Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЧИСТКИ ЗЕМЛИ ОТ ЗАГРЯЗНЕНИЙ НЕФТЕПРОДУКТАМИ

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологическим способам очистки окружающей среды, и может применяться для очистки земли от загрязнений нефтепродуктами с использованием консорциума штаммов микроорганизмов.

Для процессов очистки почвы от нефтезагрязнений используют различные микроорганизмы (бактерии, грибы, дрожжи) по отдельности или их комбинации друг с другом:

- штаммы Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 327 (патент РФ №2180276, B09C 1/10, 10.03.2002);

- штамм Fusarium sp.N 56 (патент РФ №2126041, C12N 1/14, 10.02.1999);

- штамм Pseudomonas putida 9 (патент РФ №2134722, C12N 1/20, 20.08.1999).

Известные микроорганизмы отличаются по скорости утилизации нефтепродуктов и по условиям применения, обеспечивающим их наибольшую эффективность (температуре, pH, источникам фосфора и азота).

Однако более высокой эффективностью и устойчивостью в природной экосистеме обладают биопрепараты па основе консорциумов из различных видов микроорганизмов:

- консорциум штаммов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ky-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 (патент РФ №2191643, B09C 1/10, 27.10.2002);

- консорциум штаммов Rhodocuccus sp.367-2 или Rhodococcus maris 367-5 или Rhodococcus eruythropolis 367-6, штамм Pseudomonas stutzeri 367-1 и штамм Yarrowia lipolytica 367-3 (патент РФ №2104249, C02F 3/34, 10.02.1998);

- консорциум штаммов Rhodococcus sp., Rhodococcus maris, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas stutzeri, Candida sp. (патент РФ №2023686, C02F 3/34, 30.11.1994).

Кроме того, очистка грунта и загрязненных поверхностей может производиться моющими растворами на основе поверхностно-активных веществ (ПАВ):

- смесью неионо- и ионогенного ПАВ при соотношении (2-8):1 соответственно (патент РФ №2169175, C11D 1/83, 20.06.2001);

- композицией, содержащей 85% алкилового эфира жирной кислоты, ПАВ и кислоту, при этом концентрация ПАВ составляет приблизительно от 0,1 до 10% (патент РФ №2305121, C09K 8/524, 27.08.2007).

Наиболее приемлемым ПАВ для очистки грунта от нефтезагрязнений является синтанол, представляющий собой смесь полиэтиленгликолевых эфиров и синтетических первичных спиртов, поскольку обладает высокой биоразлагаемостью (патент РФ №2412985, C11D 1/02, 27.02.2011).

Однако высокие эксплуатационные затраты при очистке грунта моющими растворами и проблема утилизации отработанного моющего раствора, содержащего большое количество нефтепродуктов, делают этот метод малопривлекательным для широкого применения, несмотря на значительно меньшее затрачиваемое время по сравнению с очисткой биопрепаратами.

Наиболее близким аналогом к предлагаемому способу (прототипом) является способ очистки почвы от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (патент РФ №2191643, B09C 1/10, 27.10.2002), предусматривающий введение в загрязненную среду суспензии биопрепарата, содержащего нефтеокисляющие бактерии. Водную суспензию биопрепарата готовят в концентрации 0,5-10,0 г/л с титром 1·10⁸-1·10¹² кл/мл, после чего активируют нефтеокисляющие микроорганизмы путем барботирования водной суспензии биопрепарата воздухом с расходом 3-5 м³ на 1 м³ суспензии в течение 1,5-2,5 ч. В качестве биопрепарата используют консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ky-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении от 3-12 мас.% каждого микроорганизма, при этом совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин в количестве 30-120 г/м. Эффективность очистки в указанном способе составляет 82% - 90% за три месяца при дневной температуре от 12°C до 24°C. Недостатком данного способа является невысокая эффективность очистки, обусловленная низкой скоростью окисления углеводородов нефти и, как следствие, невозможность проведения очистки за один летний сезон. Кроме того, использование штамма почвенных бактерий Pseudomonas putida и Pseudomonas fluorescens для утилизации нефти малоэффективно, т.к. эти виды бактерий слабо утилизируют углеводороды, а в основном они используются для гумусообразования и обеспечения защитных функций растений. Продукты жизнедеятельности указанных бактерий - сидерофоры, антибиотические вещества и ауксино-гибберрелиноподобные вещества, стимулирующие корнеобразование и рост растений.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является разработка способа очистки земли от загрязнений нефтепродуктами с использованием консорциума микроорганизмов (коммерческое название биопрепарата - «Ромигер»), обеспечивающего высокую скорость утилизации углеводородов нефти.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является повышение эффективности очистки земли от загрязнений нефтепродуктами.

