воспаление.

В одном варианте осуществления термины «лечение» или «осуществление лечения» относятся к ослаблению заболевания или расстройства или по меньшей мере его одного видимого симптома, предпочтительно ассоциированного с ожирением. В другом варианте осуществления «лечение» или «осуществление лечения» относится к улучшению по меньшей мере одного измеряемого физического параметра, необязательно воспринимаемого животным. В еще одном варианте осуществления «лечение» или «осуществление лечения» относится к ингибированию прогрессирования заболевания или расстройства, либо физически, например, стабилизация видимого симптома, физиологически, например, стабилизация физического параметра, или как физически, так и физиологически. В еще одном варианте осуществления «лечение» или «осуществление лечения» относится к отсрочке появления заболевания или расстройства.

В некоторых вариантах осуществления композиции настоящего изобретения вводят пациенту, предпочтительно домашнему животному, в качестве профилактической меры против таких заболеваний. В используемом в настоящем описании смысле термины «профилактика» или «осуществление профилактики» относятся к уменьшению риска появления данного заболевания или расстройства. В предпочтительном варианте осуществления композиции настоящего изобретения вводят в качестве профилактической меры пациенту, предпочтительно домашнему животному, имеющему генетическую предрасположенность к сердечнососудистому заболеванию, дислипидемии, дислипопротеинемии, расстройству метаболизма глюкозы, метаболическому синдрому (т.е., синдрому X), PPAR-ассоциированному расстройству, сепсису, тромботическому расстройству, диабету типа II, ожирению, панкреатиту, гипертензии, заболеванию почек или воспалению.

В другом иллюстративном варианте осуществления композиции настоящего изобретения вводят в качестве профилактической меры домашнему животному, имеющему предрасположенность к сердечнососудистому заболеванию, дислипидемии, дислипопротеинемии, расстройству метаболизма глюкозы, метаболическому синдрому (т.е., синдрому X), PPAR-ассоциированному расстройству, сепсису, тромботическому расстройству, диабету типа II, ожирению, панкреатиту, гипертензии, заболеванию почек или воспалению. Соответственно, композиции настоящего изобретения можно применять для профилактики одного заболевания или расстройства и одновременно для лечения другого (например, профилактика ожирения и при этом лечение диабета; профилактика воспаления и при этом лечение сердечнососудистого заболевания).

Сердечнососудистые заболевания, подвергаемые лечению или профилактике

Изобретение относится к способам лечения или профилактики сердечнососудистого заболевания, включающим введение домашнему животному терапевтически эффективного количества композиции настоящего изобретения и фармацевтически приемлемого наполнителя. В некоторых вариантах осуществления сердечнососудистое заболевание ассоциировано с аномальной/измененной экспрессией белка. В используемом в настоящем описании смысле термин «сердечнососудистые заболевания» относится к заболеваниям сердца и кровеносной системы. Такие заболевания часто ассоциированы с дислипопротеинемией и/или дислипидемией. Сердечнососудистые заболевания, для профилактики или лечения которых могут быть использованы композиции настоящего изобретения, включают, но без ограничения, артериосклероз; атеросклероз; удар; ишемию; дисфункции эндотелия, в частности, дисфункции, влияющие на эластичность кровеносных сосудов; заболевание периферических сосудов; коронарную болезнь сердца; инфаркт миокарда; церебральный инфаркт и рестеноз.

Дислипидемии, подвергаемые лечению или профилактике

Настоящее изобретение относится к способам лечения или профилактики дислипидемии, включающим введение домашнему животному терапевтически эффективного количества композиции настоящего изобретения и фармацевтически приемлемого наполнителя. В некоторых вариантах осуществления дислипидемия ассоциирована с аномальной/измененной активностью и/или экспрессией киназы lyn. В используемом в настоящем описании смысле термин «дислипидемии» относится к расстройствам, которые приводят или проявляются в виде аномальных уровней циркулирующих липидов. В тех случаях, когда уровни липидов в крови слишком высоки, композиции настоящего изобретения вводят домашнему животному, чтобы восстановить нормальные уровни. Нормальные уровни липидов сообщаются в медицинских трудах, известных специалистам в данной области. Например, рекомендованные уровни в крови ЛПНП, ЛПВП, свободных триглицеридов и других параметров, относящихся к метаболизму липидов, можно найти на веб-сайте Американской ассоциации кардиологов (American Heart Association) и веб-сайте национальной образовательной программы по холестерину Национального института болезней сердца, легких и крови. В настоящее время рекомендованный уровень холестерина ЛПВП в крови составляет более 35 мг/дл; рекомендованный уровень холестерина ЛПНП в крови составляет ниже 130 мг/дл; рекомендованное соотношение холестеринов ЛПНП:ЛПВП в крови ниже 5:1, идеально 3,5:1; и рекомендованный уровень свободных триглицеридов в крови составляет менее 200 мг/дл.

