Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ БИОРЕМЕДИЗАЦИИ ЗАГРЯЗНЕННЫХ КАДМИЕМ ПОЧВ

Заявляемое изобретение относится к биотехнологии и предназначено для очистки и восстановления здорового биоценоза загрязненных кадмием почв.

Тяжелые металлы (ТМ), такие как кадмий, свинец, ртуть, цинк, никель, медь и другие, являются одними из самых распространенных и опасных загрязнителей природного и антропогенного происхождения. В отличие от органических загрязнителей (нефть, ксенобиотики) ТМ не поддаются деструкции и способны, перемещаясь по звеньям экосистемы, концентрироваться в животных и человеке. Интенсивное развитие промышленности, транспорта и сельскохозяйственного производства приводит к образованию как локальных очагов с экстремально высокотоксичными концентрациями ТМ (отвалы горных пород, территории вокруг промышленных предприятий, полигоны), так и к загрязнению обширных территорий сельскохозяйственных угодий.

Традиционные физико-химические способы очистки почвы, такие как экскавация, термообработка, промывка или дезактивация химическими реагентами, широко применяемые в настоящее время для ликвидации относительно небольших очагов загрязнения, разрушительны для экосистем. Эти технологии являются чрезвычайно дорогостоящими, создают новые отходы, требующие утилизации, снижают плодородие почвы или делают ее непригодной для сельскохозяйственного использования. Мелиоративные мероприятия по ремедиации обширных сельскохозяйственных территорий с относительно низким уровнем загрязнения ТМ в основном направлены не на очистку почв, а на предотвращение поступления ТМ в сельскохозяйственную продукцию (например, известкование почв), что является временным и неполным решением проблемы загрязнения. Поэтому необходимы другие более приемлемые методы, основанные на использовании биологических систем - микроорганизмов и растений.

В последнее 10-летие развивается целый комплекс принципиально новых технологий восстановления загрязненных агроландшафтов, называемых фиторемедиацией. Фиторемедиация основана на использовании растений для концентрации и детоксикации ТМ на основе физических, химических и биологических процессов, что обеспечивает сохранение агроландшафтов и восстановление здоровых экосистем. В связи с этим актуальными являются поиск устойчивых к ТМ форм растений с высокой урожайностью вегетативной массы и активно аккумулирующих ТМ, а также микроорганизмов, которые образуют симбиоз с растениями, стимулируют их рост, питание и повышают устойчивость к стрессам.

Известен патент РФ №2231944 на изобретение «Способ биологической очистки почв», МКИ А01В 79/02, В09С 1/00, опубл. 27.01.2004. Способ включает высев семян растений в загрязненную тяжелыми металлами почву, скашивание и удаление зеленной массы. Используют семена одуванчика лекарственного в количестве 1,95-24,3 млн. штук на 1 га. После прорастания семян растения доводят до фазы образования розетки листьев. Скашивание и удаление растений производят многократно до образования семян. Способ позволяет существенно снизить содержание тяжелых металлов в загрязненных почвах.

Известен также патент РФ №2181933 на изобретение «Способ рекультивации токсичных земель, нарушенных при добыче угля», МКИ А01В 79/02, В09С 1/10, опубл. 10.05.2002. Согласно способу сначала проводят планировку поверхности, затем посев семян многолетних растений, обработанных культурами Azotobacter chroococcum Mut-1 В-35 и Bacillus megaterium KC-1 В-135. Далее проводят инокуляцию почвогрунтов суспензией бактериальных клеток рода Pseudomonas, выделенных из почвы грунтов отвальной поверхности, из расчета 100·10⁸ клеток в 1 мл. Способ позволяет после 1 года рекультивации получить плодородный слой почвы, аналогичный природному, с устойчивым травостоем. При этом достигается полное разложение фенолов нефти, улучшение агрохимических свойств почвогрунта, накопление гумуса, а также азота, фосфора, калия в усвояемой для растений форме.

Известен патент РФ №2403102 на изобретение «Способ фиторемедиации грунта, загрязненного углеводородами (варианты)», МКИ В09С 1/10, опубл. 10.11.2010 г.

