СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологической, комбикормовой и перерабатывающей промышленности и может быть использовано для получения питательных сред для выращивания посевных культур микроорганизмов.

Целлюлозосодержащее сырье имеется практически в неограниченных количествах в виде древесины, соломы, отходов переработки сельхозпродукции. Однако его эффективное превращение в биологически усвояемые сахара является сложной задачей. Проблема использования ресурсов целлюлозосодержащего сырья осложняется тем, что существующие традиционные технологии гидролиза растительного сырья с применением сильных кислот и щелочей связаны с образованием значительного количества побочных продуктов, ингибирующих рост микроорганизмов и биосинтез ими ряда целевых веществ. При этом получаемые в гидролизной промышленности среды содержат не более 2-3% сахаров. Перерабатывать такие среды экономически невыгодно вследствие высоких энергетических и приведенных затрат. Поэтому важнейшей задачей является разработка оптимального способа приготовления питательных сред для выращивания биомассы микроорганизмов на основе гидролизатов целлюлозосодержащего сырья.

Известен способ получения питательного субстрата для производства кормовых дрожжей, включающий гидролиз растительного сырья концентрированной серной кислотой, инверсию, нейтрализацию до рН 4,5-6,0 и отделение лигнина от субстрата, субстрат после отделения от лигнина упаривают в 2-3 раза, осаждают сульфат натрия добавлением спиртовой эфироальдегидной фракции или этилового спирта в количестве 0,8-1,0% к объему субстрата с последующей отгонкой растворителя, при этом нейтрализацию гидролизата до рН 4,5-6,0 осуществляют натронным щелоком, полученным при предварительном щелочном гидролизе растительного сырья при 175-190°С, содержащим органические кислоты и карбонильные соединения (А.с. СССР №973612, C12N 1/22, 1982).

К недостаткам известного способа относится использование в качестве гидролизующих агентов щелочи на первой ступени гидролиза и концентрированной серной кислоты - на второй ступени, что приводит к образованию дополнительных количеств минеральных солей в виде сульфатов при нейтрализации остаточного количества кислоты щелочами. Также к недостаткам данного аналога можно отнести высокие затраты на гидролизующие агенты, большую длительность процесса, сложность аппаратурного оформления, высокую трудоемкость и фондоемкость производства.

Известен способ получения биомассы дрожжей (А.с. СССР №1022987, C12N 1/22, 1983). В известном способе питательную среду получают путем измельчения растительного сырья, его кислотного гидролиза, разделения прогидролизованной массы на гидролизат и лигнин фильтрованием, отстаивания гидролизата и выращивания дрожжей на питательной среде, содержащей гидролизат в качестве источника углерода, источники азота, фосфора и минеральные соли.

К недостаткам известного способа относится необходимость нейтрализации остаточного количества минеральной кислоты щелочами с образованием осадка. Данный недостаток обуславливает сложность аппаратурного оформления, высокую трудоемкость и фондоемкость производства.

При проведении ферментативного гидролиза не возникает необходимость нейтрализации остаточного количества минеральной кислоты.

Известны способы получения питательных сред на основе ферментолизатов растительного сырья. Например, способ получения питательной среды для выращивания дрожжей (патент РФ №2205870, C12N 1/16, 2002), способ получения биомассы дрожжей (патент РФ №2384612, C12N 1/22, 2006).

К недостаткам известных способов относится высокая стоимость используемых ферментных препаратов, многостадийность и большая длительность процессов ферментативного расщепления клетчатки, что делает данные способы дорогими и экономически малоэффективными.

Использование сернистой кислоты в качестве гидролизующего агента позволяет снизить затраты на осуществление процесса гидролиза за счет ее рекуперации и более низкой стоимости кислоты по сравнению с ферментами и большинством других гидролизующих агентов. Кроме того, применение сернистой кислоты по сравнению с другими минеральными кислотами устраняет необходимость нейтрализации избытка кислоты за счет отгонки остаточного сернистого газа после завершения гидролиза.

