ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЙ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР, ПРЕДСТАВЛЯЮЩИЙ СОБОЙ БРОМИД 2-{ 4-[(Е)-2-(4-ЭТОКСИФЕНИЛ)ВИНИЛ]ФЕНОКСИ} -N, N, N-ТРИМЕТИЛЭТАМАНАМИНА (С-ТАБ)

Изобретение относится к новому химическому соединению из группы химических соединений с фоточувствительной структурой, обладающих направленным действием на ионные каналы различных возбудимых биологических систем. Данное соединение может быть использовано в экспериментальной медицине, в частности в доклннических исследованиях антиаритмических препаратов, при создании различных модельных систем для исследования активности новых антиаритмических медицинских препаратов, блокирования активности нейронов и кардиомиоцитов. Антиаритмические препараты должны снижать вероятность возникновения спиральных волн возбуждения, которые являются основной причиной возникновения аритмий.

Известен ряд фотосенсибилизаторов - химических соединений с фоточувствительной структурой. Наиболее близким структурным аналогом предлагаемого химического соединения является поверхностно-активный фотосенсибилизатор бромид (2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)диазен-1-ил]фенокси}этил)триметиламмония (АЗОТАБ) [1,2], от которого предлагаемое химическое соединении бромид 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина (С-ТАБ) отличается заменой азобензольной группы на стильбеновую. Несмотря на большое структурное сходство, действие бромида 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина (С-ТАБа) и действие АЗОТАБА на возбудимую клеточную культуру имеет два существенных отличия.

Первое отличие заключается в том, что при использовании заявляемого поверхностно-активного фотосенсибилизатора бромида 2-{4-[(Е)-2-(4-эюксифенил)винил1фенокси]-N,N,N-триметилэтанамина блокирование ионных каналов исследуемой возбудимой клеточной культуры после облучения ближним ультрафиолетовым излучением под действием заявляемого изобретения становится необратимым. В проведенных нами экспериментах было показано, что способность к сокращению у клеток после этого не восстанавливается. Однако, что существенно, клетки, оказавшиеся в зоне действия ультрафиолетового облучения в присутствии АЗОТАБа, не подвергаются некрозу или апоптозу быстрее, чем клетки, на которые ультрафиолетовое облучение не действовало. При этом возбудимая ткань может быть легко отмыта от С-ТАБа, как и от АЗОТАБа, если она не подвергалась воздействию ультрафиолетового облучения, с последующим восстановлением возбудимости до нормального уровня.

Вторым важным отличием заявляемого соединения является то, что благодаря замене азобензольного фрагмента на стильбеновый продукты окисления С-ТАБа являются существенно менее токсичными, что позволяет расширить сферу использования предлагаемого соединения в биотехнологической и медицинской сферах.

На фиг.1 представлена сравнительная таблица характеристик предлагаемого изобретения и его аналога.

В основу данного изобретения поставлена задача создания нового поверхностно-активного фотосенсибилизатора, позволяющего изменять возбудимость сердечной и нейронной ткани с помощью метода оптического контроля возбудимости.

Указанная задача решается тем, что представлен новый поверхностно-активный фотосенсибилизатор, представляющий собой бромид 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина с фотоконтролируемой структурой.

Объектом патентования является структура катиона. Противоион может быть любой.

Вещество представляет собой белый мелкодисперсный кристаллический порошок.

Согласно данным протонного магнитного резонанса, масс-спектрометрического анализа и общей логике последовательности стадий синтеза и структуры предшественников, структурная формула соединения представлена на фиг.2.

Изобретение позволяет изменять возбудимость сердечной и нейронной ткани посредством воздействия заявляемого поверхностно-активного фотосенсибилизатора бромида 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина на ионные каналы кардиомиоцитов и нейронов, составляющих возбудимую ткань.

Объективно проявляющимся техническим результатом воздействия заявляемого поверхностно-активного фотосенсибилизатора бромида 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифеннл)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина на возбудимую клеточную культуру является обратимое и необратимое блокирование ионных каналов клеток, составляющих культуру. Причем блокирование ионных каналов может быть обратимым и необратимым в зависимости от того, была ли исследуемая клеточная культура облучена ближним ультафиолетовым излучением (360 нм). В том случае, если ультрафиолетовое облучение имело место, происходит ковалентное связывание поверхностно-активного фотосенсибилизатора бромида 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина с мембранным окружением, препятствующее восстановлению активности каналов клеток даже после промывания возбудимой клеточной культуры или возбудимой ткани средой, не содержащей заявляемый поверхностно-активный фотосеисибилизатор бромид 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-тримстилзтанамина. Кроме того, заявляемое соединение является низкотоксичным, что расширяет сферу его использования.

