Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ РАПСА К ХЛОРИДНОМУ ЗАСОЛЕНИЮ

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве в области растениеводства на открытом грунте или в сооружениях защищенного грунта, при химической защите растений от неблагоприятных факторов.

Стероидные гормоны растений - брассиностероиды - оказывают всестороннее влияние на развитие растений в процессе их онтогенеза от активации прорастания семян до задержки старения. Известно, что брассиностероиды изменяют активность ферментов, мембранный потенциал, активируют синтез белков и нуклеиновых кислот, изменяют состав аминокислот и жирных кислот, вызывают сдвиги в гормональном балансе других эндогенных гормонов, тем самым стимулируя удлинение и деление клеток (Clouse S.D., Sasse J.M., 1998; Khripach V.A., Zhabinskii V.N., Karnachuk R.A., 2004).

Эти внутриклеточные изменения реализуются на уровне целого растения и проявляются в усилении роста и повышении продуктивности (Карначук и др., 2002; Ефимова М.В., 2010; Hold D., 2011; Efimova M.V. et al, 2012; Ефимова и др., 2012). Активное использование брассиностероидов в настоящее время как принципиально новых препаратов сельскохозяйственного назначения обусловлено их экологической безопасностью и способностью снижать накопление нитратов, тяжелых металлов и радионуклидов. На основании вышесказанного можно ожидать, что стероидные гормоны окажутся эффективными при защите растений от хлоридного засоления. Известно, что засоление почв вызывает не только снижение продуктивности агро- и биоценозов, но и снижение биоразнообразия, что сопровождается значительными экономическими потерями (Pessarakli М., Szabolcs I., 2011).

Рапс (Brassica napus L.) является одной из перспективных масличных культур, широко распространенной во всем мире. По пищевым и кормовым достоинствам он превосходит многие сельскохозяйственные культуры.

Известны способы повышения солеустойчивости растений (варианты) окисленным крахмалсодержащим продуктом (Апашева Л.М., Комиссаров Г.Г., Сахаров A.M., Сахаров П.А., патент RU 2445759, опубликован 27.03.2012). Семена свеклы, рапса, сафлоры и сорго сначала замачивали в водном растворе пероксида водорода в концентрации 5·10^-4-1·10^-3 М (1,7·10^-2-3,4·10^-1 г/л) с последующим подсушиванием, затем обрабатывали их полусухим методом 10-20%-ным водным раствором окисленного крахмалсодержащего продукта (ОКР), полученного окислением крахмалсодержащего сырья в щелочном растворе в присутствии медного катализатора, и подсушивали до сыпучего состояния.

Среди недостатков способа-прототипа можно отметить то, что используемая концентрация действующего вещества (окисленного крахмалсодержащего продукта) очень высока - 10-20%, что экономически не выгодно. Анализируемая концентрация NaCl колебалась от 85 мМ до 120 мМ. В случае с семенами рапса хлоридное засоление составляло 100 мМ, данная концентрация обычно не вызывает выраженного повреждения растений и, соответственно, не может вызывать значительных экономических потерь. Кроме того, авторы способа учитывали только процент выживших растений, при этом не обсуждалось влияние хлоридного засоления на ростовые показатели проростков.

В нашем исследовании на проростках рапса используются более высокие концентрации NaCl - до 250 мМ, что в два раза выше концентрации, учитываемой в способе; концентрация веществ - брассинолида, эпибрассинолида или гомобрассинолида с выраженным протекторным действием составляет 10^-10 и 10^-9 М, что также отражает экономическую выгоду предложенного нами способа.

Известен способ повышения солеустойчивости путем предпосевного замачивания семян с последующим их проращиванием и некорневой обработкой взошедших растений (авторы Стаценко А.П., Кузин Е.Н., патент Пензенской государственной сельскохозяйственной академии №2209537 от 01.10.2001, опубликован 10.08.2003). Замачивание семян проводят в течение часа в теплом 10%-ном водном растворе аминокислоты пролина в термостате при температуре 30°С. Затем семена промывают в проточной холодной водопроводной воде и подсушивают на фильтровальной бумаге. Потом проращивают и проводят внекорневую обработку взошедших растений раствором, приготовленным из расчета 15 г пролина и 10 г сахарозы на 100 мл воды. Обработку повторяют через 10-12 суток (способ принят за прототип).