Изобретение относится к охране окружающей среды, и может быть использовано для очистки почвы или грунта от загрязнения углеводородами во всех отраслях промышленности, связанных с добычей, транспортировкой, переработкой или хранением нефти и нефтепродуктов, а также при ликвидации последствий их аварийных разливов. Способ включает посев в грунт растений-фиторемедиантов. Согласно 1 варианту перед посевом в грунт семена обрабатывают суспензией штамма Sinorhizobium meliloti P221 или штамма Azospirillum braselense SR80. Согласно 2 варианту способ включает посев в грунт растений-фиторемедиантов и бактеризацию грунта суспензией штамма Sinorhizobium meliloti P221 или штамма Azospirillum braselense SR80, при этом обработку грунта суспензией осуществляют до достижения концентрации 1-3×10⁷ клеток/г грунта, содержащихся в поверхностном слое, глубиной до 30 см. В качестве растений-фиторемедиантов используют смесь семян бобовых, а именно люцерну посевную, и семян злаковых растений, а именно райграс пастбищный, и/или рожь озимую, и/или сорго веничное, в соотношении 1:1-3. Изобретение позволяет повысить эффективность фиторемедиации.

Известен патент РФ №2176164 на изобретение «Способ биологической ремедиации нефтезагрязненных почв», МКИ В09С 1/10, А01В 79/02, опубл. 27.11.2001. Способ предусматривает обработку почвы биопрепаратами и микроэлементами. Обработанную почву засевают семенами бобовых и злаковых культур. Для обработки почвы используют биопрепараты на основе Actinomyces sp 1-96A АОЗТ "Биофлора" N В-05, Azotobacter chroococcum ВКПМ В-3721, Bacillus mucilaginosus ВКПМ В-5987 и консорциума молочнокислых бактерий ВКПМ 5972. Перед засевом семена замачивают в растворе, состоящем из 1-4 частей биопрепарата на основе Actinomyces sp 1-96А АОЗТ "Биофлора" N В-5 и 1-6 частей Azotobacter chroococcum ВКПМ В-3721 на 1000 частей воды. В процессе роста растений осуществляют некорневую подкормку их минеральными удобрениями. Способ позволяет снизить содержание гудрона в почве через 3 мес на 31,6% от исходного содержания.

Известен патент РФ №2229203 на изобретение «Фиторемедиационный способ очистки почв от тяжелых металлов», МКИ А01В 79/02, В09 С1/00, опубл. 27.05.2004 (прототип).

Фиторемедиационный способ включает засев почвы семенами растений из семейств сложноцветных, бобовых и злаковых в соотношении 1:1:1 в количестве 1,50-22,90 млн. шт./га с последующим многократным скашиванием их на стадии вегетационного периода, высушиванием и удалением с поверхности почвы. Фиторемедиационный способ очистки почв является экологически чистым и позволяет существенно снизить содержание тяжелых металлов в загрязненных почвах.

Недостатком данного способа является невысокая эффективность в восстановлении плодородия почв, особенно с высокотоксичными концентрациями ТМ (отвалы горных пород, территории вокруг промышленных предприятий, полигоны), и в повышении устойчивости растений к различным стрессам, включая токсичность тяжелых металлов, в частности кадмия.

Задачей изобретения является разработка способа эффективной биоремедиации загрязненных тяжелым металлом - кадмием почв с помощью симбиотической растительно-микробной системы.

Задача решается за счет того, что в способе биоремедиации загрязненных кадмием почв используют симбиотическую растительно-микробную систему, состоящую из устойчивых к кадмию генетически модифицированного растения гороха, арбускулярного микоризного гриба и симбиотрофных бактерий, содержащих фермент АЦК дезаминазу.

При этом сначала, перед посевом семян гороха, готовят инокулюм из устойчивых к кадмию симбиотических микроорганизмов, состоящий из гриба арбускулярной микоризы Glomus sp. (почвенно-корневой смеси, содержащей гифы и споры гриба в количестве 0,5-1,0 г смеси на 1 семя гороха), клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae (водной суспензии, содержащей 10⁶-10⁷ кл. бактерий на 1 мл суспензии, в количестве 0,1-0,5 мл суспензии на 1 семя гороха) и ассоциативных бактерий Variovorax paradoxus (водной суспензии, содержащей 10⁶-10⁷ кл. бактерий на 1 мл суспензии, в количестве 0,1-0,5 мл суспензии на 1 семя гороха). Затем в загрязненную кадмием почву высевают семена гороха SGECdt - генетически модифицированного гороха посевного (Pisum sativum L.), в количестве 20-60 семян на 1 м², совмещая их во время посева с приготовленным заранее инокулюмом из симбиотических микроорганизмов по указанной выше норме, и выращивают растения по стандартным технологиям, применимым к гороху, конкретным почвенным условиям и данному климатическому региону. После достижения полного созревания бобов горох скашивают и удаляют с поверхности почвы.

