Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ИНДИВИДУАЛЬНОГО ПОДБОРА ПРЕПАРАТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ПРОБИОТИЧЕСКИЕ ШТАММЫ ЛАКТОБАКТЕРИЙ ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОЙ ИНТРАВАГИНАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ

Изобретение относится к микробиологии и медицине и может быть использовано в исследовательской работе НИИ, практической работе бактериологических лабораторий клинических учреждений и акушерско-гинекологической практике для индивидуального подбора препаратов, содержащих пробиотические штаммы лактобактерий, для интравагинальной терапии.

Пробиотические штаммы - это апатогенные для человека штаммы бактерии, обладающие антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и обеспечивающие восстановление нормальной микрофлоры [Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization. 2001, posting date. Regulatory and clinical aspects of dairy probiotics. Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization Expert Consultation Report. Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization Working Group Report. (Online.)].

Основной целью проведения пробиотической терапии является восстановление нормальной микрофлоры. Для восстановления микрофлоры женского репродуктивного тракта используют интравагинальную пробиотическую терапию [Reid, G., К.Millsap, and A.W.Bruce. 1994. Implantation of Lac-tobacillus casei var rhamnosus into vagina. Lancet 344:1229.]. Об эффективности интравагинальной пробиотической терапии судят по возрастанию обсемененности влагалища лактобактериями.

Одним из направлений повышения эффективности пробиотической терапии является поиск пробиотических штаммов с выраженными адгезивными и антагонистическими свойствами.

Известно, что условием успешной пробиотической терапии является соответствие источника выделения пробиотического штамма биотопу, в котором планируется его использование. Характер микрофлоры каждого индивидуума имеет свои особенности, обусловленные полиморфизмом генов макроорганизма, определяющих экспрессию паттернраспознающих рецепторов, бактерицидных веществ и. т.п. [Linhares I.M., Giraldo P.С., Baracat E.С. New findings about vaginal bacterial flora. Rev. Assoc. Med. Bras. 2010, 56(3):370-4.]. Это определяет необходимость индивидуализации пробиотической терапии.

В литературе описаны варианты реализации данного подхода. Известен способ подбора пробиотического препарата при котором назначаемый пробиотический препарат предлагается протестировать методом, аналогичным определению антибиотикочувствительности, на антагонизм в отношении патогена и нормофлоры индивидуума, выделенной из “проблемного” биотопа [Гончар Н.В., Березина Л.В., Тихомирова О.В. Выбор пробиотика для рациональной терапии клебсиеллезной инфекции у детей // Журн. микробиол. - 2009. - №2. - С.85-89.; патент РФ №2428468 МПК C12N 1/20, А61К 35/74, 10.09.2011, Бюл. №25.]. Критерием выбора служит такой характер взаимодействия, при котором пробиотический препарат подавляет патогенных микроорганизмов, и не оказывается отрицательного влияния на развитие нормальной микрофлоры.

Существуют способы индивидуального подбора препаратов, содержащих пробиотические штаммы, в которых в дополнение к выше изложенному учитывают происходящую под влиянием пробиотического штамма модификацию антагонизма и/или ростовых свойств нормофлоры индивидуума [АВ Семенов Характеристика отношений между пробиотическими и автохтонными микроорганизмами и алгоритм индивидуального подбора пробиотиков // Казанский медицинский журнал. - 2011. - Т.2. - №6. - С.792-795].

Однако, вышеописанные способы основаны на определении взаимодействия пробиотических штаммов с микрофлорой организма человека и не позволяют учесть взаимодействие пробиотического штамма с клетками макроорганизма, которые во многом определяет формирование микрофлоры. Таковыми являются в первую очередь мукозальные эпителиоциты, которые благодаря своему положению на границе внутренней и наружных сред, контактам как с нормофлорой, так и с аллохтонными микроорганизмами, а также их способности регулировать мукозальный иммунитет, играют ключевую роль в функционировании микробиоценозов слизистых [Wira С.R., Grant-Tschudy K.S., Crane-Godreau M.A. Epithelial Cells in the Female Reproductive Tract: a Central Role as Sentinels of Immune Protection. American Journal of Reproductive Immunology. 2005, 53 (2):65-76.].

Известен способ индивидуального подбора препаратов, содержащих пробиотические штаммы лактобактерий, основанный на сравнительной оценке степени адгезии пробиотических штаммов лактобактерий к вагинальным эпителиоцитам пациентки. [А.Г. Бойцов, С.В. Рищук, Ю.Ю. Ильясов, Т.А. Гречанинова Адгезия лактобактерий к клеткам вагинального и буккального эпителия // Вестник Санкт-Петербургской Медицинской академии им. И.И. Мечникова. - 2004. - №4 (5) - С.191-193.].

