СРЕДСТВО, ИНГИБИРУЮЩЕЕ Na+/H+-ОБМЕН, И ДИГИДРОХЛОРИД 2-(3,4-МЕТИЛЕНДИОКСИФЕНИЛ)-9-МОРФОЛИНОЭТИЛИМИДАЗО[1,2-a]БЕНЗИМИДАЗОЛА

Изобретение относится к средствам, обладающим способностью ингибировать Na⁺/Н⁺-обмен (ингибиторы NHE).

Na⁺/H⁺обменники (NHE) составляют группу интегральных мембранных белков, экспрессируемых во всех тканях организма, которые осуществляют трансмембранный обмен ионов Na⁺ на ионы Н⁺. В настоящее время девять различных типов Na⁺/H⁺ белков-обменников были клонированы из тканей млекопитающих, и эти изоформы обычно обозначают как NHE-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 соответственно. Они различаются по аминокислотному составу, тканевой специфичности, механизмам внутриклеточной регуляции. NHE-обменники вовлечены во множество сложных физиологических и патологических процессов, включающих регуляцию клеточного pH, клеточную миграцию, апоптоз, гипертрофию, повреждений, связанных с ишемией и реперфузией, защиту клетки от закисления цитоплазмы, контроль клеточного объема [Malo ME, Fliegel L Physiological role and regulation of the Na⁺/H⁺ exchanger./ Can. J. Physiol. Pharmacol. - 2006. - №84 (11). - p.1081-1095], эндотелиальную дисфункцию, а также таких заболеваний, как сахарный диабет и его осложнения, сердечная недостаточность, нарушение мозгового кровообращения, развитие злокачественных опухолей [Fliegel L. Regulation of the Na(⁺)/H(⁺) exchanger in the healthy and diseased myocardium. / Expert. Opin. Ther. Targets. - 2009. - №13 (1). - p.55-68; Karmazyn M.,

Kilic A., Javadov S. The role of NHE-1 in myocardial hypertrophy and remodeling. / J. Mol. Cell Cardiol. - 2008. - №44. - p.647-653; Provost JJ, Wallert MA. Inside Out: Targeting NHE1 as an Intracellular and Extracellular Regulator of Cancer Progression. // Chem Biol Drug Des. - 2013. - №81(1). - p.85-101].

Известны различные группы ингибиторов NHE: амилорид и его производные (DMA, EIPA, MIBA и НМА), бензоилгуанидиновые производные, такие как HOE-642 (карипорид), его производное HOE-694 и энипорид (EMD-85131), сабипорид (BIIB-722), бициклические производные гуанидина, содержащие хинолин (MS 31038), индол (SM 20220, SM 20550, SMP-300), бензоксазинон (KB-R9032), дигидробензофуран (BMS 284640), тетрагидронафтален (Т-162559), циклогептапиридин (TY-12533) и другие [Masereel В., Pochet L., Laeckmann D. An overview of inhibitors of Na+/H+ exchanger // Eur. J. Med. Chem. - 2003. - №38. - Р.547-554].

Известны производные бензимидазолов, содержащие нециклическую гуанидиновую группу (бензимидазол-2-ил и бензимидазол-2-илтиометил бензоилгуанидин), способные ингибировать Na⁺/H⁺ обмен [Zhang R et al. Benzimidazol-2-yl or benzimidazol-2-ylthiomethyl benzoylguanidines as novel Na⁺/H⁺ exchanger inhibitors, synthesis and protection against ischemic-reperfiision injury. / Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2007. - №17. - p.2430-2433].

Наиболее близким по достигаемому результату является Зонипорид (CP-597396) - [1-(хинолин-5-ил)-5-циклопропил-1H-пиразол-4-карбонил] гуанидина гидрохлорид моногидрат [A. Guzman-Perez et al. Discovery of zoniporide: A potent and selective sodium-hydrogen exchanger type 1 (NHE-1) inhibitor with high aqueous solubility. /Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. - 2001. - №11 (6). - p.803-807]. В исследованиях in vitro на тромбоцитах кролика было показано, что данный препарат подавляет NHE-1 - зависимое набухание тромбоцитов (EC₅₀=56 нМ) [Tracey WR et al. Zoniporide: a potent and selective inhibitor of the human sodium-hydrogen exchanger isoform 1 (NHE-1) // Cardiovasc. Drug Rev. - 2003. - №21. - p.17-32].