Известен способ приготовления питательных сред для выращивания чистой культуры дрожжей, в котором измельченную солому гидролизуют в сернистой кислоте при температуре 160°С и концентрации кислоты в гидролизуемой массе 2 масс.%, разделяют гидролизат, осветленный гидролизат смешивают с измельченными отрубями (массовое соотношение отрубей и соломы 1,58:1), приливают сернистую кислоту до достижения ее концентрации в гидролизуемой массе 1-2 масс.% и проводят гидролиз при температуре 160°С, осуществляют отгонку остаточного количества сернистого газа с абсорбцией его водой, полученный гидролизат разделяют, осадок отмывают оборотной водой, промывные воды упаривают, смешивают с осветленным гидролизатом и добавляют минеральные соли (Научно-технический отчет о выполнении НИОКР по теме: «Разработка технологического регламента на выращивание чистой культуры дрожжей», ООО «Биотехконсалдинг», ГК №8187р/7406 от 30.06.2010, инв. №0220.1 159971, Мухачев С.Г., Валеева Р.Т., и др. № Гос. Регистрации 01201061195, Казань, 2011). Данный способ выбран в качестве прототипа.

Недостатками прототипа являются сложность процесса за счет большого числа стадий, выполняемых в различной аппаратуре, и большие энергозатраты за счет потерь тепла при передаче гидролизуемого материала из одного аппарата в другой, дополнительного подогрева для регенерации сернистой кислоты, затрат энергии на упаривание.

Задачей заявляемого технического решения является упрощение процесса получения питательной среды, сокращение энергозатрат.

Поставленная задача решается способом приготовления питательной среды для выращивания дрожжей, в котором смесь измельченных соломы и отрубей, взятых в соотношении 1:(0,5-2) соответственно, гидролизуют сернистой кислотой при концентрации кислоты в гидролизуемой массе 1,0-1,5 масс.% сначала при температуре 120-130°С в течение 60-90 минут, затем при температуре 165-190°С в течение 25-40 минут, отгоняют остаточное количество сернистого газа с абсорбцией его водой, гидролизат разделяют, к осветленному гидролизату добавляют минеральные соли.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является упрощение способа и снижение энергозатрат на его осуществление при сохранении технологических характеристик готового продукта.

Гидролиз смеси соломы и отрубей позволяет сократить аппаратурное оформление процесса за счет сокращения аппаратно разделенных стадий процесса с трех до одной, исключения стадии упаривания. В заявляемом способе две стадии гидролиза осуществляют в одном аппарате без повторной загрузки сырья, при этом добавок гидролизующего агента не требуется. Это приводит к упрощению способа, а также к сокращению продолжительности процесса гидролиза и снижению расхода кислоты.

Суммарный нагрев гидролизуемой массы осуществляют в две стадии, общие энергозатраты снижаются по сравнению с прототипом вследствие того, что в прототипе на первой стадии разделения гидролизата происходит частичное охлаждение осветленного гидролизата (до ~60-70°С), вследствие чего его снова необходимо нагревать до рабочей температуры (160°С). Суммарный перепад температуры при этом составляет ~215°С. В предлагаемом изобретении нагрев гидролизуемой смеси осуществляют от комнатной температуры сначала до 120-130°С, а затем до 165-190°С.

Суммарный перепад температуры составляет в среднем ~155°С. Кроме того, в способе-прототипе тепловая энергия дополнительно расходуется на процесс упаривания. В предлагаемом способе нет стадии упаривания, а тепла, запасенного в гидролизате при проведении гидролиза (165-190^оС), достаточно для полной отгонки летучих компонентов. Таким образом, экономия тепловой энергии по сравнению с прототипом составит не менее 27%.

Проведение гидролиза по заявляемому способу сначала при температуре 120-130°С в течение 60-90 минут достаточно для гидролиза крахмала, содержащегося в отрубях. Гидролиз целлюлозы, содержащейся в соломе, требует повышения температуры гидролиза до 165-190°С. При повышении температуры может происходить разрушение и карамелизация сахаров, полученных при гидролизе крахмала, однако воздействие высокой температуры в предлагаемом способе кратковременно (25-40 минут), при этом разрушение сахаров незначительно, не более чем на 0,1-0,2 масс.%.

Применение более высоких температур гидролиза целлюлозы соломы (165-190°С) позволяет сократить расход сернистой кислоты, так как достаточной является концентрация сернистой кислоты в гидролизуемой массе 1,0-1,5 масс.% (в способе-прототипе температура гидролиза - 160°С, концентрация сернистой кислоты - 2,0 масс.%).