Краткий перечень чертежей

На фиг.1 представлена сравнительная таблица характеристик предлагаемого изобретения и его аналога.

На фиг.2 представлена структурная формула поверхностно-активного фотосенсибилизатора бромида 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-тримстилэтанамина.

На фиг.3 представлена общая схема синтеза поверхностно-активного фотосенсибилизатора бромида 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина (римскими числами обозначены номера стадий, арабскими числами обозначены основные продукты).

На фиг.4 представлен спектр Н NMR конечного продукта (400 MHz, растворитель ДМСО-D6).

На фиг.5 представлены экспериментальные результаты исследования действия бромида 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина на культуру неонатальных кардиомиоцитов крысы методом оптического картирования.

Описание синтеза поверхностно-активного фотосенсибилизатора бромида 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина:

Синтез бромида 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметнлэтанамина осуществляется по схеме, представленной на фиг.3, римскими числами обозначены номера стадий, арабскими - номера основных продуктов.

Реагенты, использовавшиеся на соответствующих стадиях: (i) NaBH₄, MeOH; (ii) HBr, Et₂O; (iii) Р(OEt)₃; (iv) CH₃OCH₂Cl, K₂СО₃, СН₃СОСН₃; (v) MeONa, DMF; (vi) PPTS, EtOH; (vii) BrCH₂CH₂Br, K₂СО₃, СН₃СОСН₃; (vii) NMe₃, THF.

Стадия I. Синтез (4-этоксифенил)метанола.

К раствору 4-этоксибензальдегида (60 грамм, 0.4 мол.) в 500 мл метанола при 0°С добавляют порциями по 3 г боргидрид натрия (16,6 грамм, 0.44 мол.), так чтобы температура реакционной массы не превышала 5°С. После добавления всего боргидрида натрия, реакционную смесь перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре. Растворитель упаривают на ротационном испарителе, остаток растворяют в 300 мл воды и экстрагируют этилацстатом дважды по 200 мл. Органический слой высушивают над Na₂SO₄, упаривают на роторном испарителе. Получают 46,7 грамм (4-этоксифенил)метанола (1) в виде прозрачного бесцветного масла, кристаллизующегося в течение нескольких часов. Выход 77%.

Структура соединения характеризуется с помощью спектра ¹Н NMR (400 MHz, растворитель AMCO-D6):δ ppm 1.3(t, J=6.9Hz, 3 H) 4.0 (q, J=6.9, 2 H) 4.4 (d, J=1.1 Hz, 2 H) 5.0 (m, 1 H) 6.9 (d, J=8.6, 2 H) 7.2 (d, J=8.6 Hz, 2 H).

Стадия II. Синтез 1-(бромметил)-4-этоксибензола.

К раствору (4-этоксифенил)метанола (1) (10 г, 0.066 мол.) в 30 мл диэтилового эфира при 0°С и перемешивании добавляют водный раствор HBr (10 мл). Реакционную массу перемешивают при 0°С в течение 30 минут. Растворитель упаривают на роторном испарителе, остаток растворяют в 50 мл воды и экстрагируют диэтиловым эфиром трижды по 50 мл. Органический слой высушивают над Na₂SO₄, упаривают на роторном испарителе. Получают 7,3 грамм 1-(бромметил)-4-этоксибензола (2) в виде желтого кристаллического порошка. Выход 52%.

Структура соединения характеризуется с помощью спектра 1Н NMR (400 MHz, растворитель ДМСО-D6): δ ppm 1.3 (t, J=7.0 Hz, 3 H) 4.0 (d, J=7.0 Hz, 2 H) 4.7 (s, 2 H) 6.9 (d, J=8.6 Hz, 2 H) 7.4 (d, J=8.6 Hz, 2 H).

Стадия III. Синтез диэтил-(4-этоксибензил)фосфоната.

Смесь свежеперегнанного триэтилфосфита (30.8 грамм, 0.185 мол.) и 1-(бромметил)-4-этоксибензола (2) (38 грамм, 0.177 мол.) выдерживают при температуре кипения в течение 10 часов. Избыток фосфита удаляют на роторном испарителе. Получают 47 грамм диэтил-(4-этоксибензил) фосфоната (3) в виде желто-коричневого масла. Выход 90%.