В результате достигают снижения доступного растениям кадмия в пахотном слое почвы и обогащение почвы органическим веществом и полезными для растений микроорганизмами, что способствует восстановлению здорового биоценоза ландшафта.

Скошенную и удаленную биомассу растений высушивают и утилизируют путем сжигания и последующего использования золы в качестве источника кадмия в производстве и технике.

Для осуществления заявляемого способа биоремедиации загрязненных кадмием почв используют следующие растения и штаммы микроорганизмов, указанные ниже.

Мутант гороха SGECdt, обладающий повышенной устойчивостью и аккумуляцией кадмия. Этот мутант гороха SGECdt получен во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (ГНУ ВНИИСХМ) из семян гороха посевного (Pisum sativum L.) линии SGE; методика его получения и характеристики описаны в статье: Tsyganov V.E., Belimov A.A., Borisov A.Y., Safronova V.I., Georgi M., Dietz K.-J., Tikhonovich I.A. A chemically induced new pea (Pisum sativum L.) mutant SGECdt with increased tolerance to and accumulation of cadmium. Ann. Botany, 2007, 99, 227-237.

Штамм гриба арбускулярной микоризы Glomus sp. 1Fo, устойчивый к кадмию, выделен из техногенной почвы, загрязненной нефтепродуктами и тяжелыми металлами; депонирован 26.03.2012 г. во НИИСХМ в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (ВКСМ/RCAM) под регистрационным номером RCAM 00630.

Проверка устойчивости данного гриба к кадмию проводилась в вегетационном опыте в теплице с освещением 50 Вт/м² (16 ч день/8 ч ночь) и температурным режимом 20-22°C. Растения выращивали в сосудах, содержащих 200 г стерилизованной дерново-подзолистой почвы. Автоклавирование почвы производилось два раза с интервалом в 5 суток при условиях: давление 1,5 атм; время стерилизации 60 мин. Характеристика почвы: pH солевая - 4,7; pH водная - 5,4. В половине сосудов в почву дополнительно вносили кадмий в количестве 10 мг Cd/кг почвы.

Семена гороха стерилизовали и скарифицировали концентрированной H₂SO₄ в течение 30 мин и проращивали в течение 3 суток. В каждый сосуд сеяли 2 проростка. Почвенно-корневую смесь, содержащую или не содержащую эндомикоризные грибы, предварительно вносили в сосуды слоем под семена в количестве 10 г/сосуд. Влажность почвы поддерживали на уровне 60-70% от полной влагоемкости почвы. Растения выращивали в течение 45 суток до фазы начала образования бобов.

В конце эксперимента корни отмывали в воде, обрабатывали 10% KOH в течение 10 мин при 95°C и промывали водой 3 раза. Затем мицелий в корнях окрашивали путем выдерживания корней в течение 3 мин в 5% растворе черной туши (Shaeffer, Франция) в 10% растворе уксусной кислоты и тщательно отмывали водой. Образцы корней раскладывали на предметные стекла и микроскопировали для определения встречаемости микоризной инфекции (F), обилия арбускул в образце (M), обилия арбускул в микоризованных фрагментах (m), обилия везикул в образце (V) и обилия везикул в микоризованных фрагментах (v) по методу Травло (Зольникова Н.В., Воробьев Н.И. Методы исследования грибов, образующих с растениями микоризу арбускулярно-везикулярного типа. Изд. РАСХН, СПб, 1992, 44 с.). Растения высушивали при 40°C и взвешивали на аналитических весах (Shinko-ViBRA, Япония). Результаты опыта приведены в таблице 1.

В ходе эксперимента было установлено, что развитие растений было активным и достаточно однородным во всех вариантах опыта. Инокуляция растений штаммом гриба арбускулярной микоризы Glomus sp. 1Fo привела к интенсивному развитию микоризных структур в корнях, было также подтверждено, что данный штамм высокоустойчив к присутствию кадмия и не снижает интенсивности микоризации в обогащенной кадмием почве.