Однако его свойства как ингибитора NHE остаются недостаточно эффективными.

Техническим результатом является повышение эффективности ингибиторов Na⁺/H⁺-обмена (ингибитора NHE).

Технический результат достигается применением в качестве ингибиторов Na⁺/H⁺-обмена трициклических производных имидазо[1,2-а]бензимидазола, общей формулы I:

где Ar=C₆H₅, C₆H₄OCH₃-4, C₆H₄OH-4, C₆H₃(O₂CH₂)-3,4

NR₂=N(C₂H₅)₂, N(CH₂CH₂)₂O

в том числе, Ia Ar=C₆H₅; NR₂=N(C₂H₅)₂

Ib Ar=C₆H₅; NR₂=N(CH₂CH₂)₂O

Ic Ar=C₆H₄OCH₃-4; NR₂=N(CH₂CH₂)₂O

Id Ar=C₆H₄OH-4; NR₂=N(CH₂CH₂)₂O

Ie Ar=C₆H₃(O₂CH₂)-3,4; NR₂=N(CH₂CH₂)₂O.

Соединения могут применяться, в том числе, для изготовления средств, обладающих способностью ингибировать Na⁺/H⁺-обмен, а также для ингибирования Na⁺/H⁺-обмена в живых организмах.

Соединение Ia известно как обладающее гипотензивной и противовоспалительной активностями (А.М.Симонов, А.А.Белоус, В.А.Анисимова, С.В.Ивановская. Хим.-фарм. журнал, 1969, №1, с.7-10).

Соединение Ib известно как проявляющее антидиабетическое и антиагрегантное действие (V.A.Anisimova, M.V.Levchenko, T.B.Korochina, A.A.Spasov, S.G.Kovalev, G.P.Dudchenko. Nouveaux derives du benzimidazole, leur precede de preparation et les compositions pharmaceutiques que les contiennent. Fr. Pat. 2691462 (1995); Bull., 95/23. EP 0571253).

Соединение Ic известно как обладающее способностью ингибировать ФДЭ цАМФ и снижать возбудимость предсердий (В.А.Анисимова, А.А.Спасов, В.А.Косолапов, А.Ф.Кучерявенко, О.В.Островский, Н.П.Ларионов, Р.Е.Либинзон. Фармакологическая активность 2-метоксифенилзамещенных 9-диалкиламиноэтилимидазо[1,2-a]бензимидазолов. Хим.-фарм. журнал, 2005, т.39, №9, с.26-32), а также как проявляющее свойства антагониста пуриновых P₂Y₁-рецепторов и антитромботическую активность [патент РФ №2377990, МПК А61К 31/5377, 2006 г.)

Соединение Id проявляет антиоксидантную и антиагрегантную активность, а также слабое антисеротониновое и антипуринергическое действие (В.А.Анисимова, А.А.Спасов, В.А.Косолапов, М.В.Черников, А.Ю.Стуковина, Л.В.Ельцова, Н.П.Ларионов, Р.Е.Либинзон, О.Е.Ватолкина. Синтез и биологическая активность 9-диалкиламиноэтил-2-окси(диокси)фенилимидазо[1,2-a]бензимидазолов. Хим.-фарм. журнал, 2006, т.40, №10, с.23-26).

Техническим результатом является также новые соединения в ряду имидазо[1,2-a]бензимидазола, обладающие свойством ингибировать Na⁺/H⁺-обмен.

Технический результат достигается дигидрохлоридом 2-(3,4-метилендиоксифенил)-9-морфолиноэтилимидазо[1,2-a]бензимидазола формулы Ie:

Синтез дигидрохлорида 2-(3,4-метилендиоксифенил)-9-морфолиноэтилимидазо[1,2-a]бензимидазола заключается во взаимодействии 1-морфолиноэтил-2-аминобензимидазола с 3,4-метилендиоксифенацил-бромидом и дальнейшей циклизации промежуточно образующегося при этом бромида 1-морфолиноэтил-2-амино-3-(3,4-метилендиоксифенацил)бензимидазолия (без выделения последнего) в трициклическое основание, которое переводят обычными способами в дигидрохлорид Ie.