Структура соединения характеризуется с помощью спектра ¹Н NMR (400 MHz, растворитель хлороформ-D): δ ppm 1.3 (t, J=7.1 Hz, 6 H) 1.4 (t, J=7.0 Hz, 3 H) 3.1 (s, 1 H) 3.1 (s, 1 H) 4.0 (m, 6 H) 6.8 (d, J=8.3 Hz, 2 H) 7.2 (d, J=8.3 Hz, 2 H).

Стадия IV. Синтез 4-(метоксиметокси)бензальдегида.

К раствору 4-гидроксибензальдегида (20 грамм, 0.164 мол.) в 300 мл сухого ацетона добавляют K₂СО₃ (56.6 грамм, 0,41 мол.) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем к смеси прибавляют хлорметилметиловый эфир (14.5 грамм, 0.18 мол.), и реакционную массу выдерживают при температуре кипения 12 часов. Образовавшийся осадок отфильтровывают, растворитель упаривают на роторном испарителе. Получают 25 г 4-(метоксиметокси)бензальдегид (4) в виде слегка желтого масла. Выход 92%. Спектр ¹Н NMR не снимался.

Стадия V. Синтез 1-этокси-4-{(Е)-2-[4-(метоксиметокси)фенил]винил}бензола.

К раствору диэтил(4-этоксибензил)фосфоната (49 грамм, 0,180 мол.) в 250 мл диметилформамида прибавляют 18/6-краунэфир (9.51 грамм, 0.036 мол.) и третбутилат калия (40.40 грамм, 0.36 мол.). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем к смеси, охлажденной до 0°С, по каплям прибавляют раствор 4-(метоксиметокси)бензальдегида (44.87 грамм, 0.27 мол.) в 100 мл диметилформамида, и реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем 5 часов при 120 0°С. Реакцию охлаждают, разбавляют равным объемом ледяной воды. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают водой (3 раза по 100 мл), высушивают. Получают 35.0 грамм 1-этокси-4-{(Е)-2-[4-(метоксиметокси)фенил]винил}бензола (5) в виде желтого кристаллического порошка. Выход 68%.

Структура соединения характеризуется с помощью спектра ¹Н NMR (400 MHz, растворитель ДМСО-D6): δ ppm 1.3 (t, J=6.9 Hz, 3 H) 3.4 (s, 3 H) 4.0 (q, J=6.9 Hz, 2 H) 5.2 (s, 2 H) 6.9 (d, J=8.3 Hz, 2 H) 7.0 (d, J=8.6 Hz, 2 H) 7.0 (s, 2 H) 7.5 (dd, J=8.6, 2.4 Hz, 4 H).

Стадия VI. Синтез 4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенола.

К раствору 1-этокси-4-{(Е)-2-[4-(метоксиметокси)фенил]винил}бензола (5 грамм 0.0176 мол.) в 40 мл метанола при 0°С прибавляют 4М раствор хлороводорода в диоксане (40 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель упаривают на роторном испарителе, остаток разбавляют 80 мл диэтилового эфира и отфильтровывают через плотный складчатый фильтр (остаток на фильтре является полимером). Маточный раствор упаривают на роторном испарителе и разбавляют 40 мл воды. Образовавшийся осадок отфильтровывают, высушивают. Получают 3.50 грамм 4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенола (6) в виде кристаллического порошка. Выход 83%. Спектр ¹Н NMR не снимался.

Стадия VII. Синтез 1-(2-бромэтокси)-4-[(Е)-2-(4-этоксифеннл)винил]бензола.

К раствору 4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенола (2.0 грамм, 0.008 мол.) в 50 мл ацетона добавляют поташ (5.74 грамм, 10.083 мол.) и каталитическое количество йодида калия. Реакционную массу выдерживают при температуре кипения в течение 16 часов. Образовавшийся осадок отфильтровывают, растворитель упаривают на ротационном испарителе. Получают 0.6 грамм 1-(2-бромэтокси)-4-[(Е)-2-(4-этоксифснил)винил]бензола (7) в виде кристаллического порошка. Выход 21%.

Структура соединения характеризуется с помощью спектра ¹Н NMR (400 MHz, растворитель ДМСО-D6): δ ppm 1.3 (t, J=6.9 Hz, 3 H) 3.8 (m, 2 H) 4.0 (q, J=6.9 Hz, 2 H) 4.3 (m, 2 H) 6.9 (m, 4 H) 7.0 (s, 2 H) 7.5 (m, 4 H).

