ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ МЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГЛАЗ И СПОСОБ ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Изобретение относится к лекарственным средствам для местного применения при лечении воспалительных заболеваний глаз, в частности, к соединениям, предназначенным для применения в фармацевтической промышленности, и касается фармацевтической композиции, содержащей в качестве действующего вещества фермент супероксиддисмутазу, включенную в носитель в виде наночастиц, и целевые добавки.

В изобретении используется следующая, принятая в этой области, терминология, а также сокращения:

Супероксиддисмутаза (СОД, КФ 1.15.1.1) относится к группе антиоксидантных ферментов. Этот фермент состоит из двух субъединиц, содержащих по одному атому цинка и меди, с общей массой 32 кДа. Супероксиддисмутаза катализирует дисмутацию супероксида в кислород и пероксид водорода по следующей реакции:

2O₂ ^-+2H⁺→O₂+H₂O₂

Носитель в виде наночастиц на основе сшитого метокси-поли(этиленгликолъ)-поли(L-лизин) блок-сополимера [Патент US 0291065 A1]. Воспалительные заболевания глаз: К воспалительным заболеваниям глаз относятся кератиты (воспаление роговицы) и увеиты различной этиологии, ретиниты, последствия травм (ожоговых, механических, хирургических), инфекционные процессы.

Антиоксидант. Антиоксиданты - ингибиторы окисления, вещества, способные замедлять окисление. Это группа биологически активных соединений, нейтрализующих в организме свободные радикалы - нестабильные атомы и соединения, которые образуются в ходе нормального обмена веществ и присутствуют в окружающей среде, но, накапливаясь сверх меры, становятся опасными. Антиоксиданты защищают мембраны клеток от вредных эффектов или реакций, которые могут вызвать избыточное окисление в организме.

Инсталляция. Инсталляция - капельное введение растворов лекарственных препаратов.

OS - левый глаз.

OD - правый глаз.

Известно, что в воспалительных заболеваниях глаз значительную роль играют свободно-радикальные процессы, связанные либо с усилением образования свободных радикалов, либо с истощением пула эндогенных антиоксидантов, и окислительный стресс. При этом свободные радикалы повреждают структурные и функциональные клеточные компоненты, способствуют образованию токсических веществ, усугубляют нарушения микроциркуляции в тканях, приводящие к ишемизации тканей, [Carubelli R., Nodrquist R.E., Rowsey J.J. Role of active oxygen species in comeal ulceration. Effect of hydrogen peroxide generated in situ. (1990) Cornea, 9, 161-169. Yadav U.C.S., Kalariya N.M., Ramana K.V. Emerging role of antioxidants in the protection of uveitis complications. (2011) Curr. Med. Chem., 18, 931-942]. К воспалительным заболеваниям относятся кератиты (воспаление роговицы) и увеиты различной этиологии, ретиниты, последствия травм (ожоговых, механических, хирургических), инфекционные процессы. В комплексном медикаментозном лечении воспалительных заболеваний глаз используют неспецифичные противовоспалительные препараты (антибиотики и кортикостероиды), антипротеолитические препараты, антиоксиданты, антигипоксанты, средства, оказывающие регенеративное действие и улучшающие микроциркуляцию [Рациональная фармакотерапия в офтальмологии (2006) (под ред. Е.А. Егорова), Изд-во Литтерра, Москва, с.652-657. Морозов В.И., Яковлев А.А. (2009) Фармакотерапия глазных болезней, Изд-во МЕДпресс-информ, Москва, с.169-179].

В качестве антиоксидантных средств, применяемых при воспалительных процессах в глазу, используют препараты эмоксипина, пиридоксина [Архипова Л.Т., Долгова И.Г. Прогностическая значимость местных и системных показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при проникающих ранениях глаз и их динамика на фоне местного применения антиоксидантов. (2001) Вести, офтальм. №5, 37-40], эхинохрома («Гистохром») [Патент RU 2038088 C1].