Для достижения указанного технического результата в предлагаемом способе вводят в загрязненную среду консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов с одновременным внесением минеральной питательной среды. В качестве нефтеокисляющих микроорганизмов используют штамм бактерий Rhodococcus qingchengii ВКПМ AC-1877, штамм бактерий Rhodococcus erythopolis ВКПМ AC-1878 и штамм дрожжей Rhodotorula mucilaginosa ВКПМ Y-3604. Консорциум нефтеокисляющих организмов вносят в загрязненную среду в количестве 0,2%÷0,5% от массы загрязнителя. При этом совместно с нефтеокисляющими микроорганизмами в загрязненную среду вводят поверхностно-активное вещество в количестве 0,2%÷0,5% от массы загрязнителя.

Штаммы, используемые в предлагаемом способе, получены селекционным путем из образцов проб грунта с Бованенковского нефте-газоконденсатного месторождения п/о Ямал.

Штамм бактерий Rhodococcus qingchengii ВКПМ АС-1877.

Способ размножения штамма - ферментация. Оптимальный состав минеральной среды для размножения штамма: KNO₃ - 4,0 г/л, KH₂PO₄ - 0,4 г/л, Na₂HPO₄·12H₂O - 1,4 г/л, MgSO₄ - 0,8 г/л, FeSO₄·7H₂O - 0,045 г/л, ZnSO₄·7H₂O - 0,031 г/л, MnSO₄·7H₂O - 0,031 г/л, CuSO₄ - 0,004 г/л при pH 7,0-7,2. В качестве источника углерода использовали жидкий парафин фракции C₁₃-C₁₇. Культивирование проводили в ферментере объемом 40 л в накопительном режиме при скорости вращения лопастной мешалки 600 об/мин, подаче воздуха 3,5 м³/ч и температуре 32°C-34°C.

Морфологические особенности штамма оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Клетки данного штамма - палочки, кокки, на твердой среде колонии белесого цвета, матовые, с мелкозернистой поверхностью.

Штамм непатогенный и нетоксичный. Культура хранится в пробирках на скошенном L-агаре при температуре 15°C÷20°C. Жизнеспособность штамма поддерживается регулярным пересевом (2-3 раза в год) на среде L-агара и на жидкой минеральной среде, содержащей азот, фосфор, калий, магний, микроэлементы, с н-парафинами в качестве единственного источника углерода и энергии.

Штамм бактерий Rhodococcus erythopolis ВКПМ AC-1878.

Способ размножения штамма - ферментация. Оптимальный состав минеральной среды для размножения штамма: KNO₃ - 4,0 г/л, KH₃PO₄ - 0,4 г/л, Na₂HPO₄·12H₂O - 1,4 г/л, MgSO₄ - 0,8 г/л, FeSO₄·7H₂O - 0,045 г/л, ZnSO₄·7H₂O - 0,031 г/л, MnSO₄·7H₂O - 0,031 г/л, CuSO₄ - 0,004 г/л при pH 7,0-7,2. В качестве источника углерода использовали жидкий парафин фракции C₁₃-C₁₇. Культивирование проводили в ферментере объемом 40 л в накопительном режиме при скорости вращения лопастной мешалки 600 об/мин, подаче воздуха 3,5 м³/ч и температуре 32°C÷34°C.