Стадия VIII. Синтез 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина бромида.

1-(2-бромэтокси)-4-[(Е)-2-(4-этоксифеннл)винил]бензол (7) 1 грамм (0,0029 мол.), растворяют в 20 мл сухого тетрагидрофурана и охлаждают до 0°С. Через полученный раствор пробулькивают триметиламин в течение 30 минут. Затем раствор выдерживают 48 часов при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают 10 мл тетрагидрофурана и высушивают под вакуумом. Продукт перекристаллизовывают из этанола. Получают 0,6 грамм 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина бромида (8) в виде белого кристаллического порошка. Выход 50%.

Структура полученного соединения характеризуется с помощью спектра ¹Н NMR (400 MHz, растворитель ДМСО-D6): δ ppm 1.3 (t, J=6.9 Hz, 3 H) 3.3 (s, 6 Н) 3.8 (m, 2 H) 4.0 (d, J=7.0 Hz, 2 H) 4.5 (s, 2 H) 6.9 (d, J=8.6 Hz, 2 H) 7.0 (d, J=8.6 Hz, 2 H) 7.1 (s, 1 H) 7.5 (m, 4 H). Спектр приведен на фиг.4.

Молекулярная масса синтезированного соединения бромида 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина была охарактеризована масс-спектрометрически. Соотношение m/z для основного пика составило 326 (M⁺+1).

Заявляемое изобретение может быть использовано для изменения возбудимости сердечной и нейронной ткани посредством воздействия заявляемого поверхностно-активного фотосенсибилизатора бромида 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина на возбудимую клеточную культуру, срезы миокарда или срезы мозга. При использовании заявляемого изобретения в сочетании с методом оптическою картирования и методом оптического контроля возбудимости [1, 2] сердечной ткани использование заявляемого изобретения позволяет создавать в слое клеток ткани исследуемых образцов возбудимые и невозбудимые зоны, имитирующие нарушения в структуре проводящих возбуждение участков миокарда. С помощью метода оптического картирования можно регистрировать спиральные волны возбуждения, а так же их подавление, в модельных системах, в том числе в монослое культуры кардиомиоцитов с измененной под действием заявляемого поверхностно-активного фотосенсибилизатора бромида 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фснокси}-N,N,N-триметилэтанамина проводящей потенциал действия клеточной сетью.

В качестве примера использования изобретения представлен способ подавления спонтанной и внешне активируемой сократительной активности клеток сердечной ткани кардиомиоцитов с использованием представленного поверхностно-активного фотосенсибилизатора бромида 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина.

Способ подавления спонтанной и внешне активируемой сократительной активности кардиомиоцитов с использованием поверхностно-активного фотосенсибилизатора, представляющего собой бромид 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина

1. Для осуществления способа в качестве исследуемой культуры клеток используют возбудимую культуру неонатальных кардиомиоцитов, полученную по методике, описанной в работе [5]. Также используют установку для оптического картирования и цифрового оптического контроля возбудимости сердечной ткани на основе широкофокусного микросокпа Olympus MVX10, снабженного высокочувствительной CCD-камерой Andor iXon3 и модифицированного цифрового проектора Taxan KG-PL105S, описанную в работе [1]. В качестве флуоресцентного красителя, с помощью которого исследуется динамика возбуждения, используют fluo 4.

2. Прокрашенную fluo 4 возбудимую культуру кардиомиоцитов помещают в поле широкофокусного объектива (см. кадры А-Е фиг.5). При этом наблюдают автоволны возбуждения, связанные с изменением концентрации ионов кальция в цитозоле кардиомиоцитов, участвующих в передаче потенциала действия.

3. Далее к среде над кардиомиоцитами добавляют раствор заявляемого поверхностно-активного фотосенсибилизатора, представляющего собой бромид 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина (С-ТАБа) в диметилсульфоксиде (концентрация действующего вещества в стоковом растворе 5 мМ, концентрация в среде над кардиомиоцитами 100 мкМ). При этом наблюдают постепенное затухание спонтанной активности, автоволны исчезают. Спустя 5 минут после добавления С-ТАБа клетки теряют способность не только к спонтанному, но и к вынужденному сокращению (напряжение 9 В, длительность импульса 20 мс). Этот состояние культуры показано на кадре F (фиг.5).