Однако следует отметить, что способ-прототип отличается низкой технологичностью и трудоемкостью обработки; кроме того, авторы способа учитывали только процент выживших растений в подсоленной среде, при этом не обсуждалось влияние продолжительного хлоридного засоления на интенсивность роста проростков. Еще одним недостатком применения пролина является необходимость использования в концентрациях, на несколько порядков превышающих нормы расхода средства по изобретению.

Задачей изобретения является разработка способа снижения негативного воздействия хлоридного засоления на процесс прорастания семян и развитие растений рапса на начальных этапах онтогенеза.

Поставленная задача решается тем, что перед посевом в почву с засоленностью 50-250 мМ NaCl семена однократно замачивают в растворе брассинолида (10^-10-10^-9 М), или эпибрассинолида (10^-10-10^-9 M), или гомобрассинолида (10^-9-10^-8 М), после чего просушивают до воздушно-сухого состояния.

Сущность изобретения состоит в увеличении солеустойчивости процесса прорастания семян рапса и в снижении негативного действия хлоридного засоления на размеры осевых органов в широком диапазоне концентраций NaCl экологически чистыми фитогормонами (брассинолидом, эпибрассинолидом или гомобрассинолидом).

В настоящее время известно более 70 брассиностероидов, среди которых наибольшую биологическую активность проявляют брассинолид, эпибрассинолид и гомобрассинолид (Bajguz А., 2011).

Способ по изобретению допускает более продолжительное хлоридное засоление по сравнению со способом-прототипом, в то время как концентрация веществ с выраженным протекторным действием (эпибрассинолида (ЭБЛ), гомобрассинолида (ГБЛ) и брассинолида (БЛ)) мала и составляет 10^-10 и 10^-9 М; кроме того, для достижения выраженного эффекта достаточно одной обработки брассиностероидами (замачивание на 1-2 часа), что также отражает экономическую выгоду предложенного нами способа.

Для подтверждения применимости способа семена рапса культивируют на дистиллированной воде (контроль) и растворе NaCl (от 50 до 250 мМ). Для подтверждения влияния брассиностероидов на морфогенез проростков при сильном засолении семена рапса проращивали на растворах эпибрассинолида (10^-12-10^-6 М), брассинолида (10^-10-10^-8 М) или гомобрассинолида (10^-10-10^-8 М). Процент проросших семян и ростовые показатели проростков (длина гипокотиля и корня) анализировали на седьмые сутки от начала прорастания семян.

Способность брассиностероидов повышать прорастание семян и снижать негативную нагрузку хлоридного засоления на ростовые параметры рапса иллюстрируются чертежами.

Фиг.1 - Интенсивность прорастания семян рапса при засолении.

Фиг.2 - Ростовые показатели проростков рапса при хлоридном засолении.

Фиг.3 - Интенсивность прорастания семян рапса при высоких концентрациях NaCl в прсиутствии экзогенных брассиностероидов (на оси абсцисс представлены логарифмы концентраций гормонов в молях).

Фиг.4 - Ростовые показатели проростков рапса при хлоридном засолении в присутствии эпибрассинолида (на оси абсцисс представлены логарифмы концентраций гормона в молях).

Реализация способа иллюстрируется следующим примером.

Отобранные отсортированные семена одной партии делили на две группы, одну из которых однократно обрабатывали раствором брассиностероида в заявленной концентрации и просушивали до влажности контрольной партии, т.е. до воздушно-сухого состояния.

Затем обе группы семян рапса проращивали в дистиллированной воде (контроль) или растворе NaCl и изучали способность брассиностероидов снижать негативное воздействие засоления на прорастание семян и рост осевых органов рапса.

На фиг.1 показано влияние широкого диапазона концентраций хлористого натрия на прорастание семян рапса. Видно, что хлоридное засоление задерживает прорастание семян рапса. Отрицательное влияние засоления показано при 75 мМ, негативный эффект резко усиливается при 140-150 мМ, полное подавление процесса прорастания происходит при 250 мМ NaCl.

На фиг.2 показаны ростовые кривые проростков рапса в условиях хлоридного засолении. Представленные данные показывают, что наибольшей чувствительностью к действию засоления отличаются корни. Достоверное ингибирование длины корня наблюдалось в диапазоне 25-200 мМ NaCl, в то время как для гипокотиля - при 125-200 мМ NaCl. Это означает, что при длительном засолении в первую очередь повреждается корневая система и затем - надземные органы.

