ФОТОБИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ОБРАЗОВАНИЯ ВОДОРОДА И ФОТОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРОДА

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к фотобиокатализатору на основе пигмент-белкового комплекса природной фотосистемы 1 и фермента гидрогеназы, совместно иммобилизованных на наноструктурированной мезопористой пленке диоксида титана (ТiO₂), и может быть использовано в энзиматических фотокаталитических процессах получения водорода под действием света.

Разработка новых технологий получения молекулярного водорода имеет важнейшее значение для решения проблемы альтернативных источников энергии. Молекулярный водород обеспечивает технологичное аккумулирование, транспортировку и последующее потребление запасенной энергии. Достоинством водорода, как топлива, является высокая удельная теплота сгорания и отсутствие загрязняющих продуктов.

Гидрогеназа - фермент, катализирующий реакцию: . Энзиматические реакции фотообразования водорода протекают в присутствии фотосенсибилизатора, способного преобразовывать энергию света в энергию разделенных электрических зарядов (фермент использует фотогенерированные электроны для образования молекулярного водорода). Известно, что в качестве фотосенсибилизатора можно использовать неорганические полупроводники, например TiO₂ (RU 2275238, 27.04.2006; RU 2259866, 10.09.2005; US 6939611, 06.09.2005), или пигмент-белковый комплекс природной фотосистемы 1 (ФС 1) (US 6410258, 25.06.2002; Lubner С.Е. et al. ″Wiring Photosystem I for Direct Solar Hydrogen Production″. J.Biochemistry, 49, (2010) 10159-10163); Erwin Reisner ″Solar Hydrogen Evolution with Hydrogenases: From Natural to Hybrid Systems″. Eur. J.Inorg.Chem., 2011, 1005-1016). Использование ФС 1 представляется наиболее перспективным подходом, так как позволяет получать молекулярный водород под действием видимого света (TiO₂ генерирует электроны при освещении УФ светом).

Ферменты в свободном виде и в растворах неустойчивы и быстро теряют активность. Повышение стабильности гидрогеназы, как и других ферментов, достигается иммобилизацией на различных носителях, в частности на неорганических (RU 2326818, C01G 23/047, C12N 11/14, B01J 37/36, 20.06.2008; RU 2281328, C12N 11/14, C12N 9/26, 10.08.2006; RU 2279475, C12N 11/14, C12N 9/26, 10.07.2006; RU 2224020, C12N 11/14, C12N 9/26, 20.02.2004; RU 2167197, C12N 11/14, 20.05.2001), при этом значительно повышается также технологичность применения ферментов. В настоящее время, в связи с развитием нанобиотехнологии, основное внимание исследователей обращено к наноструктурированным носителям для иммобилизации ферментов (например, RU 2326818, 20.06.2008).

ФС 1 является пигмент-белковым комплексом, эффективно преобразующим солнечную энергию в энергию разделенных электрических зарядов. Структурные и функциональные особенности пигмент-белкового комплекса ФС 1 делают его весьма привлекательным объектом для практического использования. ФС 1 обладает свойствами, позволяющими ей служить в качестве высокоэффективного фотосенсибилизатора фотообразования водорода. Содержащиеся в ней пигменты поглощают фотоны на всех длинах волн в видимой области спектра короче 750 нм, что составляет 43-46% от солнечного излучения, достигающего поверхности Земли. Квантовый выход преобразования поглощенного ФС 1 света близок к 100%. Терминальный акцептор электронов в ФС 1 имеет отрицательный редокс-потенциал, достаточный для восстановления протонов воды до водорода. ФС 1 является весьма стабильным пигмент-белковым комплексом.