Отмечалась перспективность применения препаратов супероксиддисмутазы при увейте [de Kozak Y., Nordman J.P., Faure J.P., Rao N.A., Marak G.E. Effect of antioxidanr enzymes on experimental uveitis in rats. (1989) Ophtalmic. Res., 21, 230-234. Yamada M., Shichi H., Yuasa Т., Tanouchi Y., Mimura Y. Superoxide in ocular inflammation: human and experimental uveitis. (1986) J. Free Radio. Biol. Med., 2, 111-117], а также при повреждении глаза щелочью [Alio J.L., Ayala M.J., Mulet M.E., Artola A., Ruiz J.M., Bellot J. Antioxidant therapy in the treatment of experimental acute comeal inflammation. (1995) Ophtalmic. Res., 27, 136-143].

Недостатком выпускаемых препаратов является недостаточное проникновение лекарственных соединений внутрь тканей глаза, поскольку им необходимо преодолевать барьер в виде роговицы, которая состоит из трех слоев: эпителиального, стромы и эндотелиального. Кроме того, лекарственный препарат легко смывается слезой с поверхности глаза. Обычно только около 5% применяемого вещества проникает через роговую оболочку и достигает внутриглазных тканей [Ahmad I., Patton T. Importance of the noncomeal absorption route in topical ophthalmic drug delivery. (1985) Invest. Ophtalm. Vis. Sci., 26, 584-587].

Эту проблему, как правило, решают увеличением концентрации лекарственной субстанции в препарате. Однако увеличение содержания действующего соединения может вызывать аллергические реакции, а также нежелательные местные и системные побочные эффекты, связанные с попаданием этих препаратов в кровоток.

Перспективным подходом к решению проблемы доставки лекарственного препарата к внутриглазным тканям является использование наночастиц в качестве систем доставки лекарственной субстанции, так как они значительно увеличивают биодоступность лекарства и позволяют создавать в тканях необходимые концентрации лекарственного вещества [Sahoo S.K., Dilnawaz F., Krishnakumar S. Nanotechnology in ocular dmg delivery (2008) Drug Discov. Today, 13, 144-151. Araujo J., Gonzalez E., Egea M.A., Garcia M.L., Souto E.B. Nanomedicines for ocular NSAIDs: safety on drug delivery (2009) Nanomedicine, 5, 394-401]. Получены положительные результаты экспериментальных исследований по включению в наноносители ряда лекарственных препаратов, таких как стероиды [Gomez-Gaete С., Tsapis N., Besnard M., Bochot A., Fattal E. Encapsulation of dexamethasone into biodegradable polymeric nanoparticles (2007) Int. J. Phar., 331, 153-159], ингибитор карбоангидразы [Zhang X., Yaun W., Zhau D., Wu J. Lyceum Chinense and calcium phosphate nanoparticles for ophthalmic drug delivery (2008) Nanotech., 2, 401-404], циклоспорин A [Patent US 0020336 A1].

Однако в настоящее время фармацевтических препаратов в составе наночастиц для местного нанесения при воспалительных заболеваниях глаз не имеется. Местное же применение лекарств является наиболее предпочтительным для пациентов, т.к. они могут их самостоятельно использовать.

В настоящее время в нашей стране выпускаются препараты Эрисод [Патент RU 2144343 C1] и «Рексод» [«Рексод», инструкция по применению, регистрационное удостоверение ЛСР-006689/10-150710], действующим началом которых является супероксиддисмутаза. Препараты применяются, в том числе, путем закапывания в конъюнктивальные полости глаз.

Показаниями к применению указанных препаратов являются открытоугольная глаукома, передний увеит, вторичные кератопатии, герпетическое и аденовирусное поражения глаз, травмы и ожоги глаз. Средство Эрисод выбрано нами в качестве прототипа заявленной группы изобретений. Этому средству при лечении воспалений присущи все вышеотмеченные недостатки в виде невозможности создания требуемой концентрации действующего вещества в тканях глаза.

Нами было установлено, что фермент супероксиддисмутаза, включенная в состав наночастиц, обеспечивает устранение отмеченных недостатков.