Штамм клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae 1066 депонирован 20.02.1978 г. в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (ВКСМ/RCAM) под номером RCAM1066 в группе клубеньковых бактерий. Штамм устойчив к кадмию; содержит фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат дезаминазу, который оказывает антистрессовый эффект на растения. Справка о депонировании прилагается.

Штамм ассоциативных бактерий Variovorax paradoxus 5C-2 депонирован 25.10.2010 г. в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (ВКСМ/RCAM) под регистрационным номером RCAM00049. Штамм устойчив к кадмию, содержит фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат дезаминазу, который оказывает антистрессовый эффект на растения.

Устойчивость к кадмию штаммов бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae 1066 и Variovorax paradoxus 5C-2 определяли по методике, описанной в статье (Belimov A.A., Hontzeas N., Safronova V.I., Demchinskaya S.V., Piluzza G., Bullitta S., Glick B.R. Cadmium-tolerant plant growth-promoting bacteria associated with the roots of Indian mustard (Brassica juncea L. Czrn.) Soil Biol. Biochem. 2005, 37, 241-250) методом культивирования на агаризованной среде MDF (г/л): глюкоза - 1; сахароза - 1; глюконовая кислота - 1; цитрат Na - 1; яблочная кислота - 1; маннитол - 1; крахмал - 1; KH₂PO₄ - 2,0; Na₂HPO₄ - 3,0; MgSO₄ - 0,2; NaCl - 0.1; pH - 6,8.

Перед посевом бактерий в автоклавированные среды добавляли стерильный раствор CdCl₂ в концентрациях от 0 до 500 мкМ. Устойчивость бактерий к кадмию оценивали визуально по интенсивности роста на определенных концентрациях кадмия после культивирования в течение 5 суток при 28°C.

Установлено, что для штаммов RCAM1066 и RCAM00049 (5C-2) минимальные концентрации кадмия, которые ингибировали рост бактерий, составляли 100 и 1300 мкМ CdCl₂, а минимальные летальные концентрации составляли 250 и 3500 мкМ CdCl₂, соответственно.

Таким образом, за счет использования в заявляемом способе высокого потенциала бобовых растений в восстановлении плодородия и симбиотрофных микробных сообществ почв; за счет использования уникального растительного мутанта гороха SGECdt, обладающего повышенной устойчивостью и аккумуляцией кадмия; за счет использования комплекса эффективных и устойчивых к тяжелым металлам штаммов симбиотрофных микроорганизмов (арбускулярный микоризный гриб, клубеньковые и ассоциативные бактерии), которые улучшают минеральное питание растений, фиксируют атмосферный азот и продуцируют фитогормоны; а также за счет применения штаммов клубеньковых и ассоциативных бактерий, содержащих фермент АЦК деаминазу, который играет важную роль в повышении устойчивости растений к различным стрессам, включая токсичность тяжелых металлов, в т.ч. Cd, заявляемый способ обеспечивает обогащение почвы полезными для растений микроорганизмами, что приводит к восстановлению здорового биоценоза почвы и ускорению процесса восстановления фитоценоза ландшафта.

Заявляемый способ биоремедиации загрязненных кадмием почв иллюстрируется серией вегетационных опытов.

Для этих вегетационных опытов сначала растения гороха дикого типа сорта SGE и мутанта SGECdt были выращены в обогащенной кадмием почве и в почве с низким содержанием кадмия в качестве контроля. Методические особенности такого рода экспериментов с горохом были отработаны ранее (Safronova V.I., Stepanok V.V., Engqvist G.L., Alekseyev Y.V., Belimov A.A. Root-associated bacteria containing 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase improve growth and nutrient uptake by pea genotypes cultivated in cadmium supplemented soil. Biol. Fertil. Soils, 2006, 42, 267-272; Белимов A.A. Взаимодействия ассоциативных бактерий с растениями: роль биотических и абиотических факторов. Palmarium Acad. Publ. 2012, 228 p., ISBN-13: 978-3-8473-9692-5).