Чем больше в питательной среде аминного азота по отношению к редуцирующим веществам, тем выше выход микробной биомассы в расчете на потребленные редуцирующие вещества. Питательная среда для выращивания микроорганизмов на основе сернистокислотного гидролизата смеси соломы и отрубей содержит дополнительные количества органического азота за счет гидролиза аминокислот, содержащихся в отрубях и соломе. Поскольку в соломе содержание протеинов в 4 раза меньше, чем в отрубях, предлагается использовать состав сред для генерации биомассы сахаромицетов, основанный на гидролизате смеси соломы и отрубей, взятых в массовом соотношении 1:(0,5-2) соответственно, и минеральных солей. Использование меньшего количества отрубей не позволяет получить среду с достаточным содержанием органического (аминного) азота, что приводит к снижению интенсивности роста культивируемых микроорганизмов и уменьшению выхода их биомассы в расчете на потребленное количество редуцирующих веществ. При увеличении доли отрубей в исходной смеси выше 60-70 масс.% стоимость сырья существенно возрастает, что не оправдано при выращивании кормовых и спиртовых дрожжей.

Изобретение поясняется следующими конкретными примерами выполнения способа.

Во всех примерах использовали пшеничные солому и отруби 17% влажности. Навески сырья высушивали до постоянного веса. Массовое соотношение соломы и отрубей варьировали в зависимости от требуемых качественных характеристик готовых питательных сред. Для приготовления питательных сред к осветленным гидролизатам добавляют различные минеральные соли. В конкретных примерах выполнения использовали минеральные соли согласно прописи среды Ридер.

Пример 1.

Навеску 156 г смеси соломы и отрубей, взятых в массовом соотношении 1:1, измельчали, загружали в гидролизер, добавляли 585 г воды и сернистую кислоту концентрации 5,5 масс.% в количестве 275 г (до достижения концентрации кислоты в гидролизуемой массе 1,5 масс.%), гидролизуемую смесь нагревали до 125°С и выдерживали при данной температуре в течение 60 минут. Затем температуру повышали до 180°С и выдерживали при данной температуре 30 минут. При этом по завершении процесса гидролиза остаточное количество сернистого газа отгоняли за счет сброса давления и отвода газопаровой смеси в абсорбер, орошаемый дистиллированной охлажденной водой. Тепла, запасенного в гидролизате, хватает на полный отгон летучих компонентов. Гидролизат разделяли центрифугированием, к осветленному гидролизату добавляли минеральные соли согласно прописи среды Ридер.

Примеры 2-6 аналогичны примеру 1, режимные условия приведены в таблице.

Для оценки качества питательной среды определяли содержание редуцирующих веществ (РВ) и аминного азота в осветленном гидролизате.

Содержание редуцирующих веществ определяли по методу Бертрана (Емельянова И.З. Химико-технологический контроль гидролизных производств / И.З. Емельянова - М: Лесная промышленность, 1976. - 405 с.).

Содержание аминного азота определяли по методу Кьельдаля по ГОСТ 24104-2001. Анализ аминного азота осуществляли на автоматическом анализаторе азота Pro-Nitro А производства фирмы "J.P. Selekta s.a.".

Полученные результаты приведены в таблице.

Анализ табличных данных показывает, что выход редуцирующих веществ от массы исходного сырья в заявляемом способе и в прототипе одинаков и составляет 31 масс.%. При этом экономия энергозатрат на нагрев гидролизуемой массы по сравнению с прототипом составила 27%.

Получаемая по предлагаемому способу питательная среда обогащена азотом за счет гидролиза аминокислот, содержащихся в отрубях и соломе. Варьируя массовое соотношение отрубей и соломы, можно получать питательные среды с различным содержанием азота. Причем, чем большая доля отрубей содержится в гидролизуемой массе сырья, тем больше содержание аминного азота в получаемой питательной среде и, следовательно, выше выход микробной биомассы в расчете на потребленные редуцирующие вещества.

Питательная среда, полученная по заявляемому способу, может быть использована для выращивания посевных культур сахаромицетов, кормовых дрожжей и других аэробных микроорганизмов и их ассоциаций в биореакторах с интенсивным перемешиванием культуральной жидкости при аэрации воздухом, например для выращивания сахаромицетов в производствах топливного этанола и кормовых дрожжей.

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с прототипом позволяет упростить процесс получения питательных сред и сократить энергозатраты как минимум на 27% при сохранении технологических характеристик готового продукта.