Подобные препараты, представляющие собой комплексы ферментов с синтетическими полимерами, имеющие размеры наночастиц, предложены для доставки терапевтических агентов, прежде всего, при терапии заболеваний центральной нервной системы [Patent US 0291065 A1]. Мы использовали для экспериментального изучения водные растворы препарата, содержащего супероксиддисмутазу, включенную в состав наночастиц на основе сшитого метокси-поли(этиленгликоль)-поли(L-лизин) блок-сополимера, полученных по методу [Patent US 0291065 A1], и целевые добавки.

Техническим результатом заявленной фармацевтической композиции для местного применения при лечении воспалительных заболеваниях глаз и способа ее использования является усиление противовоспалительного лечебного эффекта супероксиддисмутазы, что выражается в уменьшении времени заживления воспаления, пролонгация эффекта снижения проявлений воспалительного процесса с уменьшением риска местных и общих побочных реакций. Показано, что применение заявленной фармацевтической композиции приводит к значительному сокращению времени отека роговицы, к уменьшению гиперемии конъюнктивы, уменьшению отека век, уменьшению фибринозных отложений при экспериментальном увейте, а также к повышению антиоксидантной активности в слезной жидкости при щелочном ожоге роговицы экспериментальных животных.

Этот технический результат в части фармацевтическая композиция достигается тем, что фармацевтическая композиция для местного применения при воспалительных заболеваниях глаз содержит эффективное количество действующего вещества, представляющего собой супероксидисмутазу, включенную в наночастицы на основе сшитого метокси-поли(этиленгликоль)-поли(L-лизин) блок-сополимера, и целевые добавки.

Предпочтительно, чтобы в фармацевтической композиции эффективная противовоспалительная концентрация супероксиддисмутазы составляла 50-500 кЕд/мл.

Предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция была выполнена в форме глазных капель или спрея.

Предпочтительно, чтобы в фармацевтической композиции в качестве целевых добавок использовали или буферный агент и/или 0,15 М хлористый натрий.

Предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция содержала консервант.

Предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция дополнительно содержала препараты, выбранные из групп: или антибиотики, или стероиды, или адреноблокаторы, или витамины, или макро- и микроэлементы.

Этот технический результат в части способ лечения воспалительных заболеваний глаза достигается тем, что производят инстилляции в конъюнктивальную полость глаза фармацевтической композиции по п.1-7, содержащей эффективное количество супероксиддисмутазы в дозе от 1,5 до 15 кЕд ежедневно 2-3 раза в день, длительностью от 1 недели до момента завершения воспалительного процесса.

Изобретение поясняется фиг.1., на которой продемонстрировано влияние супероксиддисмутазы и заявленной фармацевтической композиции на антиокислительную активность в слезной жидкости кроликов после щелочного ожога роговицы. Антиокислительная активность в процентах от исходной в слезной жидкости: о - кролика №16 (нелеченый); ■ - кролика №17 (лечение заявленной фармкомпозицией); ♦ - кролика №18 (лечение супероксиддисмутазой).

Фармацевтическая композиция для местного применения при воспалительных заболеваниях глаз поясняется следующими примерами.

Пример 1

Приготовление фармацевтической композиции по изобретению

Фармацевтическая композиция содержит в качестве действующего вещества эффективное количество супероксиддисмутазы, включенной в наночастицы на основе сшитого метокси-поли(этиленгликоль)-поли(L-лизин) блок-сополимера по методу [Patent US 0291065 A1]. Полученные наночастицы имеют белый цвет и представляют собой лиофильно высушенный порошок. В зависимости от условий лиофилизации вещество в дальнейшем может быть растворено в воде или в водных буферных растворах или в изотонической смеси, которые могут также содержать консервант.

Глазные капли получали следующим образом. В химически чистый стерильный стакан помещали навеску 10 мг действующего вещества, вносили 3,2 мл деионизованной воды. Перемешивали на магнитной мешалке до полного растворения. Раствор имел бесцветную окраску. Затем проводили стерильную фильтрацию раствора через фильтры «Millipore» 0,22 мкм. Эффективная противовоспалительная концентрация супероксиддисмутазы составила 500 кЕд/мл.

Соответствие состава проверяли по:

1. Активности супероксиддисмутазы, определяемой по методу [Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина. (1990) Вопр. Мед. Химии, 36, №2, 88-91]. Метод основан на определении степени торможения реакции окисления кверцетина в присутствии супероксиддисмутазы. За единицу активности супероксиддисмутазы принимали такое количество фермента в 1 мл реакционной смеси, которое вызывает ингибирование реакции окисления кверцетина на 50%.