Пример. Получение дигидрохлорида Ie.

В раствор 2,46 г (10 ммоль) 1-морфолиноэтил-2-аминобензимидазола в ацетоне вносят 2,43 г (10 ммоль) 3,4-метилендиоксифенацилбромида. Смесь перемешивают. Растворитель из реакционной массы с выпавшим осадком бромида 1-морфолиноэтил-2-амино-3-(3,4-метилендиокси-фенацил)-бензимидазолия упаривают, к остатку прибавляют 120 мл воды и смесь кипятят до полного протекания реакции. Раствор охлаждают, подщелачивают и выделившееся основание - 2-(3,4-метилендиоксифенил)-9-(2-морфолино-этил)имидазо[1,2-a]бензимидазол экстрагируют хлороформом. Экстракт очищают на хроматографической колонке. Элюат упаривают, остаток растворяют в ацетоне и подкисляют HCl. Выпавший осадок соли отфильтровывают, промывают ацетоном и сушат. Выход 92,5-94,3%. Т.пл. 183-184°C (разложение).

Найдено, %: C 57,18; H 5,29; Cl 15,5; N 12,17.

C₂₂H₂₂N₄O₃·2HCl.

Вычислено, %: C 57,03; H 5,22; Cl 15,30; N 12,09.

ИК-спектр, λ_max, см^-1: 1660 (C=N), 2360-2650 (широкая полоса N⁺H).

Спектр ЯМР ¹Н (ДМСО-d₆), δ, м.д.: 3.37-3.56 м (4H, N(CH₂)₂); 3.71 т (2H, J 6.5 Гц, CH₂); 3.80-4.00 м (4H, O(CH₂)₂); 5.02 т (2H, J 6.5 Гц, CH₂); 6.10 с (2H, OCH₂O); 7.06 д (1H, J 9.0 Гц, H_Ar),7.39-7.58 м (4H, H_Ar), 7.90-8.00 м (2H, H_Ar), 8.48 с (1H, H³ _Ar), 2H⁺ в обмене.

Ниже приведены результаты испытаний свойств соединений как ингибиторов Na⁺/H⁺-обмена.

1. Материалы и методы.

1.1. Схема исследования.

1 этап - изучение влияния соединений на активность Na⁺/H⁺-обмена тромбоцитов кролика. Расчет IC₅₀.

2 этап - изучение острой токсичности.

1.2. Материалы.

Соединения Ia-e, зонипорид (SIGMA, США).

Реактивы: натрия пропионат (MP Biomedicals, Inc., Франция), HEPES (GERBU, Германия), кальций хлористый 2-х-водный (дигидрат) CaCI₂·2H₂O (ООО «АГАТ-МЕД», Россия), магний хлористый 6-водный «ч» MgCI₂·6H₂O (ЗАО «УНИХИМ», Россия), D-глюкоза (безводная) кристаллическая «ч» C₆H₁₂O₆ (ООО «АГАТ-МЕД», Россия), натрий хлористый «ХЧ» NaCl (ЗАО «НПО ЭКРОС», Россия), калий хлористый «ЧДА» KCl (ООО «РЕАХИМ», Россия), калий фосфорнокислый однозамещенный KH₂PO₄ «ЧДА» (ОАО «Петербургский Красный химик», Россия), магний сернистокислый 7-водный MgSO₄·7H₂O (ООО «РЕАХИМ», Россия), гидрокарбонат натрия NaHCO₃ (ООО «РЕАХИМ», Россия), этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (MP Biomedicals, Inc., Франция).

1.3. Животные.

В экспериментах были использованы кролики-самцы, весом 2,5-3,5 кг, которые содержались в условиях вивария с естественным световым режимом на стандартной диете лабораторных животных в соответствии с ГОСТ Р 50258-92 [1993]. Исследование проводили в соответствии с применимыми требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009, ГОСТ Р ИСО 5725-2002 и «Правил лабораторной практики», утвержденных приказом Минздравсоцразвития РФ от 23 августа 2010 №708н, с соблюдением «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» [Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes Official Journal L 276, 20.10.2010 p.33-79 (revising Directive 86/609/EEC)].