Работы, направленные на создание на основе ФС 1 фотокаталитических систем, осуществляющих образование водорода под действием видимого света, ведутся в ряде лабораторий. К настоящему времени продемонстрировано фотообразование водорода в различных системах, содержащих ФС 1, включая хлоропласт, субхлоропластные фрагменты, обогащенные ФС 1 и изолированную ФС 1. В качестве катализатора образования водорода в таких системах применяют фермент гидрогеназу (US 6410258. 25.06.2002; Lubner С.Е. et al. ″Wiring Photosystem I for Direct Solar Hydrogen Production″ J. Biochemistry, 49, (2010) 10159-10163; Никандров B.B. и др. «Фотосенсибилизированное образование водорода частицами первой фотосистемы». Биофизика (1983) 28, №4, 699-701: Alexander Schwarze et al. ″Requirements for Construction of a Functional Hybrid Complex of Photosystem I and [NiFe]-Hydrogenase″. Applied and Environmental Microbiology. 2010, Vol.76. No. 8, p.2641-2651; Erwin Reisner ″Solar Hydrogen Evolution with Hydrogenases. From Natural to Hybrid Systems″. Eur. J. Inorg. Chem., 2011, 1005-1016). В указанных работах реакция фотообразования водорода осуществляется при освещении видимым светом при сопряженном действии ФС 1 и фермента гидрогеназы. Реакция проводится в буферном водном растворе, содержащем пигмент-белковый комплекс ФС 1, гидрогеназу, органический донор электрона и переносчик электрона.

Проведение реакции в водном растворе ограничивает использование ФС 1 в биотехнологии, так как, во-первых, в свободном виде ФС 1 и ферменты нестабильны, во-вторых, требуется трудоемкая процедура отделения продуктов реакции и, в-третьих, практически невозможно повторное использование ФС1 и фермента. Эффективные и стабильные системы получения водорода под действием солнечного света с применением ФС 1 и гидрогеназы до сих пор не получены. Главной причиной этого является отсутствие методов совместной иммобилизации ФС 1 и гидрогеназы, обеспечивающих высокое содержание ФС 1 и гидрогеназы в носителе, длительное функционирование ФС 1 и фермента и эффективный обмен электронами между ФС 1 и гидрогеназой.

Наиболее близкими к предлагаемому изобретению являются фотобиокатализатор для образования водорода и фотокаталитический способ получения водорода, описанные в RU 2322498, C12N 9/00, C12N 11/00, 20.04.2008 (прототип). Фотобиокатализатор-прототип содержит гидрогеназу, иммобилизованную на наноструктурированной мезопористой пленке TiO₂ в количестве 0,1-2,3 нмоль на 1 см² поверхности пленки TiO₂, полученной из нанокристаллов TiO₂ размером от 15 до 25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г на стеклянной подложке. Реакцию фотообразования водорода по способу-прототипу осуществляют в анаэробных условиях в присутствии фотобиокатализатора-прототипа и органического донора электрона при освещении УФ светом с λ=365 нм.

Фотобиокатализатор-прототип позволяет с достаточно высокой скоростью получать водород под действием УФ света, но не пригоден для получения водорода при действии видимого света.

Задачей изобретения является создание стабильного фотобиокатализатора на основе гидрогеназы и ФС 1, совместно иммобилизованных на наноструктурированной мезопористой пленке ТiO₂, который будет отличаться высокой активностью - благодаря обеспечению эффективного обмена электронами между ФС 1 и гидрогеназой - и позволит получать водород под действием видимого света с достаточно высокой скоростью.

Задачей изобретения является также разработка эффективного и технологичного фотокаталитического способа получения водорода с помощью предлагаемого фотобиокатализатора при освещении видимым светом, который обеспечит высокую стабильность ФС 1 и гидрогеназы, их длительное функционирование и многократное использование.