2. Значению pH раствора (7,5), которое проверяли с использованием pH-метра.

3. Электрофоретической подвижности препарата в условиях неденатурирующего электрофореза в 10% полиакриламидном геле в по методу [Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of Bacteriophage T4. (1970) Nature, 227, 680-685]. Для окрашивания белков использовали Кумасси бриллиантовый синий R-250.

Пример 2

Средство готовили так, как указано в примере 1, но навеску действующего вещества, равную 5 мг, растворяли в 3,2 мл раствора 0,15 М NaCl в деионизованной воде, содержащего 0,3 мг/мл бензалконий хлорида. Эффективная противовоспалительная концентрация супероксиддисмутазы составила 250 кЕд/мл.

Пример 3

Средство готовили так, как указано в примере 1, но навеску действующего вещества, равную 1 мг, растворяли в 3,2 мл 0,05 М Hepes-буфера, pH 7,5. Эффективная противовоспалительная концентрация супероксиддисмутазы составила 50 кЕд/мл.

Пример 4

Средство готовили так, как указано в примере 1, но навеску действующего вещества, равную 1 мг, растворяли в 3,2 мл 0,05 М фосфатного буфера, pH 7,5, содержащего 0,15 М NaCl и 1 мг/мл бензалконий хлорид. Эффективная противовоспалительная концентрация супероксиддисмутазы составила 50 кЕд/мл.

Исследование противовоспалительной активности заявленной фармацевтической композиции и осуществление способа

Моделирование экспериментального иммуногенного увеита у кроликов.

В эксперименте были задействованы кролики породы шиншилла массой 2-2,5 кг. Работа с экспериментальными животными проводилась в соответствии с положениями Хельсинской декларации. Животные находились в стандартных условиях содержания. У животных воспроизводили иммуногенный увеит по методике [Нероев В.В., Давыдова Г.А., Перова Т.С. Моделирование иммуногенного увеита у кроликов. (2006) Бюлл. Эксперимент. Биол. Мед., 142, 598-600]. Каждому кролику в примерах 5-16 для воспроизведения иммуногенного увеита вводили нормальную лошадиную сыворотку подкожно в количестве 5 мл, затем на 10 сутки после подкожной инъекции в оба глаза интравитреально вводили разрешающую дозу сыворотки в количестве 70 мкл.

Клинические признаки внутриглазного воспаления оценивали путем последовательного анализа данных наружного осмотра глаза, биомикроскопии, офтальмоскопии.

Оценку клинических проявлений увеита (отек конъюнктивы, гиперемия конъюнктивы, отек роговицы, фибринозные отложения в передней камере) проводили в условных баллах по четырехбалльной шкале: отсутствие признака - 0, проявления слабой степени - 1, средней - 2, сильной - 3.

Пример 5

Кролик №12. Кролику с иммуногенным увеитом проводили инстилляции плацебо (0,05 М фосфатный буфер, рН 7,5, содержащий 0,15 М NaCl) в оба глаза (OS и OD) 3 раза в день по 30 мкл.

Оценку клинического проявления увеита - отека роговицы - проводили в условных баллах по четырехбалльной шкале: отсутствие признака - 0, проявления слабой степени - 1, средней - 2, сильной - 3.

Инстилляции буферного раствора в оба глаза кролика №12 не приводили к уменьшению отека роговицы. Отек прогрессировал, роговица становилась более мутной.

Пример 6

Кролик №3. Проводили инстилляции раствора супероксиддисмутазы в концентрации 50 кЕд/мл в 0,15 М растворе NaCl, рН 7,5, в оба глаза 3 раза в день по 30 мкл.

Определяли степень отека роговицы как в примере 5.

У кролика №3 инстилляции раствора супероксиддисмутазы приводили к снижению отека роговицы, который практически спадал к 8-му дню.

Пример 7

Кролик №7. Проводили инсталляции раствора заявленной фармацевтической композиции в концентрации 1 мг/мл (50 кЕд/мл) в 0,05 М Hepes-буфере, рН 7,5, в оба глаза 3 раза в день по 30 мкл.

