Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОКСИНА ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE APXI, ИСПОЛЬЗУЯ КУЛЬТУРАЛЬНУЮ СРЕДУ, СОДЕРЖАЩУЮ КОМПЛЕКС КАЛЬЦИЙ-БОРОГЛЮКОНАТ

Изобретение относится к способу получения RTX-токсина ApxI путем культивирования бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae в культуральной среде, которая обеспечивает рост бактерий, к этой среде добавляют кальциевую соль для образования в среде ионов кальция.

Плевропневмония свиней, основное респираторное заболевание свиней, распространена во всем мире и обусловливает тяжелые экономические потери в свиноводстве вследствие молниеносных смертей, лечения тяжелобольных свиней и задержки в сбыте из-за хронически инфицированных животных. Этиологическим агентом является Actinobacillus pleuropneumoniae. Она передается в основном через прямой контакт между животными, и полученная инфекция приводит к течению болезни от молниеносного до хронического. Заболевание, главным образом, представляет собой инфекцию дыхательных путей, имеющую клинические признаки высокой лихорадки, тяжелой дыхательной недостаточности, кашля и анорексии. Начало заболевания быстрое, заболеваемость и смертность высоки. Один из способов контроля инфицирования бактериями Actinobacillus pleuropneumoniae (в дальнейшем также называемыми «АРР») представляет собой программы вакцинации. В таких программах были использованы пассивированные бактерины, но известно об их тяжелых побочных действиях. В настоящее время широко используются субъединичные вакцины на основе токсинов АРР.

АРР продуцирует так называемые RTX-токсины (RTX обозначает повтор в токсине). Наличие этих RTX-токсинов вносит большой вклад в патогенную природу этой бактерии. RTX-токсины были подробно рассмотрены ранее и описаны в литературе. Как хорошо известно, не все серотипы АРР продуцируют все RTX-токсины. Например, серотипы 1, 5, 9 и 11 продуцируют ApxI и ApxII. Серотипы 2, 3, 4, 6 и 8 продуцируют ApxII и ApxIII. Серотип 10 продуцирует лишь ApxI, и серотипы 7 и 12 продуцируют лишь ApxII. Существующие на сегодняшний день коммерчески доступные вакцины против АРР основаны на токсинах ApxI, ApxII и ApxIII. Относительно недавно было обнаружено, что все серотипы АРР продуцируют четвертый RTX-токсин, в настоящее время называемый ApxIV (см. ЕР 0875574).