Дислипидемии, для профилактики или лечения которых могут быть использованы композиции настоящего изобретения, включают, но без ограничения, гиперлипидемию и низкие уровни в крови холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). В некоторых вариантах осуществления гиперлипидемией, подвергаемой профилактике или лечению соединениями настоящего изобретения, является семейная гиперхолестеринемия; семейная комбинированная гиперлипидемия; пониженные уровни или недостаточные уровни или активность липопротеинлипазы, включая снижение или недостаточность в результате мутаций липопротеинлипазы; гипертриглицеридемия; гиперхолестеринемия; высокие уровни в крови кетоновых тел (например, β-OH-масляной кислоты); высокие уровни в крови Lp(a)-холестерина; высокие уровни в крови холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП); высокие уровни в крови холестерина липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) и высокие уровни в крови неэтерифицированных жирных кислот.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам изменения метаболизма липидов у пациента, например, уменьшения ЛПНП в крови домашнего животного, уменьшения свободных триглицеридов в крови пациента, увеличения отношения ЛПВП к ЛПНП в крови пациента и ингибирования синтеза омыленных и/или неомыленных жирных кислот, при этом указанные способы включают введение пациенту композиции, содержащей соединение настоящего изобретения в количестве, эффективном для изменения метаболизма липидов.

Дислипопротеинемии, подвергаемые лечению или профилактике

Изобретение относится к способам лечения или профилактики дислипопротеинемии, включающим введение домашнему животному терапевтически эффективного количества композиции настоящего изобретения и фармацевтически приемлемого наполнителя. В используемом в настоящем описании смысле термин «дислипопротеинемии» относится к расстройствам, которые приводят или проявляются в виде аномальных уровней циркулирующих липопротеинов. В том случае, когда уровни липопротеинов в крови слишком высоки, пациенту вводят композиции настоящего изобретения, чтобы восстановить нормальные уровни. Наоборот, в том случае, когда уровни липопротеинов в крови слишком низкие, пациенту вводят композиции настоящего изобретения, чтобы восстановить нормальные уровни. Нормальные уровни липопротеинов указаны в медицинских трудах, известных специалистам в данной области.

Дислипопротеинемии, для профилактики или лечения которых могут быть использованы композиции настоящего изобретения, включают, но без ограничения, высокие уровни в крови ЛПНП; высокие уровни в крови аполипопротеина B (apo B); высокие уровни в крови Lp(a); высокие уровни в крови apo(a); высокие уровни в крови ЛПОНП; низкие уровни в крови ЛПВП; пониженные или недостаточные уровни или активность липопротеинлипазы, включая снижение или недостаточность в результате мутаций липопротеинлипазы; гипоальфалипопротеинемию; аномалии липопротеинов, ассоциированные с диабетом; аномалии липопротеинов, ассоциированные с диабетом типа II, ожирением; аномалии липопротеинов, ассоциированные с болезнью Альцгеймера; и семейную комбинированную гиперлипидемию.

Расстройства метаболизма глюкозы, подвергаемые лечению или профилактике

Изобретение относится к способам лечения или профилактики расстройства метаболизма глюкозы, включающим введение домашнему животному терапевтически эффективного количества композиции настоящего изобретения и фармацевтически приемлемого наполнителя. В используемом в настоящем описании смысле термин «расстройства метаболизма глюкозы» относится к расстройствам, которые приводят или проявляются аномальным накоплением и/или утилизацией глюкозы. В том случае, когда показатели метаболизма глюкозы (т.е. инсулин крови, глюкоза крови) являются слишком высокими, пациенту вводят композиции настоящего изобретения, чтобы восстановить нормальные уровни. Наоборот, в том случае, когда показатели метаболизма глюкозы являются слишком низкими, пациенту вводят композиции настоящего изобретения, чтобы восстановить нормальные уровни. Нормальные показатели метаболизма глюкозы приведены в медицинских трудах, известных специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления расстройство метаболизма глюкозы ассоциировано с аномальной/измененной активностью и/или экспрессией киназы lyn.

Расстройства метаболизма глюкозы, для профилактики или лечения которых могут быть использованы композиции настоящего изобретения, включают, но без ограничения, нарушенную толерантность к глюкозе; резистентность к инсулину; связанную с резистентностью к инсулину злокачественную опухоль молочной железы, ободочной кишки или простаты; диабет, включая, но без ограничения, инсулиннезависимый сахарный диабет (NIDDM), инсулинозависимый сахарный диабет (IDDM), гестационный сахарный диабет (GDM) и диабет зрелого возраста у молодых (MODY); панкреатит; гипертензия; поликистоз яичника; и высокие уровни в крови инсулина и/или глюкозы.