Однако, этот способ позволяет оценить лишь свойство, необходимое для начального этапа колонизации, и априори выраженное у всех пробиотических штаммов. Реализация адгезивной активности не зависит от жизнеспособности, метаболической, репродуктивной активности и антагонистического потенциала бактериальных клеток, которые определяют успешность колонизации биотопа [Маянский, А.Н. Патогенетическая микробиология: руководство / А.Н. Маянский. - Н. Новгород: НГМА, 2006. - 520 с. - с7].

Актуальность разработки способа индивидуального подбора препаратов, содержащих пробиотические штаммы лактобактерий для интравагинальной терапии, обусловлена необходимостью повысить эффективность пробиотической терапии, что может быть использовано для коррекции дисбиотических и воспалительных состояний репродуктивного тракта женщин и будет способствовать сохранению репродуктивного здоровья женщин.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в создании способа, позволяющего на основе определения взаимодействия пробиотических штаммов лактобактерий с вагинальными эпителиоцитами осуществлять индивидуальный подбор препаратов, содержащих пробиотические штаммы лактобактерий для эффективной интравагинальной терапии.

Для достижения указанного технического результата в заявляемом способ индивидуального подбора препаратов, содержащих пробиотические штаммы лактобактерий для эффективной интравагинальной терапии от пациентки выделяют вагинальные эпителиоциты, освобождают их от сопутствующей микрофлоры, готовят взвесь эпителиоцитов в среде культивирования и смешивают со взвесью отмытых термоинактивированных пробиотических штаммов лактобактерий, инкубируют, получают фильтрат культуральной жидкости эпителиоцитов и добавляют его в соотношении 1:7 к взвеси тестируемых пробиотических штаммов лактобактерий, параллельно готовят контроль из смеси среды культивирования эпителиоцитов и взвеси тестируемых пробиотических штаммов в соотношении 1:7, опытную и контрольную пробы инкубируют, измеряют оптическую плотность, рассчитывают степень прироста биомассы в опытной пробе по отношению к контрольной и для эффективной интравагинальной терапии выбирают препарат, содержащий пробиотические штаммы лактобактерий, прирост биомассы которых, под влиянием вагинальных эпителиоцитов пациентки, стимулируется наиболее выражено.

Технический результат от реализации изобретения выражается в создании способа индивидуального подбора пробиотических препаратов, содержащих лактобактерий, для эффективной интравагинальной терапии, основанного на выявлении пробиотических штаммов, прирост биомассы которых под влиянием вагинальных эпителиоцитов пациентки стимулируются наиболее выражено.

Ранее нами были получены данные о способности вагинальных эпителиоцитов и их секреторных продуктов дифференцированно влиять на ростовые свойства и антагонистическую активность различных представителей микробиоценоза влагалища и разработан способ определения этого влияния [пол. решение по 3.2010144750/10 от 16.01.2012, публ. заявки 10.02.2011 Бюл. №4].

Авторами экспериментально установлена информативность определения влияния предварительно стимулированных термоинактивированными пробиотическими штаммами лактобактерий вагинальных эпителиоцитов пациентки на рост этих пробиотических штаммов с целью индивидуального подбора пробиотических препаратов, содержащих лактобактерий, для эффективной интравагинальной терапии.

Авторами были проведено исследование, направленное на выявление связи эффективности интравагинальной пробиотической терапии с особенностями взаимодействия вагинальных эпителиоцитов пациентки с пробиотическим штаммом лактобактерий. В исследовании был использован пробиотический штамм Lactobacillus acidophilus вагинального происхождения, входящий в состав препарата для интравагинального применения Экофемин (Pharma-vinci, Дания).

Для проведения исследований у 24 пациенток, страдающих дисбиозом влагалища, с бокового свода влагалища получали вагинальные эпителиоциты, освобождали их от сопутствующей микрофлоры, инкубируя в течение часа в среде Хенкса, с добавлением антибиотика цефуроксима и лизоцима, трехкратно отмывали десятикратным объемом физиологического раствора, после чего готовили взвесь с концентрацией 10⁶ кл/мл.