Широко известно, как продуцировать RTX-токсин ApxI посредством культивирования Actinobacillus pleuropneumoniae в культуральной среде, в которую добавляют соль кальция (т.е. химическое соединение на основе кислоты, образованное замещением всех или части ионов водорода кислоты на один или несколько ионов кальция). В частности, ранее в ЕР 0453024 описан такой способ (см. «пример 2», абзац 2 «Очистка и характеристика гемолизина», подпункт «Способы»). Следует принять во внимание, что использованный ApxI должен обозначаться «HLY» (см. статью Frey et al. в журнале “J Gen Microbiol.”, август, 1993 г.; 139(8): 1723-8). Из этого ЕР патента известно о добавлении в среду соединения кальция (CaCl₂). В действительности, в статье Microbiol Pathogenesis 37 (2004) 29-33 указано, что транскрипционная активность оперона ApxI усиливается при добавлении в ростовую среду кальция. Таким образом, могут быть обеспечены высокие уровни токсина ApxI. Среда должна поддерживать рост бактерий АРР. Хорошо известно, как составить среду, которая обеспечивает рост бактерий. Классические культуральные среды изначально разрабатывались Иглом, Хэмом и другими в 1950-60 гг. Они обнаружили, что среда, которая удовлетворяет основным потребностям роста, должна содержать неорганические соли, источник азота (например, в форме азотсодержащих соединений, таких как пептиды или белки), источник углерода и витамины. Среды преимущественно забуферивают для предотвращения их либо от закисления, либо от защелачивания. В этом основном рецепте доступно большое число различных составов. Например, для обеспечения аминокислотами можно выбрать компоненты животного происхождения, но также можно выбрать химически определенные аминокислоты. В отношении других соединений также возможно большое число вариантов. На самом деле, составить среду, которая обеспечивает рост бактерий, сравнительно просто. Тем не менее, оптимизация роста и/или получения метаболитов может потребовать некоторого времени на разработку, в частности, если предпочтительна среда, которая не содержит сыворотку или другие компоненты животного происхождения. Стратегии улучшения ферментационной среды, тем не менее, хорошо известны в данной области и подробно описаны в литературе (см., например, обзорную статью Kennedy и Krouse в журнале Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (1999) 23, 456-475). Такая оптимизация составляет часть рутинных экспериментов в лаборатории ферментации. В случае культивирования АРР, NAD (никотинамидадениндинуклеотид) по существу составляет часть среды, поскольку бактерия АРР является NAD-зависимой. В отсутствие NAD среда не будет поддерживать рост бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae и поэтому может не рассматриваться в качестве жидкой среды для поддержания роста АРР с точки зрения настоящей заявки и прилагаемой формулы изобретения. Среды для поддержания роста бактерий или компоненты для составления таких сред коммерчески доступны у большого числа фирм, таких как Sigma Aldrich, Quest International, Oxoid, Becton Dickinson, Pharmacia, VGD Inc, Mediatech, Invitrogen, Marcor, Irvin Scientific и т.д.

Несмотря на то, что способы предшествующего уровня техники достаточны для получения экономически значимого выхода токсина ApxI, заявитель понимал, что существует возможность улучшения. Именно в процессе ферментации среда становится мутной. Заслугой заявителей было осознание того, что это может быть следствием преципитации одной (или нескольких) солей кальция. Именно АРР продуцирует углекислый газ, который в среде превращается в ионы карбоната. Карбонат кальция представляет собой соль с крайне низкой растворимостью. Вследствие этого могут возникнуть некоторые проблемы. Во-первых, полагают, что преципитация отбирает вовлеченные ионы кальция, делая их недоступными для бактерий АРР. Во-вторых, преципитированные соли кальция вызывают проблемы, связанные с обработкой. В частности, фильтры имеют тенденцию забиваться. Поэтому заявитель добавил в среду большое число комплексообразующих агентов, чтобы посмотреть, могут ли они предотвратить преципитацию соли. На самом деле, например, при добавлении EDTA среда может оставаться более или менее прозрачной. Тем не менее, применение таких комплексообразующих агентов негативно влияет на получение ApxI. Таким образом предположение, по всей видимости, ошибочно или неполно. Однако все-таки есть потребность в улучшении продукции ApxI.

Неожиданно было обнаружено, что при использовании бороглюконата (например, в форме 2,3-дигидрокси-3-[2-гидрокси-5-(гидроксиметил)-1,3,2-диоксаборолан-4-ил]пропаноата; см. также статью Herbert Taylor MacPherson и James Stewart из института Моредун в Biochemical Journal: “Investigations on the nature of calcium borogluconate”, изданном 16 ноября 1937 г.) для образования комплекса с ионами кальция можно получать ApxI на высоком уровне по сравнению со способами предшествующего уровня техники, в которых не применяются (не добавляются) комплексообразующие агенты или которые основаны на других комплексообразующих агентах. Очевидно, что при использовании этого конкретного комплексообразующего агента так, что среда содержит комплекс кальций-бороглюконат (например, доступный в виде D-глюконовой кислоты, циклический 4,5-сложный эфир с борной кислотой, кальциевая соль 2:1), может быть предотвращена значительная преципитация ионов кальция с другими отрицательными ионами, в то же время ионы кальция остаются способными усиливать транскрипционную активность оперона ApxI бактерии Actinobacillus pleuropneumoniae. По всей видимости, ионы кальция остаются "захваченными" в комплекс соли, где связи «захвата» с одной стороны достаточно сильны, чтобы предотвратить образование ионами кальция преципитата, например, с карбонатом или другими отрицательными ионами, но с другой стороны позволяют самой бактерии использовать ионы кальция, если они находятся в свободном растворе (т.е. образуют комплекс лишь с молекулами воды). По всей видимости, бороглюконат полностью удовлетворяет критическому равновесию, которое необходимо для продукции ApxI бактерией АРР.