Изобретение, кроме того, относится к способам изменения метаболизма глюкозы у пациента, например, для повышения чувствительности к инсулину и/или потребления кислорода у домашнего животного, при этом указанные способы включают введение домашнему животному композиции, содержащей соединение настоящего изобретения в количестве, эффективном для изменения метаболизма глюкозы.

Лечение или профилактика метаболического синдрома

В используемом в настоящем описании смысле «лечение или профилактика синдрома X или метаболического синдрома» охватывает лечение или профилактику симптома, ассоциированного с метаболическим синдромом, включая, но без ограничения, нарушенную толерантность к глюкозе, гипертензию и дислипидемию и/или дислипопротеинемию. В некоторых вариантах осуществления метаболический синдром ассоциирован с аномальной/измененной активностью и/или экспрессией киназы lyn.

Метаболический синдром характеризуется у пациента группой метаболических факторов риска. Факторы риска, которые ассоциированы с метаболическим синдромом, который можно лечить или предотвращать посредством введения композиции, содержащей соединение настоящего изобретения, включают, но без ограничения, центральный тип ожирения (т.е., наличие избыточной жировой ткани в и вокруг абдоминальной области); атерогенную дислипидемию (жировые расстройства крови, главным образом высокое содержание триглицеридов и низкое содержание холестерина ЛПВП, что стимулирует отложения бляшек в стенках артерий); гипертензия (130/85 мм Hg или выше); резистентность к инсулину или непереносимость глюкозы (организм не может правильно использовать инсулин или сахар крови); протромботический статус (например, высокий уровень фибриногена или ингибитора активатора плазминогена [-1] в крови); и провоспалительное состояние (например, повышенное содержание высокочувствительного C-реактивного белка в крови).

Причинами, лежащими в основе такого синдрома, являются избыточная масса/ожирение, физическая пассивность и генетические факторы, при этом для домашнего животного с метаболическим синдромом существует повышенный риск коронарной болезни сердца, других заболеваний, связанных с отложениями бляшек в стенках артерий (например, удара и болезни периферических сосудов), и диабета типа 2.

Метаболический синдром тесно ассоциирован с генерализованным метаболическим расстройством, называемым резистентностью к инсулину, при котором организм не может эффективно использовать инсулин. Поэтому метаболический синдром также называют синдромом резистентности к инсулину.

Некоторые домашние животные генетически предрасположены к развитию резистентности к инсулину. Приобретенные факторы, такие как избыток жира в организме и физическая пассивность, могут вызвать резистентность к инсулину и метаболический синдром у таких особей. Большинство домашних животных с резистентностью к инсулину имеют центральный тип ожирения. Биологические механизмы на молекулярном уровне, обеспечивающие взаимосвязь между резистентностью к инсулину и метаболическими факторами риска неполностью выяснены, и, по-видимому, являются сложными.

Поэтому композиции настоящего изобретения могут быть использованы для лечения или профилактики метаболического синдрома и расстройств и факторов риска, ассоциированных с метаболическим синдромом.

Лечение или профилактика диабета типа II

В используемом в настоящем описании смысле «лечение или профилактика диабета типа II» охватывает лечение или профилактику осложнения, ассоциированного с диабетом типа II, включая, но без ограничения, ретинопатию (т.е. слепоту); невропатию (т.е. повреждение нервов), которая приводит к язвам стопы, гангрене и ампутациям; повреждение почек, которое приводит к диализу; и сердечнососудистое заболевание. В некоторых вариантах осуществления диабет типа II ассоциирован с аномальной/измененной активностью и/или экспрессией киназы lyn.

Диабет типа II ассоциирован с ожирением и старением. Это зависимое от образа жизни заболевание, и оно имеет сильную генетическую компоненту (конкордантность у близнецов составляет 80-90%). По-видимому, проблема не столько в продуцировании инсулина, сколько в том, что когда инсулин достигает клеток-мишеней, он не может правильно работать. Большинство пациентов с диабетом типа II сначала имеют высокие уровни инсулина наряду с высоким содержанием сахара в крови. Однако так как сахар дает сигналы поджелудочной железе к высвобождению инсулина, то больные диабетом типа II, в конце концов, становятся резистентными к такому сигналу и эндокринная поджелудочная железа вскоре перестает производить достаточно инсулина. Для того чтобы справиться с заболеванием, таким домашним животным, в конце концов, нужен инсулин, и они нуждаются в намного более высоких дозах, так как они резистентны к нему.