На основании полученных данных по изучению влияния NaCl и эпибрассинолида на прорастание семян и рост проростков нами был определен диапазон концентраций хлористого натрия 150-250 мМ, оказывающих наиболее губительное воздействие, и диапазон оптимальных стресс-протекторных концентраций брассиностероидов 10^-10-10^-8 М.

На фиг.3 и фиг.4 показано протекторное действие брассиностероидов (эпибрассинолида, гомобрассинолида, брассинолида) при хлоридном засолении.

Изучение прорастания семян при хлоридном засолении в присутствии брассиностероидов показало, что гормоны повышали интенсивность прорастания семян при высоких концентрациях NaCl (200 мМ). При этом наибольший стимулирующий эффект был отмечен для брассинолида, который полностью снимал ингибирующее действие соли на прорастание семян. Экзогенный гомобрассинолид (10^-9 и 10^-8 М) активировал прорастание семян рапса при более интенсивном засолении (250 мМ NaCl) (фиг.3).

Солезащитный эффект брассиностероидов проявлялся не только на прорастании семян, но и на росте осевых органов. На фиг.4 показаны ростовые показатели проростков рапса при хлоридном засолении (150 мМ NaCl) в присутствии эпибрассинолида. Отмечена способность гормона снижать негативный эффект засоления на рост гипокотиля и корня.

Таким образом, экспериментально установлен солезащитный эффект исследованных нами брассиностероидов. Гомобрассинолид и брассинолид в диапазоне концентраций 10^-10-10^-8 М повышали интенсивность прорастания семян в условиях сильного засоления (200 и 250 мМ NaCl). Эпибрассинолид в низких концентрациях (10^-10 и 10^-9 М) проявлял наиболее высокую ростстимулирующую активность при 150 мМ NaCl, что выражалось в частичном преодолении вызванного NaCl ингибирования роста. Выдвинуто предположение, что протекторное действие брассиностероидов при засолении может быть обусловлено их способностью регулировать содержание стрессорных гормонов или вторичных мессенжеров, вовлеченных во внутриклеточную передачу стрессорного сигнала.

Источники информации

1. Clouse S.D. and Sasse J.M. Brassinosteroids: essential regulators of plant growth and development // Annu. Rev. Plant Physiology. Plant Mol. Biol. 1998. Vol.49. - P. 427-451.

2. Khripach V.A., Zhabinskii V.N., Karnachuk R.A. Chemical probes in biology / Science at the interface of brassinosteroids: a new role of steroids as biosignaling molecules. 2004. M.P. Schneider. Ed. Netherlands: Kluwer Academic Publishers.- Vol.129.- P. 153-167.- NATO Science Series. 391 p.

3. Карначук P.A., Головацкая И.Ф., Ефимова M.B., Хрипач В.А. Действие 24-эпибрассинолида на морфогенез и соотношение гормонов у проростков Arabidopsis на зеленом свету / Физиология растений. 2002. Т. 49. №4. С.591-595.

4. Ефимова М.В. Физиологическая роль брассиностероидов в развитии проростков Arabidopsis thaliana L. (Heynh) на селективном свету // Вестн. Томского гос.ун-та. Биология. 2010. №4. С.106-116.

5. Efimova M.V., Kusnetsov V.V., Kravtsov А.К., Karnachuk R.A., Khripach V.A., Kuznetsov V.V. Regulation of the transcription of plastid genes in plants by brassinosteroids // Doklady Biological Sciences.- 2012.- Vol.445 (1). P. 272-275.

6. Efimova M.V., Kusnetsov V.V., Kravtsov A.K, Bartashevich D.A., Karnachuk R.A., Kovtun I.S., and Kuznetsov Vl.V. Expression of plastid genome and development of Arabidopsis thaliana with disturbed synthesis of brassinosteroids // Russian Journal of Plant Physiology. 2012. Vol.59. P. 28-34.

7. Hold D. Brassinosteroids and Photosynthesis // Brassinosteroids: A Class of Plant Hormone / Eds Hayat S., Ahmad A. Springer Science+Business Media B.V. 2011. P. 143-192.

8. Bajguz A. Brassinosteroids - occurrence and chemical structures in plants / Brassinosteroids: A Class of Plant Hormone. 2011. S. Hayat, A. Ahmad. Eds. Springer Science+Business Media B.V.- P. 1-28, p.462.

9. Pessarakli M., Szabolcs I. Soil salinity and sodicity as particular plant crop stress factors/ Handbook of plant and crop stress. 3rd edition. 2011. M. Pessarakli. Ed. CRC Press Taylor & Francis Group.- P. 3-21, 1194 p.