В одном из вариантов осуществления концентрация бороглюконата составляет меньше 60 ммоль/л. Свыше этой концентрации обнаруживается, что продукция ApxI падает до низких уровней. Даже если это возможно, предпочтительно, чтобы концентрация оставалась ниже этой цифры. Более предпочтительно, чтобы концентрации находились в диапазоне от 25 до 45 ммоль/л, в частности 40 ммоль/л, что представляется оптимальным для некоторых сред.

Хотя это не существенно для настоящего изобретения, среда может не содержать компонентов животного происхождения. Недостаток многих способов предшествующего уровня техники заключается в том, что они основаны на применении сред, содержащих компоненты животного происхождения, таких как колумбийская питательная среда. Другие компоненты животного происхождения, упоминаемые в предшествующем уровне техники, представляют собой, например, модифицированную колумбийскую питательную среду или сердечно-мозговую инфузионную среду. Как хорошо известно, применение компонентов животного происхождения имеет несколько существенных недостатков. Во-первых, химический состав может заметно варьировать между партиями продукции. Кроме того, добавки животного происхождения могут быть контаминированы инфекционными агентами. Самое опасное - это присутствие прионов, вызывающих TSE у людей или животных. Можно просто выбрать среду, которая не содержит компонентов животного происхождения (часто обозначаемую как среда «ACF»). «Компонент животного происхождения» в этом смысле означает любой компонент, который присутствует как таковой в животном (например, кровь или белок) или происходит из такого компонента (например, модифицированная сыворотка, полученная из крови, или аминокислоты, полученные из белка). Заявитель, тем не менее, обнаружил, что эффективность продукции ApxI значительно ниже при использовании таких сред ACF по сравнению со средами, содержащими компоненты животного происхождения, даже если концентрация кальция находится на достаточном уровне. Не касаясь теории, возможно, что при использовании сыворотки проблема преципитации кальциевой соли станет не настолько тяжелой благодаря наличию агентов, которые образуют растворимые комплексы ионов кальция. В любом случае при использовании бороглюконата для образования комплекса с ионами кальция в этих средах также может быть получено существенное повышение выхода ApxI.

В другом варианте осуществления кальциевая соль представляет собой бороглюконат кальция. Хотя возможно еще, например, применение хлорида кальция в качестве источника кальция и добавление бороглюконатной соли для образования комплекса с ионами кальция, предпочтительно, чтобы кальций добавлялся в виде бороглюконатной соли. Таким образом, нет необходимости дожидаться равновесия между большим числом физических реакций (преципитацией, растворением, разрушением комплекса, образованием комплекса), которые происходят в среде. Это сберегает время и поэтому экономически выгодно.

