Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 4-НИТРОАНИЛИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Изобретение относится к биологии, экологии, токсикологической и санитарной химии, а именно к способу определения 4-нитроанилина в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических и экологических лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения нитропроизводного анилина (2,6-динитро-4-(трифторметил)-N,N-дипропиланилина) в биологическом материале путем измельчения биологического объекта, его двукратного, по 30 минут, настаивания с порциями ацетона, масса каждой из которых в два раза превышает массу биоматериала, отделения извлечений, их объединения, испарения растворителя из объединенного извлечения, растворения остатка в смеси гексана и ацетона, взятых в отношении 9,5:0,5 по объему, хроматографирования в колонке, заполненной 10 г силикагеля L 40/100 мкм с использованием подвижной фазы, являющейся смесью гексана и ацетона, взятых в отношении 9,5:0,5 по объему, сбора элюата фракциями по 2 мл каждая, объединения фракций элюата, содержащих анализируемое соединение, последующего хроматографирования на пластинах «Силуфол» UV-254, предварительно обработанных вазелиновым маслом, с использованием подвижной фазы, являющейся смесью воды и диоксана, взятых в отношении 2:8 по объему, элюирования анализируемого вещества из хроматограммы диметилформамидом с последующим измерением оптической плотности элюата при длине волны 278 нм (Шорманов В.К., Зайцева А.С. Разработка методики химико-токсикологического определения трифлуралина // Судебно-медицинская экспертиза, 2011. - Т.54, №3. - С.50-52).

Способ отличается недостаточно высокой чувствительностью и малой селективностью по отношению к 4-нитроанилину.

Известен способ определения отдельных мононитроанилинов, в том числе 4-нитроанилина, в биологическом материале, заключающийся в том, что анализируемую пробу измельчают, настаивают двукратно с бензолом (каждый раз в течение 45 минут), отдельные извлечения объединяют, часть объединенного извлечения наносят на пластину «Сорбфил» с тонким слоем силикагеля СТХ-1 ВЭ, содержащим люминесцентный индикатор и предварительно обработанным 10% раствором вазелинового масла в гексане, и хроматографируют, используя подвижную фазу вода-диоксан 8:2 по объему с последующим проявлением пятен анализируемого соединения в УФ-свете (Шорманов В.К., Шилова А.С., Сухомлинов Ю.А., Герасимов Д.А. Особенности определения отдельных нитропроизводных анилина в биологических объектах в тонком слое обращеннофазового сорбента // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2011. - Т.11, №3. - С.407-414).

Способ отличается недостаточно высокой чувствительностью и не позволяет проводить количественное определение 4-нитроанилина.

Наиболее близким является способ определения 4-нитроанилина в биологическом материале (тканях трупных органов), который заключается в том, что биологический объект вначале обрабатывают трис-буфером, устанавливая значение рН 9, затем настаивают в условиях встряхивания с органическим изолирующим агентом, которым является смесь этилацетата и хлороформа, взятых в объемном отношении 1:1, органическое извлечение отделяют, упаривают до полного удаления растворителя, обрабатывают дериватообразующим реагентом, которым является трифторуксусная кислота, растворитель испаряют, остаток растворяют в этилацетате и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки НР-5 MS с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-дифенил-95%-диметилполисилоксан, используя масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 300°С со скоростью 15°С в минуту, температура интерфейса детектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по отдельным сегментам и вычисляют количество 4-нитроанилина по площади хроматографического пика его трифторацетильного производного (Bakdash A., Ganswindt М., Herre S., Nadulski Т., Pragst F. Lethal poisoning with p-nitroaniline // Toxichem + Krimtech. - 2006. - Vol.73, №2. - P. 61-65).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения.