Определяли степень отека роговицы как в примере 5.

У кролика №7 инсталляции раствора заявленной фармацевтической композиции приводили к тому, что отек роговицы практически не наблюдался и окончательно исчезал уже на 5-й день.

Пример 8

Кролик №10. Проводили инсталляции плацебо (0,05 М фосфатный буфер, рН 7,5, содержащий 0,15 М NaCl) в оба глаза (OS и OD) 3 раза в день по 30 мкл.

Оценку клинического проявления увеита - гиперемии конъюнктивы - проводили в условных баллах по четырехбалльной шкале: отсутствие признака - 0, проявления слабой степени - 1, средней - 2, сильной - 3.

Инсталляции плацебо в оба глаза кролика №10 не приводила к уменьшению гиперемии конъюнктивы. Гиперемия была ярко выражена и лишь незначительно снижалась к 8-му дню.

Пример 9

Кролик №1. Проводили инстилляции супероксиддисмутазы в концентрации 250 кЕд/мл в 0,15 М растворе NaCl, pH 7,5, в оба глаза 3 раза в день по 30 мкл.

Определяли степень гиперемии конъюнктивы как в примере 8.

Инстилляции раствора супероксиддисмутазы в оба глаза кролика №1 приводили к снижению выраженности гиперемии конъюнктивы. На 8-й день гиперемия не наблюдалась.

Пример 10

Кролик №5. Проводили инстилляции раствора заявленной фармацевтической композиции в концентрации 5 мг/мл (250 кЕд/мл) в 0,15 М растворе NaCl, pH 7,5, содержащем 0,3 мг/мл бензалконий хлорида, в оба глаза 3 раза в день по 30 мкл.

Определяли степень гиперемии конъюнктивы как в примере 8.

Инстилляции заявленной фармацевтической композиции в оба глаза кролика №5 приводили к более выраженному снижению степени гиперемии конъюнктивы, чем в примере 9.

Пример 11

Кролик №11. Проводили инстилляции плацебо (0,05 М фосфатный буфер, рН 7,5, содержащий 0,15 М NaCl) в оба глаза (OS и OD) 3 раза в день по 30 мкл.

Оценку клинического проявления увеита - отек век - проводили в условных баллах по четырехбалльной шкале: отсутствие признака - 0, проявления слабой степени - 1, средней - 2, сильной - 3.

Инстилляции плацебо в оба глаза у кролика №11 не приводили к уменьшению отека век. На протяжении всего эксперимента этот клинический признак был ярко выражен.

Пример 12

Кролик №2. Проводили инстилляции супероксиддисмутазы в концентрации 500 кЕд/мл в 0,15 М растворе NaCl, рН 7,5, в оба глаза (OS и OD) 3 раза в день по 30 мкл.

Определяли степень отека век как в примере 11.

Инстилляции раствора супероксиддисмутазы в оба глаза кролика №2 приводили к снижению отека век, который исчезал к 5-му дню.

Пример 13

Кролик №8. Проводили инстилляции раствора заявленной фармацевтической композиции в концентрации 10 мг/мл (500 кЕд/мл) в воде, рН 7,5, в оба глаза 3 раза в день по 30 мкл.

Определяли степень отека век как в примере 11.

Инстилляции заявленной фармацевтической композиции в оба глаза кролика №8 приводили к более выраженному и раннему снижению отека век, чем в примере 12.

Пример 14

Кролик №9. Проводили инстилляции плацебо (0,05 М фосфатный буфер, рН 7,5, содержащий 0,15 М NaCl) в оба глаза (OS и OD) 3 раза в день по 30 мкл. Оценку клинического проявления увеита - фибринозные отложения - проводили в условных баллах по четырехбалльной шкале: отсутствие признака - 0, проявления слабой степени - 1, средней - 2, сильной - 3.

Инстилляции плацебо в оба глаза кролика №9 не приводила к уменьшению количества фибринозных отложений. На протяжении всего эксперимента во влаге передней камеры в большом количестве обнаруживался фибрин.