В еще одном варианте осуществления в процессе культивирования через жидкую среду пропускают воздух, причем воздух содержит углекислый газ выше атмосферного уровня. Неожиданно было показано, что углекислый газ повышает объем продукции ApxI еще больше. Отмечено, что в основном известно о применении повышенного уровня углекислого газа во время культивирования колоний бактерий на чашках (см., например, патент США 6019984: ПРИМЕРЫ «Бактериальные штаммы и условия роста»). Тем не менее, это относится и к культивированию колоний бактерий, которые затем используются для инокуляции ферментеров. На этой стадии продукция RTX-токсинов незначительна. Еще точнее, в целом понятно (см., например, Microbial Pathogenesis 37 (2004) 29-33), что максимальная продукция Apx имеет место при высокой плотности клеток в ферментерах, то есть в конце экспоненциальной фазы роста. Понятно, что на этой стадии углекислый газ уже не подходит в качестве стимулирующего фактора. Поэтому ранее не делалось попыток повысить продукцию Apx за счет применения повышенных уровней углекислого газа. В частности, заявитель обнаружил, что при содержании в воздухе 5 об.% углекислого газа (объем чистого углекислого газа к объему обычного воздуха) продукция ApxI находится на очень высоком уровне. Отмечено, что в данном варианте осуществления для пропускания воздуха через среду могут быть использованы многие техники, обычно с помощью устройства, которое позволяет пузырькам воздуха просачиваться где-либо в среду (т.е. под поверхность среды). Под «воздухом» в контексте настоящего изобретения понимают газообразную среду, содержащую один или несколько газообразных компонентов, которые обычно присутствуют в атмосферном воздухе, таких как кислород, азот, углекислый газ, гелий, неон, аргон, ксенон, радон и т.д.

Изобретение далее дополнительно разъяснено с использованием следующих неограничивающих примеров.

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Бактериальный штамм и среды

Исследования осуществляли, используя штамм Actinobacillus pleuropneumoniae, продуцирующий ApxI, серотип 10, далее в данном документе называемый АРР 10. Во всех случаях рабочий посевной материал этого штамма восстанавливали, используя чашки с основой колумбийского кровяного агара (BAB) (продукция фирмы Becton, Dickinson USA). Использованные жидкие среды представляли собой либо колумбийскую питательную среду (продукция фирмы Becton, Dickinson USA), поддерживаемую при величине рН 7,3, используя NaOH и уксусную кислоту, либо среду, не содержащую компонентов животного происхождения (называемую «средой ACF»). Последняя среда содержит MgSO₄ (0,75 г/л), цистеин·HCl (0,1 г/л), FeCl₃ (0,1 г/л), NaNO₃ (0,1 г/л), KCl (0,1 г/л), следовые элементы (например, 2,5 мл раствора SL-10, указанного в руководстве Handbook of Microbiological Media, 3^rd rdition, Ronald Atlas, CRC press, 2004), 50% раствор глюкозы (10 мл) и 10 мМ раствор аминокислот (содержащий все 20 аминокислот, за исключением триптофана), буфер HEPES (6 г/л; например, доступный от фирмы Sigma Aldrich) и дрожжевой экстракт (10 г/л; например, доступный от Becton, Dickinson).

Эти среды использовали в прекультивировании и ферментации. Никотинамидадениндинуклеотид (0,01%) и кальций (в различных концентрациях) использовали в прекультурах и ферментациях. Все среды стерилизовали фильтрацией с диаметром пор 0,22 мкм. Перед использованием в ферментациях среды нагревали при 85°С в течение одной минуты.

Культивирование

Рабочий посевной материал штамма АРР 10 высевали на чашку с колумбийским агаром ВАВ и инкубировали в течение приблизительно 24 часов при 37°С. Несколько колоний отбирали для инокуляции сосуда объемом 500 мл, содержащего 75 мл колумбийской питательной среды. Сосуд инкубировали в течение приблизительно 6 часов при 37°С при встряхивании для образования прекультуры. Посредством этой прекультуры осуществляли несколько ферментаций. Некоторые из них осуществляли в сосудах объемом 500 мл. В этом случае 75 мл среды инокулировали 1 мл прекультуры. Сосуды инкубировали при 37°С при встряхивании. Альтернативно культивирование осуществляли в ферментерах SIXFORS (продукция фирмы Infors AG, Switzerland), содержащих приблизительно 400 мл культуральной среды, в которую добавляли 20 мл прекультуры в качестве инокулята. Температура культивирования также составляет 37°С.