Технический результат достигается тем, что биологический объект двукратно по 30 мин настаивают с органическим изолирующим агентом, которым является 1,4-диоксан, полученные извлечения объединяют, объединенное органическое извлечение упаривают до полного удаления растворителя, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в ацетонитриле, ацетонитрильный раствор разбавляют буферным раствором с рН 9-10 в соотношении 1:4 по объему, раствор обрабатывают хлоридом калия, экстрагируют этилацетатом, насыщенным водой, полученный экстракт упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до получения сухого остатка, остаток растворяют в смеси тетрахлорметана и ацетона, взятых в соотношении 9:1 по объему, хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 мкм с использованием подвижной фазы тетрахлорметан-ацетон в соотношении 9:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в дихлорметане, обрабатывают в течение 20 минут дериватообразующим реагентом, которым является N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамид, в условиях нагревания при температуре 60°С и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки DB-5 MS EVIDEX с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, используя масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 4-нитроанилина по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

Способ осуществляется следующим образом: биологический объект, содержащий 4-нитроанилин, двукратно настаивают с органическим изолирующим агентом, которым является 1,4-диоксан, полученные извлечения объединяют, органическое извлечение упаривают до полного удаления растворителя, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в ацетонитриле, ацетонитрильный раствор разбавляют буферным раствором с рН 9-10 в соотношении 1:4 по объему, раствор обрабатывают хлоридом калия, экстрагируют этилацетатом, насыщенным водой, полученный экстракт упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до получения сухого остатка, остаток растворяют в смеси тетрахлорметана и ацетона, взятых в соотношении 9:1 по объему, хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 мкм с использованием подвижной фазы тетрахлорметан-ацетон в соотношении 9:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в дихлорметане, полученный раствор обрабатывают в течение 20 минут дериватизирующим реагентом, которым является N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамид, в условиях нагревания при температуре 60°С и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки DB-5 MS EVIDEX с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, используя масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 4-нитроанилина по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

Пример 1

Определение 4-нитроанилина в крови

К 10 г крови человека прибавляют 5 мг 4-нитроанилина, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 г органического изолирующего агента, которым является 1,4-диоксан, и настаивают 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Полученные извлечения объединяют, объединенное органическое извлечение упаривают до полного удаления растворителя в токе воздуха при 18-22°С, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают ацетоном (порциями по 15 г каждая) при энергичном перемешивании, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл ацетонитрила, ацетонитрильный раствор разбавляют буферным раствором с рН 9-10 в соотношении 1:4 по объему путем прибавления 40 мл данного буферного раствора, образующийся раствор обрабатывают 13,6 г хлорида калия, экстрагируют этилацетатом, насыщенным водой, дважды порциями по 50 мл каждая. Отдельные этилацетатные экстракты объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до получения сухого остатка. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси тетрахлорметана и ацетона, взятых в соотношении 9:1 по объему, и вносят в хроматографическую колонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 мкм. Хроматографируют, используя подвижную фазу тетрахлорметан-ацетон в соотношении 9:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 14 по 21 включительно объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 10 мл дихлорметана (раствор А).

0,1 мл раствора А вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл, обрабатывают в течение 20 минут 0,016 мл дериватизирующего реагента, которым является N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамид, в условиях нагревания при 60°С, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят дихлорметаном до метки (раствор Б).

4 мкл раствора В вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 4-нитроанилина по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 12,34 мин соответствует триметилсилильному производному 4-нитроанилина. В масс-спектре данного соединения, снятого по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 45, 73, 91, 106, 120, 134, 149, 178, 195, 210. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 195, интенсивность которой принимается за 100%.

4-нитроанилин в виде соответствующего триметилсилильного производного идентифицируют по сочетанию времени удерживания триметилсилильного производного в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание 4-нитроанилина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,025, 0,10, 0,25, 0,5, 1,5, 2,5 и 6,25, 12,5 мл 0,4% раствора 4-нитроанилина в дихлорметане и доводят объем содержимого каждой колбы до метки дихлорметаном.

0,1 мл каждого из растворов вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл, обрабатывают в течение 20 минут 0,016 мл N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамида в условиях нагревания при 60°С, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят дихлорметаном до метки.