4. После этого с помощью установки оптического контроля часть поверхности клеточной культуры облучают ближним ультрафиолетовым излучением. Мощность используемого излучения составляет 6 мВт/см², время экспозиции - 5 секунд.

5. После этого клеточную культуру дважды промывают средой без С-ТАБа из расчета 1 мл среды на 1 см² поверхности культуры.

6. После этого культуру снова помещают в поле широкофокусного объектива установки для оптического картирования и контроля возбудимости. При этом наблюдают следующую картину (кадры G-K, фиг.5): волны возбуждения возникают только в той части клеточной культуры, которая не была подвергнута ультрафиолетовому облучению в присутствии С-ТАБа.

Из приведенного на фиг.5 иллюстративного материала видно, что представленный поверхностно-активный фотосенсибилизатор бромид 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина блокирует возбудимость кардиомиоцнтов. Причем после облучения ультрафиолетом блокирование возбудимости становится необратимым, поскольку бромид 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина ковалентно соединяется с мембранным окружением и не убирается из мембраны простой заменой среды. Таким образом, заявляемое изобретение поверхностно-активный фотосенсибилизатор бромид 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина блокирует возбудимость кардномиоцитов и может специфически необратимо блокировать возбудимость только тех кардиомиоцитов, которые подвергались воздействию ультрафиолетового облучения.

В контрольных экспериментах было показано, что само по себе ультрафиолетовое излучение в том количестве, которое было использовано в описанном выше опыте, не приводит к сколь-нибудь заметному увеличению клеточной гибели или изменению возбудимости кардиомиоцитов.

Воздействие С-ТАБа на нейронную ткань: Механизм генерации потенциала действия в нейронах и кардиомиоцитах имеет ряд важных общих черт, позволяющих предположить, что действие предлагаемого поверхностно-активного фотосенсибилизатора, представляющего собой бромид 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина (С-ТАБа), на возбудимую клеточную культуру кардиомиоцитов и нейронов не будет иметь существенных отличий. Это связано, в первую очередь, с тем, что в нейронах и кардиомиоцитах в генерации потенциала действия принимают участие идентичные ионные (натриевые, калиевые, кальциевые и хлорные) каналы. Блокирование С-ТАБом ионных каналов в нейронах будет проходить аналогично механизму блокирования ионных каналов в кардиомиоцитах.

Выводы: заявляемое изобретение поверхностно-активный фотосенсибилизатор бромид 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина позволяет изменять возбудимость сердечной и нейронной ткани за счет блокирования ионных каналов клеток, составляющих культуру, при этом дополнительно обеспечивает селективное необратимое блокирование ионных каналов только тех клеток, которые были подвергнуты в его присутствии воздействию ультрафиолетового излучения. Кроме того, предлагаемый поверхностно-активный фотосенсибилизатор бромид 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина является низкотоксичным, что позволяет расширить сферу использования предлагаемого соединения в биотехнологической и медицинской сферах.

Изобретение может быть использовано в медицине, в частности в доклинических исследованиях антиаритмических препаратов, назначение которых снижать вероятность возникновения спиральных волн возбуждения, которые являются основной причиной возникновения аритмий.

Источники

1. I.S.Erofeev, N.Magome, K.I.Agladze, “Digital photocontrol of the network of live excitable cells”, JETP Letters, 94:6 (2011), 513-516.

2. Magome N., Agladze K. “Patterning and excitability control in cardiomyocyte tissue culture”, PhysicaD, vol. 239, 1560-1566.

3. Fortin, D.L., Banghart, M.R., Dunn, T.W., Borges, K., Wagenaar, D.A., Gaudry,Q., Karakossian, M.H., Otis, T.S., Kristan, W.B., Trauner, D., and Kramer, R.H. “Photochemical control of endogenous ion channels and cellular excitability”. Nat. Methods. 2008. 5, 331-338.

4. Mourot A., Fehrentz Т., Le Feuvre Y., Smith C.M., Herold C., Dalkara D., Nagy F., Trauner D., Kramer R.H. “Rapid optical control of nociception with an ion-channel photoswitch”. Nat. Methods. 2012. 9. 396-402.

5. Селина Л.В., Мотовилов К.А., Ягужинский Л.С., Агладзе К.И. “Восстановление сократительной активности первичной культуры кардиомиоцитов крысы, подавленной ингибиторами митохондриальной NADH-дегидрогеназы, под влиянием гидрофильных хинонов”. Труды МФТИ. 2013.1 (в печати).