Анализы

Рост клеток определяли путем измерения оптической плотности (OD) при 660 нм. Концентрацию антигена ApxI измеряли с помощью принятого анализа ELISA.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Первый эксперимент проводили для определения, доступен ли еще кальций, несмотря на образование комплекса с бороглюконатом, для бактерий АРР. Этот эксперимент осуществляли в сосудах, как описано в данном документе выше. Результаты представлены ниже в таблице 1.

Как указывают данные таблицы 1, при образовании комплекса ионов кальция с бороглюконатом может быть получен хороший выход ApxI. Важное преимущество образования этого комплекса состоит в том, что преципитация кальциевой соли больше не влияет в значительной степени на течение процесса.

Второй эксперимент осуществляли, чтобы понять, какое влияние оказывает бороглюконат в среде, не содержащей компонентов животного происхождения. Для этого авторы сравнили добавление 20 мМ раствора CaCl₂ с добавлением 20 мМ раствора Са-бороглюконата. Результаты представлены в таблице 2.

Получены два результата. Во-первых, понятно, что при использовании хлорида кальция получение достаточных количеств ApxI в среде ACF затруднительно даже при создании нормальных уровней кальция. При образовании комплекса кальция с бороглюконатом может быть получен высокий выход ApxI. Сопоставимые результаты могут быть получены в других средах. Авторы осуществили такой эксперимент в среде, которая не содержала ни хлорида железа, ни сульфата магния («ACF-alt»), но в остальном представляла собой ту же среду, что и среда ACF, описанная в данном документе выше. И на этот раз при образовании комплекса кальция с бороглюконатом получали повышенные в значительной степени уровни.

Третий эксперимент осуществляли для изучения влияния концентрации бороглюконата. Авторы использовали три различных концентрации, а именно 20, 40 и 60 мМ бороглюконата кальция. Результаты представлены в таблице 3.

Как становится понятно из таблицы 3, оптимальна концентрация около 40 мМ.

В четвертом эксперименте авторы изучили влияние повышенных уровней углекислого газа на получение ApxI. Для этого авторы использовали среду ACF-alt, описанную в данном документе выше, и повысили уровень нитрата натрия до 0,5 г/л. Концентрацию бороглюконата варьировали между 40, 50 и 70 мМ. Повышенную концентрацию СО₂ получали, поддерживая постоянный поток воздуха в ферментере 1 vvm (объем газа на объем среды в минуту) для смеси воздух/СО₂ 95/5 об./об. Эксперименты осуществляли в ферментере SIXFORS, как описано в данном документе выше. Результаты представлены в таблице 4.

Исходя из данных результатов, можно сделать вывод, что углекислый газ положительно влияет на продукцию ApxI: даже при концентрации 70 мМ бороглюконата кальция могут быть получены приемлемые уровни ApxI. И в данном случае оптимальна концентрация 40 мМ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Заявитель обнаружил, что в жидкой культуральной среде, которая поддерживает рост бактерий АРР, бороглюконат может обеспечивать предельное равновесие между предотвращением преципитации ионов кальция с отрицательно заряженными ионами, с одной стороны, и сохранением ионов кальция, доступных для стимуляции Actinobacillus pleuropneumoniae к продукции ApxI, с другой стороны. Это может быть использовано преимущественно в любой среде для культивирования Actinobacillus pleuropneumoniae, содержащей отрицательные ионы, которые образуют преципитат с ионами кальция. В действительности, в зависимости от выбранной среды и оптимизации ее компонентов бактерии АРР сами будут продуцировать более высокие или более низкие уровни ApxI. Но поскольку экранирующее действие бороглюконата будет работать независимо от реальной скорости продукции самих бактерий, этот раствор может быть успешно использован для всех сред, в частности поскольку, по сути, все среды содержат карбонатные ионы, которые представляют собой ионы, способные образовывать преципитат с ионами кальция.