Вегетационные опыты проводили в летний период в Санкт-Петербурге в теплице с естественным световым и температурным режимами. Использовали дерново-подзолистую слабоокультуренную почву (углерод общий - 2,23±0,04%; азот общий - 0,16%; подвижный фосфор - 30,3±0,63 мг P2O5/100 г; сумма обменных оснований - 5,9±0,18 мг экв/100 г; pH солевая 4,63±0,12; pH водная 5,45+-0,37, которую стерилизовали автоклавированием и выдерживали в течении 3-4 недель. Растения выращивали в сосудах, содержащих 2,0 кг почвы. Содержание Cd в почве составляло менее 0,5 мг Cd/кг. Удобрения вносили в количестве (мг/кг): NH4NO3 - 15; K2HPO4 - 450; MgSO4 - 60; CaCl2 - 35; H3BO3 - 4; MnSO4 - 4; ZnSO4 - 4; Na2MoO4 - 4. В часть сосудов в почву дополнительно вносили кадмий в форме CdCl2 в количестве не менее 15 мг Cd/кг (т.е. не менее 30 мг Cd на сосуд).

Семена гороха стерилизовали и скарифицировали концентрированной H2SO4 в течение 30 мин, затем проращивали в течение 3 суток в чашках Петри. После чего семена гороха линии SGE и генетически модифицированного SGECdt высевали в разные сосуды в количестве 1 (min) и 3 (max) семя на сосуд, что соответствует норме 20 и 60 семян на 1 м². При этом при высеве гороха в почву каждое семя совмещали (инокулировали) с грибом арбускулярной микоризы Glomus sp. 1Fo (0,5 г (min) и 1,0 г (max) почвенно-корневой смеси на семя) и с водными суспензиями бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae 1066 и Variovorax paradoxus 5C-2 (с титрами 10⁶ кл. (min) и 10⁷ кл. (max) на 1 мл суспензии, в количестве 0,1 мл (min) и 0,5 мл (max) суспензии на 1 семя гороха). Контролем служили сосуды с неинокулированными растениями.

При этом в одних опытах (сосудах) сочетали все min числовые показатели, а в других - все max числовые показатели.

Влажность почвы в опытах поддерживали на уровне 60-70% от полной влагоемкости почвы регулярным поливом. Растения выращивали до полного созревания бобов, после чего срезали и удаляли надземную часть.

Срезанные растения размалывали до порошкообразного состояния и сжигали в смеси азотной кислоты и перекиси водорода для последующего определения в них концентрации кадмия методом оптической эмиссионной спектрометрии параллельного действия с индуктивно-связанной плазмой на спектрометре ICPE-9000 (Shimadzu, Япония).

Результаты опытов приведены в таблице 2.

Сравнение результатов, полученных в указанных вариантах опыта, приведенных в таблице 2, позволяет сделать следующие выводы.

1. Повышение биомассы надземной части растений гороха, выращенных на стерилизованной и загрязненной кадмием почве, за счет инокуляции микроорганизмами составило 330÷360%.

2. Повышение биомассы надземной части растений гороха, выращенных на стерилизованной и загрязненной кадмием почве и инокулированных микроорганизмами, за счет использования генетически модифицированного гороха (мутанта SGECdt) составило 65÷80%.

3. Повышение содержания кадмия в надземной части растений, выращенных на стерилизованной и загрязненной кадмием почве, за счет инокуляции микроорганизмами составило 270÷315%.

4. Повышение содержания кадмия в надземной части растений, выращенных на стерилизованной и загрязненной кадмием почве и инокулированных микроорганизмами, за счет использования генетически модифицированного гороха (мутанта SGECdt) составило 65÷80%.

5. Повышение выноса кадмия надземной частью растений, выращенных на стерилизованной и загрязненной кадмием почве, за счет инокуляции микроорганизмами составило 9-11 раз.

6. Повышение выноса кадмия надземной частью растений, выращенных на стерилизованной и загрязненной кадмием почве и инокулированных микроорганизмами, за счет использования генетически модифицированного гороха (мутанта SGECdt) составило 220÷240%.

Таким образом, применение заявляемого способа биоремедиации загрязненных кадмием почв, в котором используется устойчивая к кадмию симбиотическая растительно-микробная система, состоящая из бобового растения, арбускулярного микоризного гриба, клубеньковых бактерий и ассоциативных бактерий, содержащих фермент АЦК деаминазу, приводит к выносу кадмия растениями из почвы, обогащению почвы питательными веществами в виде корней растений и полезными симбиотическими микроорганизмами.

Эти факторы способствуют снижению содержания кадмия в почве, эффективному восстановлению здорового биоценоза почвы и ускорению процесса восстановления фитоценоза ландшафта.