Для стимуляции эпителиоцитов к этой взвеси добавляли инактивированный нагреванием до 75°C в течение 20 минут пробиотический штамм Lactobacillus acidophilus, соблюдая соотношение эпителиоцит: микроорганизм - 1:10. Для оценки влияния эпителиоцитов на рост и антагонизм пробиотического штамма фильтрат 4 часовой культуральной жидкости стимулированных эпителиоцитов добавляли в соотношении 1:7 к взвеси тестируемого пробиотического штамма лактобактерий. Изменение ростовых свойств пробиотического штамма определяли фотометрическим (при λ=540 нм) и чашечным методом, путем подсчета количества колонееобразующих единиц (КОЕ) после высева на MRS агар.

Антагонистическую активность пробиотического штамма Lactobacillus acidophilus изучали, используя метод тестирования на бактерицидность культуральной жидкости пробиотических штаммов [Семенов А.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В., Бухарин О.В. Микробная регуляция антагонистической активности бактерий. Бюлл. эксп. биол. мед. 2007; 11:545-48.], полученной под влиянием внеклеточных секреторных продуктов вагинальных эпителиоцитов. Контролем служила культуральная жидкость пробиотических штаммов, полученная под влиянием среды культивирования эпителиоцитов.

Изменения скорости прироста биомассы и антагонистической активности пробиотического штамма Lactobacillus acidophilus под влиянием вагинальных эпителиоцитов, предварительно стимулированных термоинактивированными пробиотическими штаммами были однонаправлены и коррелировали между собой (r=0.81, p<0.05), поэтому использовать для подбора препарата для интравагинальной пробиотической терапии оба эти свойства мы сочли нецелесообразным и дальнейшие исследования ограничили изучением влияния эпителиоцитов на ростовые свойства пробиотического штамма.

По результатам определения влияния вагинальных эпителиоцитов на ростовые свойства пробиотического штамма Lactobacillus acidophilus все участвующие в исследовании пациентки с дисбиозом влагалища были разделены на три группы:

1 - вагинальные эпителиоциты стимулируют ростовые свойства пробиотического штамма Lactobacillus acidophilus;

2 - вагинальные эпителиоциты оказывают индифферентное действие, т.е. изменяют прирост биомассы пробиотического штамма Lactobacillus acidophilus не более чем на 5%;

3 - вагинальные эпителиоциты подавляют прирост биомассы пробиотического штамма Lactobacillus acidophilus.

В первую группу вошли 14 женщин, что составило 58,3% от общего числа обследованных, во вторую - 6 пациенток (25,0%), и в третью - 4 пациентки (16,7%).

После определения влияния вагинальных эпителиоцитов на ростовые свойства пробиотического штамма Lactobacillus acidophilus проводили пробиотическую терапию препаратом Экофемин согласно рекомендациям производителя (Pharma-vinci, Дания) интравагинальным введением капсулы 2 раза в сутки в течение 6 суток.

Сравнительная оценка эффективности пробиотической терапии в исследуемых группах была проведена через 7 дней после завершения курса терапии, и так как микрофлора половых путей женщины находится под воздействием циклически изменяющихся параметров существования, и способность адаптироваться к этим постоянным изменениям является обязательным условием для сохранения нормофлоры влагалища, мы оценили обсемененность влагалища лактофлорой вторично - в первой фазе следующего за интравагинальной пробиотической терапией менструального цикла.

Эффективность пробиотической терапии определяли по восстановлению обсемененности слизистой влагалища лактобактериями (ПМО≥10⁶). Полученные данные обрабатывались статистически: сравнение средних значений показателей проводили по парному критерию Стьюдента в случае зависимых выборок и по t-критерию Стьюдента для независимых выборок. Различия считали значимыми, если вероятность ошибки p была меньше 0,05 [Лакин Р.Ф. Биометрия. М., Высшая школа, 1990.].

Результаты исследований представлены на диаграммах (фиг.1 и фиг.2).

На фиг.1 отображена обсемененность влагалища лактобактериями на 7 сутки после завершения пробиотической терапии. По вертикали обозначены группы пациенток, по горизонтали частота выделения лактобактерий (%). Столбец черного цвета обозначает ПМО лактобактерий ≤10³; темно серые столбцы - ПМО лактобактерий 10⁴; светло-серые столбцы - ПМО лактобактерий 10⁵; белые столбцы - ПМО лактобактерий ≥10⁶.

Из представленной диаграммы (фиг.1) видно, что через неделю после завершения лечения, что у пациенток, вагинальные эпителиоциты которых стимулировали прирост биомассы пробиотического штамма Lactobacillus acidophilus (1 группа), в 85,7% случаев происходило восстановление обсемененности влагалища лактофлорой, у остальных (14,3%) также наблюдалось увеличение показателя микробной обсемененности влагалища лактобактериями, но не превышающее 10⁵ КОЕ/мл.