Когда домашнее животное имеет высокую нагрузку сахаром, сахар стимулирует поджелудочную железу к высвобождению инсулина. Мишенями инсулина являются клетки мышц, жировые клетки и клетки печени. Такие клетки имеют участки рецепторов инсулинов на внешней стороне клеточной мембраны. У большинства домашних животных в том случае, когда инсулин связывается с рецепторами, начинается каскад событий, который приводит к транспорту сахара из крови во внутреннюю часть клетки. У больных диабетом типа II, даже когда инсулин присутствует на клеточной мембране, процесс не работает. Глюкоза никогда не перемещается в клетку и остается кровотоке.

Печень ответственна на продуцирование глюкозы, а инсулин является регуляторным средством продуцирования глюкозы. Высокое содержание сахара в крови заставляет поджелудочную железу высвобождать инсулин, и инсулин должен передавать сигнал печени, чтобы остановить продуцирование сахаров. Но у больных диабетом существует резистентность к такому сигналу, и печень продолжает продуцировать глюкозу. Гипергликемия приводит к токсичности глюкозы.

Патологическим процессом при диабете является невысокое содержание сахара в крови и осложнения в результате высокого содержания сахара в крови. Основной проблемой, стоящей перед врачами, является то, что некоторые пациенты с высоким содержанием сахара в крови чувствуют себя хорошо; трудно лечить заболевания, которые являются бессимптомными, так как большинство пациентов не хотят принимать таблетку из-за того, что они не чувствуют себя плохо. Поэтому композиции, содержащие соединение настоящего изобретения, могут быть использованы для лечения или профилактики диабета типа II или осложнений, возникающих в результате диабета типа II, и расстройств и факторов риска, ассоциированных с метаболическим синдромом. Осложнения диабета включают, но без ограничения, диабетическую невропатию, диабетическую ретинопатию, эректильную дисфункцию и заболевание почек, и соединения настоящего изобретения могут быть использованы для лечения или профилактики таких осложнений.

Лечение или профилактика ожирения

В используемом в настоящем описании смысле термин «лечение или профилактика ожирения» охватывает лечение или профилактику осложнения, ассоциированного с ожирением. Осложнения ожирения включают, но без ограничения, гиперхолестеринемию, гипертензию, дислипидемию (например, высокий уровень общего холестерина или высокие уровни триглицеридов), диабет типа 2, коронарную болезнь сердца, удар, заболевание желчного пузыря, остеоартрит, апноэ во сне и проблемы с дыханием, и некоторые злокачественные опухоли (эндометрия, молочной железы и ободочной кишки). В некоторых вариантах осуществления ожирение ассоциировано с аномальной/измененной активностью и/или экспрессией киназы lyn.

Другие заболевания, подвергаемые лечению или профилактике

Настоящее изобретение относится к способам лечения или профилактики сепсиса, тромботических расстройств, панкреатита, гипертензии, воспаления и импотенции, включающим введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления такие расстройства ассоциированы с аномальной/измененной активностью и/или экспрессией киназы lyn.

В используемом в настоящем описании смысле термин «лечение или профилактика сепсиса» охватывает лечение или профилактику септического шока.

В используемом в настоящем описании смысле термин «лечение или профилактика тромботических расстройств» охватывает лечение или профилактику высоких уровней в крови фибриногена и стимуляцию фибринолиза.

Кроме лечения или профилактики ожирения композиции настоящего изобретения можно вводить пациенту, чтобы стимулировать снижение массы пациента.