Пример 15

Кролик №4. Проводили инстилляции супероксиддисмутазы в концентрации 250 кЕд/мл в 0,15 М растворе NaCl, pH 7,5, в оба глаза (OS и OD) 3 раза в день по 30 мкл.

Определяли степень фибринозных отложений как в примере 14.

Инстилляции раствора супероксиддисмутазы в оба глаза кролика №4 инстилляции приводили к снижению фибринозных отложений, чем у кролика, получавшего плацебо (пример 14).

Пример 16

Кролик №6. Проводили инстилляции раствора заявленной фармацевтической композиции в концентрации 5 мг/мл (250 кЕд/мл) в 0,05 М фосфатном буфере, pH 7,5, содержащем 0,15 М NaCl и 1 мг/мл бензалконий хлорида, в оба глаза 3 раза в день по 30 мкл.

Определяли степень фибринозных отложений как в примере 14.

Инстилляции заявленной фармацевтической композиции в оба глаза кролика №6 приводили к тому, что воспалительные проявления во внутренних структурах глаза - фибринозные отложения - были менее выражены, чем у кролика, получавшего супероксиддисмутазу (пример №15).

Исследование влияния супероксиддисмутазы и заявленной фармацевтической композиции на антиокислительную активность в слезной жидкости кроликов с щелочным ожогом роговицы.

Моделирование ожога центральной части роговицы.

При моделировании дозированного по площади и глубине щелочного ожога роговицы использовали круги d=7 мм из тонкой хлопчатобумажной ткани, пропитанные 10% раствором NaOH, которые наносили на центральную область роговицы на 40 секунд, затем промывали глаза физиологическим раствором порциями по 20 мл. Для обезболивания использовали 2,5% раствор аминазина в сочетании с 0,5% раствором седуксена (1:1), который вводили подкожно (0,5 мл/кг веса). Одновременно проводили местную анестезию путем инстилляции на роговицу 0,5% раствора дикаина.

Слезную жидкость брали у животных до и в определенные дни после ожога с помощью кружков фильтровальной бумаги, которые помещали в нижний свод конъюнктивального мешка на 5 мин. Компоненты слезы элюировали физиологическим раствором (1 кружок - 50 мкл). Элюат центрифугировали и надосадочную жидкость использовали для исследования.

Антиокислительную активность в слезе определяли хемилюминесцентным методом в модельной системе гемоглобин - перекись водорода - люминол, в которой в качестве субстрата окисления выступает люминол. Величину антиокислительной активности выражали в эквивалентах тролокса, для чего строили калибровочную кривую зависимости латентного периода хемилюминесценции от концентрации тролокса по [Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты. (1998) Вести. РАМП, №7, 43-51]. Статистическую обработку результатов производили с помощью U-критерия Манна-Уитни.

Пример 17.

Кролик №16 получал инстилляции плацебо (0,05 М фосфатный буфер, рН 7,5, содержащий 0,15 М NaCl).

Кролик №18 получал инстилляции раствора супероксиддисмутазы в концентрации 50 кЕд/мл в 0,15 М раствор NaCl, рН 7,5.

Кролик №17 получал инстилляции заявленной фармацевтической композиции в концентрации 50 кЕд/мл в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 0,15 М NaCl и 1 мг/мл бензалконий хлорида.

Полученные результаты отражены на фиг.1.

После ожога роговицы в период 7-14 суток достоверно падает антиокислительная активность, определяемая в слезной жидкости. У кролика, леченного супероксиддисмутазой, антиокислительная активность не только не снижалась, но даже достоверно превышала значения нормы. Уровень антиокислительной активности слезы при лечении заявленной фармацевтической композицией был выше, чем при лечении супероксиддисмутазой.

Таким образом, приведенные примеры свидетельствуют, что внедрение супероксиддисмутазы в наночастицы и местное применение заявленной фармацевтической композиции усиливает и пролонгирует положительное действие фермента на течение воспалительного процесса в глазу, а также более эффективно снижает количество свободных радикалов при воспалении.

Учитывая, что физиологические особенности глаза кролика и человека идентичны, данная фармацевтическая композиция может быть рекомендована к использованию как в ветеринарии, так и в клинике.