4 мкл каждого из полученных растворов вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 4-нитроанилина по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 1,6·10^-10-8,0·10^-8 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=201934·С+1576,

где S - площадь хроматографического пика; С- концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.

Результаты количественного определения 4-нитроанилина в крови представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение 4-нитроанилина в ткани печени

К 10 г ткани свежей трупной печени человека прибавляют 5 мг 4-нитроанилина, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С.

По истечении указанного времени смесь заливают 20 г органического изолирующего агента, которым является 1,4-диоксан, и настаивают 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Полученные извлечения объединяют, объединенное органическое извлечение упаривают до полного удаления растворителя в токе воздуха при 18-22°С, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают ацетоном (порциями по 15 г каждая) при энергичном перемешивании, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл ацетонитрила, ацетонитрильный раствор разбавляют буферным раствором с рН 9-10 в соотношении 1:4 по объему путем прибавления 40 мл данного буферного раствора, образующийся раствор обрабатывают 13,6 г хлорида калия, экстрагируют этилацетатом, насыщенным водой, дважды порциями по 50 мл каждая. Отдельные этилацетатные экстракты объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до получения сухого остатка. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси тетрахлорметана и ацетона, взятых в соотношении 9:1 по объему, и вносят в хроматографическую колонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 мкм. Хроматографируют, используя подвижную фазу тетрахлорметан-ацетон в соотношении 9:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 14 по 21 включительно объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 10 мл дихлорметана (раствор А).

0,1 мл раствора А вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл, обрабатывают в течение 20 минут 0,016 мл дериватизирующего реагента, которым является N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамид, в условиях нагревания при 60°С, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят дихлорметаном до метки (раствор Б).

4 мкл раствора В вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 4-нитроанилина по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 12,34 мин соответствует триметилсилильному производному 4-нитроанилина. В масс-спектре данного соединения, снятого по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 45, 73, 91, 106, 120, 134, 149, 178, 195, 210. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 195, интенсивность которой принимается за 100%.

4-нитроанилин в виде соответствующего триметилсилильного производного идентифицируют по сочетанию времени удерживания триметилсилильного производного в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание 4-нитроанилина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

Построение градуировочного графика и его уравнение приводятся в примере 1.

Результаты количественного определения 4-нитроанилина в ткани печени представлены в таблице 2.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 8 раз повышает чувствительность определения в хроматографируемой пробе и в 2,5 раза - в биологическом материале.

Сравнительные характеристики предлагаемого и известного способов представлены в таблице 3.

Таблица 1 Результаты определения 4-нитроанилина в крови (n=5; p=0,95) № Внесено 4-нитроанили-на, мг в 10 г крови Найдено Метрологические характеристики, % площадь пика на хроматограмме, усл. ед. мг в хроматографируемой пробе мг в пересчете на навеску, внесенную в биоматериал % от внесенной в биоматериал навески 1 5,00 1756988 8,693·10-6 4,347 86,93 2 5,00 1770315 8,759·10-6 4,380 87,59 S=2,63 3 5,00 1743660 8,627·10-6 4,314 86,27 4 5,00 1831501 9,062·10-6 4,531 90,62 5 5,00 1678435 8,304·10-6 4,152 83,04 ε=3,89

Таблица 2 Результаты определения в ткани печени (n=5; p=0,95) № Внесено 4-нитроанили-на, мг в 10 г печени Найдено Метрологические характеристики, %     площадь пика на хроматограмме, усл. ед. мг в хроматографируемой пробе мг в пересчете на навеску, внесенную в биоматериал % от внесенной в биоматериал навески   1 5,00 1786470 8,839·10-6 4,420 88,39 2 5,00 1668945 8,257·10-6 4,129 82,57 S=2,95 3 5,00 1686311 8,343·10-6 4,172 83,43 4 5,00 1804442 8,928·10-6 4,464 89,28 5 5,00 1733361 8,576·10-6 4,288 85,76