Наборы настоящего изобретения

Когда набор содержит виртуальную упаковку, набор ограничен инструкциями в виртуальной среде в комбинации с одним или несколькими физическими компонентами набора. В одном варианте осуществления набор содержит зонды и/или другие физические компоненты, и инструкции по применению зондов и других компонентов доступны в интернете. Набор может содержать дополнительные объекты, такие как устройство для смешивания образцов, зонды и реагенты, и устройство для использования набора, например, лабораторные пробирки или посуда для смешивания.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к средствам передачи информации или инструкций, относящихся к одному или нескольким из следующих применений: (1) применение полинуклеотидов настоящего изобретения для выявления в образце экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, (2) применение полинуклеотидов настоящего изобретения для измерения влияния тестируемого вещества на экспрессию одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, (3) применение полинуклеотидов настоящего изобретения для скрининга тестируемого вещества с целью определения того, возможно ли его использование для модулирования количества жировой ткани у животного, (4) применение полинуклеотидов настоящего изобретения для составления прогноза вероятности появлении избыточной массы у животного или для постановки диагноза, что животное является тучным, (5) применение полинуклеотидов настоящего изобретения для обработки генома животного, отличного от человека, или экспрессии генома животного, (6) применение полинуклеотидов настоящего изобретения для модулирования экспрессии одной или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в частности ассоциированных с жирами генов, или для модулирования количества жировой ткани у животного, (7) применение полинуклеотидов настоящего изобретения для отбора животного для включения его в одну или несколько групп, (8) применение полинуклеотидов настоящего изобретения для использования компьютерной системы для обработки данных, относящихся к генам, дифференциально экспрессируемым у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными, в частности, ассоциированным с жирами генов, (9) введение веществ настоящего изобретения животному, отдельно или в комбинации с другими элементами настоящего изобретения, (10) применение веществ настоящего изобретения для модулирования количества жировой ткани у животного, (11) применение компьютерной системы настоящего изобретения, (12) применение наборов настоящего изобретения, и (13) инструкций по применению способов и композиций настоящего изобретения с одним или несколькими лекарственными средствами или другими веществами, которые модулируют количество жировой ткани у животного. Средства включают документ, цифровую запоминающую среду, оптическое запоминающее устройство, представление звуковыми средствами или визуальное изображение, содержащие информацию или инструкции. В некоторых вариантах осуществления средством связи является выведение на устройство отображения веб-сайта, визуальное изображение, автономная императивная система мультимедиа со свободным доступом, брошюра, товарная этикетка, вкладыш в упаковку, рекламное объявление, проспект, публичное сообщение, лента для звукозаписи, видеопленка, DVD, CD-ROM, компьютерный считываемый чип, компьютерная считываемая карта, компьютерный считываемый диск, память компьютера или их комбинация, содержащая такую информацию или инструкции. Используемая информация включает информацию по одному или нескольким из следующих пунктов (1) информацию о способах, способствующих здоровью и хорошему самочувствию животных и (2) контактная информация для людей, ухаживающих за животными, по применению, если они имеют вопрос по изобретению и его применению. Полезные инструкции включают методики применения зондов, инструкции по осуществлению анализа экспрессии генов и инструкции о количествах и частоте введения веществ. Средства связи могут быть использованы для инструктирования относительно преимуществ применения настоящего изобретения.

В настоящем описании раскрыты конкретные иллюстративные варианты осуществления изобретения, и хотя использованы специальные термины, они использованы только в общем и описательном смысле, а не в целях ограничения, так как возможны многие модификации и изменения изобретения в свете инструкций, приведенных в настоящем описании. Изобретение, кроме того, может быть проиллюстрировано следующими ниже примерами, хотя следует понимать, что такие примеры включены только в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения, если специально не указано иное.

Примеры

Материалы и способы

Выделение рибонуклеиновой кислоты (РНК) из ткани

Образцы ткани, которые были собраны, замораживали в жидком азоте и размораживали, гомогенизировали и обрабатывали, используя способ экстракции РНК TRIzol®, получая РНК хорошего качества, которую затем подвергали дальнейшему анализу генома.

Материалы: лед, жидкий азот, замороженная ткань собаки или кошки, реагент для лизиса TRIzol®, хлороформ не менее 99%, изопропиловый спирт, 70% этанол (полученный с использованием абсолютного этанола и деионизованной не содержащей РНКаз воды), РНКаза Zap®, деионизованная вода, раствор для хранения РНК Ambion.

Оборудование: гомогенизатор Ultra-Turrax T25 Power, центрифуга Beckman Coulter Allegra 25R, центрифуга Eppendorf, пинцеты, скальпель, твердая поверхность для резки, т.е. доска для резки, микроцентрифужные пробирки, не содержащие ДНКазы и РНКазы, объемом 1,5 мл, одноразовые не содержащие ДНКазы и РНКазы/стерильные полипропиленовые пробирки, объемом 50 мл, пипетки P1000, P200, P20, P1O и P2 Rainin Pipetman, наконечники пипеток с фильтрами для пипеток P1000, P200, P20, P10 и P2, не содержащие ДНКазы и РНКазы/стерильные и неворсистые салфетки.

Подготовка: готовят полипропиленовые пробирки объемом 50 мл с 4 мл TRIzol® (одна пробирка для каждой ткани, выбранной для выделения РНК).