Решение поставленной задачи достигается:

- предлагаемым фотобиокатализатором для образования водорода, включающим гидрогеназу, иммобилизованную на наноструктурированной мезопористой пленке диоксида титана, приготовленной из нанокристаллов диоксида титана размером от 15 до 25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г на стеклянной подложке, в количестве не менее 0,1 нмоль на 1 см² поверхности пленки, в котором совместно с ферментом гидрогеназой на наноструктурированной мезопористой пленке диоксида титана иммобилизован фотосенсибилизатор ФС 1 - пигмент-белковый комплекс фотосистемы 1 - в количестве 0,01-0,04 нмоль ФС 1 на 1 см² поверхности пленки, при этом наноструктурированная мезопористая пленка диоксида титана имеет толщину 4-8 мкм, удельную поверхность 50-65 м²/г, поры со средним радиусом 11,5 нм и удельным объемом 0,50-0,65 см³/г;

- предлагаемым фотокаталитическим способом получения водорода в присутствии фотобиокатализатора в анаэробных условиях, в котором реакцию фотообразования водорода осуществляют при освещении видимым светом с λ = 490-750 нм в присутствии описанного выше заявляемого фотобиокатализатора, органического донора электрона и переносчика электрона.

Реакцию фотообразования водорода можно проводить при освещении видимым светом с λ = 600-750 нм.

Предлагаемые фотобиокатализатор и способ получения водорода были разработаны в результате проведенных авторами исследований влияния структуры наноструктурированных мезопористых пленок ТiO₂ на процесс совместной иммобилизации на них гидрогеназы и ФС 1 и изучения сопряженного действия ФС 1 и фермента в фотобиокатализаторе.

Было установлено, что реакция фотообразования водорода при освещении видимым светом осуществляется на поверхности наноструктурированной мезопористой пленки ТiO₂, в порах которой иммобилизованы совместно ФС 1 и гидрогеназа, что обеспечивает эффективное сопряжение ФС 1 с гидрогеназой и высокую скорость образования водорода.

ФС 1 выделяли из цианобактерий Synechocystis sp. РСС 6803 по методу, описанному в: Golbeck J.H. In CRC Handbook of Organic Photochemistry and Photobiology. P.S. Song and W. Horspeels, editors. CRC Press, Bocca Raton, FL, 1995. P1423.19.

Гидрогеназу выделяли из бактерий Thiocapsa roseopersicina штамм BBS по методу, описанному в работе: Зорин Н.А., Пашкова О.Н., Гоготов И.Н. Биохимия. - 1995. Т. 60, №4, с.515-521.

Для совместной иммобилизации ФС 1 и гидрогеназы использовали наноструктурированные мезопористые пленки TiO₂, полученные из нанокристаллов TiO₂ размером от 15 до 25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г на стеклянной подложке. Получение пленок TiO₂ описано в приведенных далее примерах.

Совместную иммобилизацию ФС 1 и гидрогеназы для получения предлагаемого фотобиокатализатора осуществляли путем адсорбции пигмент-белкового комплекса ФС 1 и фермента из водных буферных растворов (0.05 М трис-буфер, рН 8,1, 0.01% додецилмальтозид). Для этого 0.01 мл раствора ФС 1, содержащего 0,04-0,10 нмоль ФС 1, и 0,01 мл раствора гидрогеназы, содержащего 0,2-1,0 нмоль фермента, наносили на поверхность наноструктурированной мезопористой пленки TiO₂, имеющей площадь 1,0±0,1 см², и выдерживали пленку в течение 12 часов в закрытом бюксе при температуре 4°С. Пленку освобождали от слабо связавшихся ФС 1 и гидрогеназы троекратным промыванием в водном буферном растворе. Количество иммобилизованной ФС 1 определяли по убыли оптической плотности при 680 нм раствора ФС 1, инкубированного с пленкой, используя коэффициент экстинкции фотосистемы по хлорофиллу 57000 М^-1·см^-1. Содержание хлорофилла в иммобилизованной ФС 1 определяли путем экстракции ацетоном. Количество иммобилизованной гидрогеназы определяли по уменьшению оптической плотности при 280 нм раствора, инкубированного с пленкой, используя коэффициент экстинкции гидрогеназы ε₂₈₀=115000 М^-1·см^-1. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре СФ-2000. Получали фотобиокатализатор, включающий твердый носитель - наноструктурированную мезопористую пленку TiO₂ - и совместно иммобилизованные на ней фотосенсибилизатор и фермент. Фотобиокатализатор на 1 см² поверхности пленки TiO₂ содержал пигмент-белковый комплекс фотосистемы 1 (ФС 1) в количестве 0,01-0,04 нмоль и гидрогеназу в количестве 0,1-0,5 нмоль.