1.4. Методы.

Изучение изучение влияния соединений на активность Na⁺/H⁺-обмена тромбоцитов кролика проведено in vitro на тромбоцитах кролика (по методу Rosskopf D. et. al., Rapid determination of the elevated Na⁺/H⁺ exchanger in platelets of patients with essential hypertension using an optical swelling assay // Journal of Hypertension. - 1991. - №9. - p.231-238; Kusumoto K. et al., In vitro and in vivo pharmacology of a structurally novel Na⁺/H⁺ exchanger inhibitor, T-162559 // British Journal of Pharmacology. - 2002. - №135. - p.1995-2003).

В качестве материала исследования выбраны тромбоциты кролика, на мембране которых активно экспрессируют NHE-1. В основу метода были положены подходы, основанные на изменении светопропускания при изменении формы тромбоцита.

Образцы крови забирали из краевой вены уха кролика в пробирку, содержащие 3,8% цитрата натрия, в соотношении 1:10. Для получения плазмы богатой тромбоцитами (ПБогТ) кровь центрифугировали при 1000 оборотах/минуту в течение 12 минут.

Для проведения калибровки использовали ПБогТ с ЭДТА и раствор Кребса (NaCl - 120 мМ, KCl - 4,8 мМ, KH₂PO₄ - 1,2 мМ, MgSO₄ - 2,5 мМ, NaHCO₃ - 25 мМ, CaCl₂ - 2,6 мМ, глюкоза - 5,4 мМ, pH - 7,4.).

В контрольной серии экспериментов к 200 мкл ПБогТ для снижения внутриклеточного pH добавляли 600 мкл раствора пропионата натрия (в ммоль/л: Na пропионат 135, HEPES 20, CaCl₂ 1, MgCl₂ 1, глюкоза 10; pH 6.7; t=37°C). При этом происходила активация Na⁺/H⁺-обменника, увеличение притока натрия, связанное с выделением цитозольного H⁺, ведущее к отеку (сферуляции) тромбоцита в результате аккумуляции воды в цитоплазме. При этом наблюдалось облегчение светопропускания. Для контроля изменения светопропускания в условиях физиологических pH использовали раствор Кребса.

Изменения формы тромбоцитов регистрировали по изменению уровня светопропускания с помощью лазерного агрегометра «БИОЛА-220 ЛА», Россия.

При изучении новых соединений и препарата сравнения зонипорида (10 мкл) вещества добавляли в кювету с ПБогТ (200 мкл) за 3-5 минут до добавления раствора пропионата натрия, инкубировали при температуре 37°C и постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки (1000 оборотов в минуту).

Исследования проводились в диапазоне концентраций 10^-10-10^-5 М.

Рассчитывали IC₅₀ - концентрацию соединения, блокирующую Na⁺/H⁺-обмен тромбоцитов кролика на 50%.

1.5. Изучение острой токсичности

Для вычисления широты терапевтического действия соединения определяли острую токсичность на 50 мышах-самцах при внутрибрюшинном введении. Рассчет величины ЛД_-50 проводили графически по Миллеру и Тейтнеру [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л., 1963. - 152 с.].

1.6. Методы статистической обработки

Для исследуемого препарата и препарата сравнения экспериментально определены величины IC₅₀ с использованием метода регрессионного анализа зависимости между lg концентрации и процентом ингибирования активности обменника в программе Microsoft Excel (пакет Office XP, Microsoft, США).

2. Результаты исследования

При изучении влияния новых соединений и зонипорида на активность Na⁺/H⁺-обмена кролика было показано дозозовисимое увеличение ингибирующего эффекта. Рассчитаны IC₅₀, которые представлены в табл.1.

При изучении острой токсичности при внутрибрюшинном введении мышам рассчитана ЛД₅₀. Для оценки широты терапевтического действия на изолированных органах рассчитан терапевтический индекс (таблица 1).

Таким образом, по NHE-ингибирующему эффекту соединения I a-e оказались активнее зонипорида и превосходят его как по величине IC₅₀ в 19,7; 12,1; 2,1; 3,34 и 2,7 раза, так и по терапевтическому индексу - в 34,7; 9,8; 1,7; 1,3 и 1,1 раза, соответственно.