Гомогенизация ткани: Наполняют емкость, способную удерживать жидкий азот, 3-4 ложками жидкого азота. Сразу помещают кусочек замороженной ткани в указанную выше емкость (ткань должна иметь размер горошины) и помещают ткань в подходящую помеченную полипропиленовую пробирку объемом 50 мл (которая уже содержит 4 мл TRIzol®). Сразу же начинают гомогенизацию, используя гомогенизатор Ultra-Turrax T25 Power. Гомогенизируют при наиболее высоких параметрах установки (6) в течение 10-15 секунд. Охлаждают образец на льду еще в течение 10-15 секунд и затем повторяют обработку. Обработку продолжают вплоть до полной гомогенизации ткани и пока раствор не станет мутным. После завершения гомогенизации пробирку объемом 50 мл закрывают и возвращают на лед. Гомогенизированную ткань инкубируют при комнатной температуре в течение 5 минут перед обработкой с использованием способа выделения.

Выделение РНК: Обычно следуют методикам, приведенным в инструкциях Invitrogen, прилагаемых к реагенту TRIzol®. Разделяют гомогенизированный образец на четыре аликвоты объемом 1 мл в четыре микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Добавляют 200 мкл хлороформа к каждой аликвоте объемом 1 мл. Пробирки закрывают, встряхивают с вихревым перемешиванием в течение 15 секунд и затем встряхивают в направлении вверх и вниз. В результате должна получиться розовая молочная жидкость. Пробирки инкубируют при комнатной температуре в течение 2-3 минут. Пробирки центрифугируют в течение 15 минут при 14000 об/мин и 4°C. Водную фазу (верхний слой) переносят в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Обычно объем водной фазы, которую следует перенести в новую пробирку, составляет 500 мкл. Убеждаются, что не перенесли ни промежуточной фазы, ни нижней фазы. РНК осаждают из раствора добавлением 500 мкл изопропилового спирта в каждую микроцентрифужную пробирку, содержащую водный слой. Пробирки встряхивают вверх и вниз в течение по меньшей мере 20 секунд. Образцы инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут. Образцы центрифугируют в течение 10 минут при 14000 об/мин и 4°C. Супернатант осторожно удаляют аспирацией жидкости, стараясь не потерять осадок. Добавляют 1 мл 70% этанола, для промывки осадка. Осадок сдвигают с места резким встряхиванием пробирки (или постукиванием пробирки о рабочую поверхность стола) и встряхивают для перемешивания. Центрифугируют в течение 5 минут при 8200 об/мин и 4°C. Осторожно удаляют супернатант аспирацией, стараясь не потерять осадок. Используя неворсистую салфетку, осторожно промокают избыток этанола, чтобы подсушить осадок. Каждый осадок ресуспендируют в 30 мкл раствора для сохранения РНК. Осторожно перемешивают пипетированием, пока РНК снова не перейдет в раствор, и затем хранят при -80°C. Может быть необходимо вихревое встряхивание образца в течение нескольких секунд с низкой скоростью, чтобы облегчить ресуспендирование РНК. При необходимости перед замораживанием образцы центрифугируют, используя микроцентрифугу.

Очистка РНК: Следующие способы описаны в руководстве RNeasy® Mini.

Выделение РНК из клеток, культивированных в камерах OptiCell, с использованием мининабора RNeasy

Культивированные клетки клеточных линий млекопитающих используют для выделения РНК хорошего качества, которую затем используют для будущего анализа генома вниз по ходу транскрипции. Всю работу, связанную с культивированием клеток, необходимо осуществлять в абсолютно асептических условиях.

Реагенты: 10X PBS, деионизованная H₂O, абсолютный этанол, раствор для хранения РНК, β-меркаптоэтанол, РНКаза Zap®, буфер RLT и буфер RW1 и буфер RPE (поставляемый в мининаборе RNeasy).

Оборудование/Материалы: Мининабор RNeasy, центрифужные колонки QIAshredder, скальпель OptiCell, стерильный шприц на 20 мл, наконечники OptiCell, скребок для клеток, пипетка Pipetman P1000, Rainin, пипетка Pipetman P200, Rainin, наконечники к пипеткам с фильтрами 100-1000 мкл, наконечники к пипетками с фильтрами 1-200 мкл, стерильные пипетки для переноса, стерильный лоток для раствора объемом 55 мл, стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и микроцентрифуга Eppendorf.

Растворы: Буфер RLT (исходный раствор, поставляемый в мининаборе RNeasy) добавляют 100 мкл β-меркаптоэтанола на 10 мл буфера RLT перед началом выполнения протокола. 70% этанол: готовят 50 мл 70% этанола добавлением 35 мл абсолютного этанола к 15 мл деионизованной не содержащей РНКаз воды. 1X PBS: не содержащая РНКаз вода. Раствор фильтруют, используя 0,22 мкм-фильтр.