Морфологические особенности штамма оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Клетки крупные, овальной формы, на твердой среде колонии розового цвета, с матовой ровной поверхностью.

Штамм непатогенный и нетоксичный. Культура хранится в пробирках на скошенном L-агаре при температуре 15°C÷20°C. Жизнеспособность штамма поддерживается регулярным пересевом (2-3 раза в год) на L-агар и на жидкую минеральную среду, содержащую азот, фосфор, калий, магний, микроэлементы, с н-парафинами в качестве единственного источника углерода и энергии.

Штамм дрожжей Rhodotorula mucilaginosa ВКПМ Y-3604.

Способ размножения штамма - ферментация. Оптимальный состав минеральной среды для размножения штамма: H₃PO₄ (70%) - 2,6 г/л, KCl - 1,14 г/л, MgSO₄ - 0,55 г/л, FeSO₄·7H₂O - 0,045 г/л, ZnSO₄·7H₂O - 0,031 г/л, MnSO₄·7Н₂O - 0,031 г/л, CuSO₄ - 0,004 г/л при pH 4,0-4,2. В качестве источника углерода использовали жидкий парафин фракции C₁₃-C₁₇. Культивирование проводили в ферментере объемом 40 л в накопительном режиме при скорости вращения лопастной мешалки 600 об/мин, подаче воздуха 3,5 м³/ч и температуре 32°C÷34°C.

Морфологические особенности штамма оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Клетки палочковидной формы, на твердой среде колонии розового цвета, матовые, с ровной поверхностью.

Штамм непатогенный и нетоксичный. Культура хранится в пробирках на скошенном агаризованном сусле при температуре 15°C÷20°C. Жизнеспособность штамма поддерживается регулярным пересевом (2-3 раза в год) на агаризованное сусло и на жидкую минеральную среду, содержащую азот, фосфор, калий, магний, микроэлементы, с н-парафинами в качестве единственного источника углерода и энергии.

Внесение ПАВ в загрязненную среду способствует разрушению пленки жидких углеводородов и водонефтяной эмульсии на тонкодисперсные частицы. Полученные диспергированные жидкие углеводороды значительно лучше окисляются микробиологическим путем.

Способ осуществляют следующим образом.

Культуры бактериальных штаммов Rhodococcus qingchengii ВКПМ АС-1877 и Rhodococcus erythopolis ВКПМ AC-1878, входящие в состав консорциума микроорганизмов, выращивают совместно на жидкой питательной среде. При необходимости полученную биомассу сгущают, например, на центрифуге и высушивают на лиофильной сушилке для получения порошковой формы биопрепарата. Аналогично получают порошковую форму дрожжевого штамма Rhodotorula mucilaginosa ВКПМ Y-3604. Далее составляют консорциум из указанных штаммов, взятых в соотношении бактерии: дрожжи, как 2:1. Определяют количество нефтепродуктов в очищаемой среде. Рассчитывают необходимое количество биопрепарата в зависимости от вида загрязнения: для светлых углеводородов нефти 0,2%, для темных - 0,5% от массы загрязнителя соответственно. Далее рассчитывают необходимое количество ПАВ, в частности синтанола, в зависимости от условий загрязнения: для очистки от светлых углеводородов нефти 0,2%, для темных - 0,5% от массы загрязнителя. Перед внесением в загрязненную среду необходимое количество порошковой формы биопрепарата разводят водным раствором минеральной питательной среды, включающей азот, фосфор, калий, магний и микроэлементы, после чего перемешивают полученный раствор при постоянной аэрации в течение 3 ч÷4 ч для активизации микроорганизмов. За 2-3 мин до окончания перемешивания прекращают аэрацию и вносят необходимое количество ПАВ. Затем раствор, содержащий суспензию биопрепарата и ПАВ, вносят в загрязненную среду и равномерно перемешивают.