При осуществлении фотокаталитической реакции получения водорода в качестве органического донора электрона можно использовать 0,1 М дитиотреитол или 0,1 М цистеин в водном буферном растворе 0,05 М Трис, рН 7.2. В качестве переносчика электрона можно использовать метилвиологен (4,4,-диметил-γ,γ,-дипиридил). Метилвиологен способен акцептировать электроны от ФС 1 и выступать в качестве субстрата донора электронов для гидрогеназы. Нормальный окислительно-восстановительный потенциал метилвиологена, составляющий 0,446 В, близок при рН 7,0 нормальному потенциалу водорода. В окисленном состоянии метилвиологен бесцветен, а одноэлектронное восстановление метилвиологена приводит к образованию ион-радикала синего цвета, имеющего максимумы поглощения при 396 нм и 605 нм.

Фотокаталитическую активность предлагаемого фотобиокатализатора оценивали по скорости фотообразования молекулярного водорода. С этой целью фотобиокатализатор - наноструктурированную мезопористую пленку TiO₂ (площадь 1,0±0,1 см²), содержащую ФС 1 и гидрогеназу, - помещали в спектрофотометрическую кювету HELLMA с завинчивающейся крышкой открытого типа (с отверстием по центру) с силиконовой прокладкой. В кювету добавляли 2 мл раствора, содержащего: 0.05 М Трис-буфер, рН 7.2, 0.1 М дитиотреитол и 0,1 мМ метилвиологен. Затем кювету продували в течение 30 мин аргоном. Кювету освещали лампой накаливания 100 Вт через конденсор и граничные светофильтры, выделяющие область 600-750 нм или через граничные светофильтры, выделяющие область 600-750 нм. Фотореакцию проводили при комнатной температуре при перемешивании раствора. Через определенные промежутки времени с помощью газового шприца отбирали пробы 100 мм³ из газовой фазы в кювете и анализировали их с помощью газового хроматографа Chrome 5. В качестве газа-носителя использовали аргон, в качестве наполнителя колонок - молекулярные сита. Восстановленный метилвиологен регистрировали на спектрофотометре СФ-2000 по изменению оптической плотности при 605 нм (ε₆₀₅нм = 13300 М^-1·см^-1).

На рис.1 представлены кинетические кривые фотообразования водорода на красном свету (600-750 нм) наноструктурированными мезопористыми пленками ТiO₂ площадью 1 см², содержащими 0,015 нмоль ФС 1 (4 мкг хлорофилла) и 0,44 нмоль (44 мкг) гидрогеназы. Фотообразование водорода исследовали при различных значениях рН реакционной среды. Максимальное фотообразование водорода наблюдается при нейтральных значениях рН, что определяется зависимостью активности гидрогеназы в реакции выделения водорода от рН, а также влиянием рН на способность дитиотреитола выступать в качестве донора электрона для ФС 1. При щелочных значениях рН гидрогеназа обладает низкой активностью, а дитиотреитол проявляет восстанавливающую активность только при рН более 7 (рК тиоловой группы дитиотреитола лежит между значениями рН от 9,2 до 10,1). Скорость фотообразования водорода в присутствии предлагаемого фотобиокатализатора на красном свету достигает 4,7 мкмоль на мг хлорофилла в час (мг^-1·Хл^-1·ч^-1).

Контрольными экспериментами было показано, что водород не образуется в темноте, а также при освещении, но в отсутствие ФС 1 или гидрогеназы.