Способ: Извлечение клеток из камеры OptiCell (обрабатывают одну камеру OptiCell за один раз). Проверяют клетки под микроскопом, чтобы гарантировать, что клетки являются живыми перед выделением РНК. Удаляют и отбрасывают среду культивирования клеток. Используя скальпель OptiCell, срезают верхнюю мембрану, раскрывая клетки на нижней мембране. Мембрану, на которой прикреплены клетки, промывают три раза 1X PBS. Пипеткой вносят 600 мкл буферного раствора RLT (содержащего β-меркаптоэтанол) в центр мембраны, на которой прикреплены клетки. Используя скребок для клеток, осторожно распределяют буфер RLT по всей поверхности мембраны и затем собирают жидкость в одном углу. Пипеткой собирают весь объем буфера RLT и помещают в центрифужную колонку QIAshredder.

Выделение РНК: Центрифугируют центрифужные колонки QIAshredder при 14000 об/мин в течение 2 минут. Убирают центрифужную колонку, но оставляют пробирку для сбора и ее содержимое. В пробирку для сбора добавляют 600 мкл 70% этанола и тщательно перемешивают пипетированием (теперь суммарный объем составляет 1,2 мл). Переносят 600 мкл клеточного лизата в миниколонку RNeasy и центрифугируют в течение 15 секунд при 14000 об/мин. Удаляют проходящий поток, но оставляют пробирку для сбора и центрифужную колонку. Переносят остальной объем клеточного лизата (~600 мкл) в центрифужную колонку и повторяют центрифугирование. Удаляют проходящий поток, но оставляют пробирку для сбора и центрифужную колонку. В центрифужную колонку добавляют 700 мкл буфера RW1. Центрифугируют в течение 15 секунд при 14000 об/мин, чтобы промыть колонку. Удаляют проходящий поток и пробирку для сбора. Переносят центрифужную колонку в новую пробирку для сбора объемом 2 мл и в колонку добавляют 500 мкл буфера RPE. Центрифугируют в течение 15 секунд при 14000 об/мин. Удаляют проходящий поток, оставляя пробирку для сбора/колонку. В колонку добавляют еще 500 мкл буфера RPE. Центрифугируют в течение 2 минут при 14000 об/мин. Центрифужную колонку переносят в пробирку для сбора объемом 1,5 мл. Добавляют 30 мкл раствора для хранения РНК непосредственно на мембрану из силикагеля и центрифугируют в течение 1 минуты при 14000 об/мин, чтобы элюировать РНК. Конечную РНК хранят при -70°C.

Анализ RNA 6000 Nano

Используя биоанализатор Agilent 2100 и анализ RNA 6000 Nano, анализируют РНК, выделенную из культивированных клеток млекопитающих, лимфоцитов или тканей в отношении качества.

Реагенты: гелевый матрикс RNA 6000 Nano, концентрат красителя RNA 6000 Nano, маркер RNA 6000 Nano (все указанные выше реагенты входят в набор для анализа RNA 6000 Nano, Agilent), лэддер RNA 6000, РНКаза Zap и не содержащая РНКаз вода из Ambion.

Оборудование/другие материалы: Agilent Chip Priming Station, Agilent, чип RNA 6000, Agilent, очистители электродов, стерильные пипетки P2, P10, P200 и P1000 Rainin Pipetman, не содержащие ДНКазы/РНКазы наконечники для пипеток с фильтрами, стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, вихревой встряхиватель, вихревая мешалка IKA, микроцентрифуга и нагревательный блок.

Способ: Способ приведен в руководстве к набору реагентов для анализа RNA 6000 Nano, редакция в ноябре 2003, Agilent Technologies. Способ осуществляют, как описано в руководстве, со следующими модификациями: Приготовление геля, стр. 17 - вместо того, чтобы разделять профильтрованный гель на аликвоты по 65 мкл каждая, исходный профильтрованный гель сохраняют в исходной микроцентрифужной пробирке и отбирают аликвоты по 65 мкл при необходимости. Загрузка маркера RNA 6000 Nano, стр. 22 - добавляют 1 мкл не содержащей РНКазы воды (вместо маркера RNA 6000 Nano) в каждую лунку для образцов, которая не должна содержать образца. Это не только позволит сберечь некоторое количество используемого маркера, но также служит в качестве негативного контроля, чтобы видеть, что ни один из реагентов не содержит примесей, включая не содержащую РНКаз воду. Загрузка лэддера и образцов, стр. 23 - с помощью нагревания денатурируют образцы и лэддер RNA 6000 дополнительно в течение 30 секунд (всего 2,5 минуты) при 71°C. Начало работы чипа, стр. 26 - выбирают опцию «Eukaryote Total RNA Nano» в меню анализа.