Ниже приводятся примеры, подтверждающие высокую эффективность предлагаемого способа.

Пример 1. Осуществляли очистку земли от дизельного топлива. В прямоугольный контейнер объемом 15 дм³ вносили 10 кг сухой песчаной почвы. Дизельное топливо в количестве 0,5 кг наносили на почву тонкодисперсным слоем с постоянным перемешиванием (начальная концентрация нефтепродуктов таким образом составляла 5%). После чего 1 г сухого биопрепарата растворяли в 2 л водного раствора минеральной питательной среды (состав: KNO₃ - 4,0 г/л, KH₂PO₄ - 0,4 г/л, Na₂HPO₄·12Н₂O - 1,4 г/л, MgSO₄ - 0,8 г/л, FeSO₄·7H₂O - 0,045 г/л, ZnSO₄·7H₂O - 0,031 г/л, MnSO₄·7H₂O - 0,031 г/л, CuSO₄ - 0,004 г/л,) в аппарате с мешалкой и барботером. Осуществляли аэрацию и перемешивание в течение 4 ч. За 2 мин до окончания перемешивания отключали подачу воздуха и добавляли в суспензию 1 г синтанола АЛМ-10 (ТУ 2483-003-71150986-2006). Полученный раствор при перемешивании вносили в загрязненную почву. Влажность почвы поддерживали периодическим орошением на уровне 60% от полной влагоемкости почвы. Аэрацию осуществляли путем периодического перемешивания почвы, при этом температура почвы составляла 18°C÷20°C. Отбор проб осуществляли один раз в пять дней. Содержание нефтепродуктов в почве определяли методом ИК-спектрометрии. В результате за 60 дней проведения очистки концентрация нефтепродуктов в почве снизилась с 5% до 0,42%, т.е. степень очистки составила 91,6%.

Пример 2. Осуществляли очистку почвы от мазута. В прямоугольный контейнер объемом 15 дм³ вносили 10 кг сухой песчаной почвы. Мазут в количестве 0,5 кг капельно наносили на слой почвы с постоянным перемешиванием (начальная концентрация нефтепродуктов составляла 5%). Затем 2,5 г сухого биопрепарата растворяли в 2 л водного раствора минеральной питательной среды (состав: KHO₃ - 4,0 г/л, KH₂PO₄ - 0,4 г/л, Na₂HPO₄·12Н₂O - 1,4 г/л, MgSO₄ - 0,8 г/л, FeSO₄·7H₂O - 0,045 г/л, ZnSO₄·7Н₂O - 0,031 г/л, MnSO₄·7Н₂O - 0,031 г/л, CuSO₄ - 0,004 г/л,) в аппарате с мешалкой и барботером. Осуществляли аэрацию и перемешивание в течение 4 часов. За 2 мин до окончания процесса отключали подачу воздуха и добавляли в суспензию 2,5 г синтанола АЛМ-10 (ТУ 2483-003-71150986-2006). Полученный раствор при перемешивании вносили в загрязненную почву. Влажность почвы поддерживали периодическим орошением на уровне 60% от полной влагоемкости почвы. Аэрацию осуществляли путем периодического перемешивания почвы, при этом температура почвы составляла 18°C-20°C. Отбор проб осуществляли один раз в пять дней. Содержание нефтепродуктов в почве определяли методом ИК-спектрометрии. В результате за 60 дней проведения очистки концентрация нефтепродуктов в почве снизилась с 5% до 0,76%, т.е. степень очистки составила 84,8%.

Предлагаемый способ позволяет повысить эффективность очистки земли от загрязнений нефтепродуктами за счет использования консорциума микроорганизмов, обеспечивающих высокую скорость утилизации нефтепродуктов.