Скорость фотовосстановления метилвиологена наноструктурированными мезопористыми пленками ТiO₂, содержащими ФС 1, на красном свету в аналогичных условиях в отсутствие гидрогеназы достигает 9,6 мкмоль мг^-1·Хл^-1·ч^-1. Таким образом, учитывая, что для восстановления метилвиологена необходим один электрон, а для образования водорода два электрона, следует заключить, что гидрогеназа практически полностью использует фотовосстановленный метилвиологен в реакции образования водорода.

При освещении белым светом (λ = 490-750 нм) наблюдается значительное повышение скорости фотообразования водорода в присутствии предлагаемого фотобиокатализатора. При освещении пленок ТiO₂, содержащих 0,015 нмоль ФС 1 и 0,4 нмоль гидрогеназы, белым светом (490-750 нм) регистрировали фотообразование водорода и фотовосстановление метилвиологена (рис.2). Скорость фотообразования водорода увеличивается по мере увеличения концентрации восстановленного метилвиологена, достигая 634,5 мкмоль Н₂ мг^-1·Хл^-1·ч^-1.

В целом процесс фотообразования водорода на предлагаемом фотобиокатализаторе, содержащем пигмент-белковый комплекс фотосистемы 1 и гидрогеназу, можно представить схемой, приведенной на рис.3. В результате связывания ФС 1 и фермента с наноструктурированной мезопористой поверхностью пленки ТiO₂ происходит формирование фотобиокатализатора. При световом возбуждении ФС 1 окисляет донор электрона и восстанавливает переносчик электронов. Гидрогеназа использует восстановленный переносчик электрона в качестве субстрата для восстановления Н⁺ до Н₂ в порах наноструктурированной пленки TiO₂.

Приводим примеры осуществления изобретения.

Пример 1. Получение наноструктурированной мезопористой пленки TiO₂

4.6 мл тетраизопропоксида титана в течение 10 мин по каплям прибавляли к 24 мл водного 0.1 М раствора азотной кислоты при энергичном перемешивании. Полученную суспензию быстро нагревали до 75°С и продолжали нагревание в открытом сосуде при данной температуре до образования практически прозрачного коллоидного раствора. Раствор отфильтровывали через шприц-фильтр (0.2 мкм) в тефлоновый сосуд, который поместили в стальной автоклав и нагревали в муфельной печи при 200°С в течение 12 час. Образовавшуюся пасту концентрировали при помощи центрифуги (2000 об/мин, 5 мин) с последующей декантацией 2/3 маточного раствора. К пасте прибавили ПЭГ 20М в количестве 20% относительно TiO₂. Пасту объемом 1 мл в агатовой ступке последовательно растирали с 0.1 г ПЭГ 20М, а затем с 0.3 г порошка TiO₂ Degussa Р25 до образования гомогенной вязкой эмульсии, содержащей 50% ПЭГ 20М. Полученную пасту наносили методом накатки на обработанные изопропанолом в ультразвуковой бане предметные стекла (Menzel-glaser). Высушенные при комнатной температуре пленки отжигались в муфельной печи при 450°С в течение 0.5 час. Синтезированные пленки TiO₂ имели толщину от 4 мкм до 8 мкм. Удельная поверхность пленки, вычисленная по результатам метода БЭТ составляет 63.1 м²/г. Средний радиус и удельный объем пор равны 11.5 нм и 0.63 см³/г, соответственно.