Анализ экспрессии с использованием Genechip Affymetrix

Экспрессию генов анализируют, используя GeneChip® Affymetrix Canine 1 и Canine 2. Матрицы коммерчески доступны от Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA 95051. Суммарную РНК обратно транскрибируют в кДНК. кДНК используют для создания кРНК, которую фрагментируют и используют в качестве зондов для гибридизации на чипах GeneChip. Чипы с генами промывают и измеряют сигнал гибридизации с использованием лазерного сканнера Affymetrix. Затем данные по гибридизации подтверждают и нормализуют для последующего анализа.

Материалы: Affymetrix поставляет большинство реагентов и набор. Другие реагенты, перечисленные в руководстве Affymetrix, но не поставляемые в наборе, могут быть получены отдельно (подробности см. в техническом руководстве по анализу экспрессии GeneChip (701021 Rev.4)), РНКаза Zap® и деионизованная вода.

Оборудование: микроцентрифуга Eppendorf, не содержащие ДНКазы и РНКазы/стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, одноразовые не содержащие ДНКазы и РНКазы/стерильные полипропиленовые пробирки объемом 50 мл, пипетки P1000, P200, P20, P10 и P2 Rainin Pipetman, не содержащие ДНКазы и РНКазы/стерильные наконечники к пипеткам с фильтрами для пипеток P1000, P200, P20, P10 и P2, и термоциклер Peltier PTC-200.

Способ: Все процедуры выполняли точно, согласно описанному в техническом руководстве по анализу экспрессии GeneChip (Affymetrix Copyright 1999-2003). Используют 5 микрограмм суммарной РНК для синтеза первой нити кДНК. Используют либо термоциклер Peltier PTC-200, либо нагревательный блок для контролирования температуры реакций и денатурации зондов. Контроль качества осуществляют, используя чипы RNA NanoDrop, с помощью биоанализатора 2100. Используют форму 100 (матрица Midi) для чипа генов собак.

Пример 1

Определение дифференциальной экспрессии генов в образцах жировой ткани животных с избыточной массой и худых животных

Образцы жировой ткани получали от 18 (3 худых и 15 тучных) собак, или получали лимфоциты от 44 (12 худых и 32 тучных) собак, которые были диагностированы как «тучные» или «худые» с использованием обычных способов. «Тучность» или «худобу» животного определяли на основе измерений DEXA с использованием обычных способов или на основе системы оценки упитанности тела по 5 точкам. Например, животное считают худым, если оно имеет оценку упитанности тела 2 или 2,5 и/или процентное содержание общего жира согласно DEXA 27% или менее. Животного считают имеющим избыточную массу, если оно имеет оценку упитанности тела 4 или выше и процентное содержание общего жира в организме 30% или более. Все твердые образцы тканей моментально замораживали в жидком азоте сразу после извлечения из организма животного. Лимфоциты выделяли, используя пробирку для получения клеток BD Vacutainer® CPT^TM, согласно инструкциям производителей и также моментально замораживали до использования.

Все образцы анализировали, используя чипы GeneChips® Affymetrix Canine-2, согласно рекомендациям производителей, чтобы определить, какие гены дифференциально экспрессируются у животных с избыточной массой по сравнению с худыми животными.

Данные анализировали, используя Partek® GS (Partek Inc., St. Charles, MO) в качестве компьютерной программы для данных по экспрессии генов (Partek Incorporated, 12747 Olive Blvd., Suite 205, St. Louis, Missouri 63141, U.S.A. http://www.partek.com/partekgs geneexpression). Алгоритм Robust Multichip Average (RMA) (Rafael. A. Irizarry, Benjamin M. Bolstad, Francois Collin, Leslie M. Cope, Bridget Hobbs and Terence P. Speed (2003), Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data, Nucleic Acids Research 31(4):e15) использовали для корректировки фона, нормализации и подведения итогов относительно уровней зондов для образцов GeneChip®. Проводили анализ ANOVA, чтобы найти значимые дифференциально экспрессируемые гены среди любых двух групп с использованием контроля минимальной FDR при 0,1 (или p-значении 0,1 или 0,05, если мощность была недостаточной для применения FDR) и кратного изменения 1,3 в каждом направлении. Проведенные авторами эмпирические исследования показали, что GeneChips® Canine-2 имеет сопутствующий 1,3-кратный уровень шума. Поэтому во всех анализах, представленных в настоящем описании, использовали +/-1,3-кратный порог отсечения. Кроме того, порог средней доли ложных отклонений гипотез 0,1 (означает, что 10% наблюдений являются случайными) выбирали в качестве минимального уровня приемлемой статистической значимости для исследований, в которых включали не менее 12 животных на группу. Исследования с меньшими количествами животных не имели достаточной силы, чтобы обеспечить правильное применение FDR. Результаты представлены в таблицах ниже.