Пример 2. Получение фотобиокатализатора

На наноструктурированной мезопористой пленке TiO_2, толщиной 6 мкм и площадью 1 см², полученной по примеру 1, совместно иммобилизовывали ФС 1 и гидрогеназу, для чего 0.01 мл раствора ФС 1 в 0.05 М трис-буфере, рН 8.1, содержащего 0,02 нмоль ФС 1 (7.8 мкг хлорофилла) и 0.01% додецилмальтозида, и 0.01 мл раствора гидрогеназы в 0.05 М трис-буфере, рН 8.1, содержащего 0,75 нмоль фермента, наносили на поверхность пленки TiO₂. Пленку выдерживали в течение 12 часов в закрытом бюксе при температуре 4°С и затем освобождали от слабо связавшихся ФС 1 и гидрогеназы троекратным промыванием в водном буферном растворе. Количество иммобилизованной ФС 1 определяли по убыли оптической плотности при 680 нм раствора ФС 1, инкубированного с пленкой, используя коэффициент экстинкции фотосистемы по хлорофиллу 57000 M^-1·см^-1. Содержание хлорофилла в иммобилизованной ФС 1 определяли путем экстракции ацетоном. Количество иммобилизованной гидрогеназы определяли по уменьшению оптической плотности при 280 нм раствора, инкубированного с пленкой, используя коэффициент экстинкции гидрогеназы ε₂₈₀=115000 М^-1·см^-1. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре СФ-2000. Получен фотобиокатализатор, содержащий на 1 см² поверхности пленки TiO₂ пигмент-белковый комплекс фотосистемы 1 (ФС 1) в количестве 0,015 нмоль ФС 1 (4 мкг хлорофилла) и гидрогеназу в количестве 47 мкг (0, 47 нмоль).

Пример 3. Фотообразование водорода при освещении светом с λ = 600-750 нм

Фотобиокатализатор, полученный по примеру 2, помещали в спектрофото-метрическую кювету HELLMA объемом 5 см³ с завинчивающейся крышкой открытого типа (с отверстием по центру) с силиконовой прокладкой. В кювету добавляли 2 мл раствора, содержащего: 0.05 М Трис-буфер, рН 7.2, 0.1 М дитиотреитол и 0,1 мМ метилвиологен. Затем кювету продували в течение 30 мин аргоном. Реакцию проводили при комнатной температуре при перемешивании раствора. Кювету освещали лампой накаливания 100 Вт через конденсор и граничные светофильтры, выделяющие область 600-750 нм. Через определенные промежутки времени с помощью газового шприца отбирали пробы 100 мм³ из газовой фазы в кювете и анализировали их с помощью газового хроматографа Chrom-5. Наблюдаемая удельная фотокаталитическая активность фотобиокатализатора составила 4,5 мкмоль мг^-1·Хл^-1·ч^-1.

Пример 4. Фотообразование водорода при освещении светом с λ = 490-750 нм

Реакцию проводили аналогично примеру 3 за исключением того, что кювету, содержащую фотобиокатализатор, полученный по примеру 2, освещали лампой накаливания 100 Вт через конденсор и граничные светофильтры, выделяющие область 390-750 нм. Наблюдаемая удельная фотокаталитическая активность фотобиокатализатора составила 60 мкл Н₂/см²·час или 634,5 мкмоль Н₂ мг^-1·Хл^-1·ч^-1.

Таким образом, предложен фотобиокатализатор на основе пигмент-белкового комплекса фотосистемы 1 (ФС 1) и гидрогеназы, совместно иммобилизованных на наноструктурированной мезопористой пленке TiO₂, позволяющий с достаточно высокой скоростью получать водород под действием видимого света. Разработан фотокаталитический способ получения водорода. Предложенный способ является высокотехнологичным, так как обеспечивает повышение устойчивости пигмент-белкового комплекса фотосистемы 1 и фермента гидрогеназы, позволяет легко отделять переносчик электрона и продукты окисления донора электрона и обеспечивает возможность многократного использования фотобиокатализатора. Предложенный катализатор может использоваться в различных устройствах для получения водорода под действием солнечного света. Производство устройств на основе ФС 1 и гидрогеназы, использующих энергию солнечного света для получения водорода, может быть высокоэкологичным и низкозатратным, так как ФС 1 и гидрогеназа выделяются из возобновляемых источников - из растений, водорослей, бактерий.