Во 2 группе пациенток, вагинальные эпителиоциты которых влияли на рост пробиотического штамма Lactobacillus acidophilus индифферентно, восстановление лактофлоры наблюдалось только в 16,7% случаев, а у пациенток 3 группы, вагинальные эпителиоциты которых подавляют прирост биомассы пробиотического штамма Lactobacillus acidophilus не происходило восстановление лактофлоры.

На фиг.2 отображена обсемененность влагалища лактобактериями в первой фазе следующего за пробиотической терапией менструального цикла. По вертикали обозначены группы пациенток, по горизонтали частота выделения лактобактерий (%). Столбец черного цвета обозначает ПМО лактобактерий ≤10³; темно серые столбцы - ПМО лактобактерий 10⁴; светло-серые столбцы - ПМО лактобактерий 10⁵; белые столбцы - ПМО лактобактерий ≥10⁶.

Как видно из представленной диаграммы (фиг.2), по прошествию одного менструального цикла ситуация несколько ухудшилась при сохранении прежней тенденции: нормальное количество лактобактерий было зафиксировано лишь в 1-ой группе пациенток, вагинальные эпителиоциты которых стимулировали прирост биомассы пробиотического штамма Lactobacillus acidophilus, хотя, доля таких пациенток снизилась с 85,7% до 64,3%. Это происходило за счет увеличения количества женщин с умеренным дефицитом лактофлоры. Выраженного дефицита нормофлоры не было зафиксировано ни у одной женщины в этой группе. Напротив, у пациенток третьей группы в течение одного менструального цикла эффект интравагинальной пробиотической терапии был полностью нивелирован, и количество лактобактерий вернулось к прежнему уровню.

Таким образом, полученные данные позволяют расценивать взаимодействия пробиотических штаммов лактобактерий с вагинальными эпителиоцитами как основу формирования микробиоценозов, что может быть использовано для индивидуального подбора препаратов, содержащих пробиотические штаммы лактобактерий для эффективной интравагинальной пробиотической терапии.

С целью подтверждения возможности использования предлагаемого способа было проведено изучение влияния вагинальных эпителиоцитов, полученных от конкретных пациенток, на ростовые свойства разных пробиотических штаммов лактобактерий, выделенных из препаратов «Лактобактерин» (Пермь), «Гинофлор» (Medinowa, Германия), «Экофемин» (Pharma-vinci, Дания), «Ацилакт» (ООО Фермент, Россия), «Лактонорм» (ЛЕККО ЗАО,_Россия). Результаты исследований представлены в таблице.

Полученные результаты указывают на индивидуальный характер взаимодействия вагинальных эпителиоцитов конкретной пациентки с разными пробиотическими штаммами лактобактерий. С практической точки зрения это подтверждает необходимость индивидуального подбора препаратов, содержащих пробиотические штаммы лактобактерий для эффективной интравагинальной пробиотической терапии.

Способ осуществляется следующим образом.

1. С боковых стенок влагалища конкретной пациентки, для которой ведется подбор, ложечкой Фолькмана забирают вагинальные эпителиоциты.

2. Получение вагинальные эпителиоциты освобождают от сопутствующей микрофлоры, инкубируя в течение часа в среде Хенкса, с добавлением 50 мкг/мл антибиотика и 10 мкг/мл лизоцима, и трехкратно отмывают десятикратным объемом физиологического раствора.

3. Готовят взвесь эпителиоцитов в среде Хенкса с концентрацией 10⁶ кл/мл.

4. Суточную культуру тестируемых пробиотических штаммов лактобактерий инактивируют нагреванием до 75°C в течение 20 минут, отмывают и готовят взвесь с концентрацией 10⁸ кл/мл в физиологическом растворе.

5. К 1 мл. взвеси эпителиоцитов добавляют 0,1 мл. взвесь термо-инактивированных пробиотических штаммов лактобактерий для создания соотношения эпителиоцит: микроорганизм - 1:10, инкубируют при 37°C в течение 4 часов и собирают культуральную жидкость.

6. Полученную культуральную жидкость стимулированных эпителиоцитов фильтруют и добавляют в соотношении 1:7 к взвеси тестируемых пробиотических штаммов лактобактерий в среде MRS с концентрацией 10⁶ кл/мл.

7. Параллельно готовят контроль из среды для культивирования эпителиоцитов и взвеси тестируемых пробиотических штаммов лактобактерий в соотношении 1:7.

8. Опытную и контрольную пробы инкубируют в течение 4-6 часов при 37°C периодически помешивая.

9. Проводят измерение оптической плотности в опытной и контрольной пробах, рассчитывают степень прироста биомассы пробиотического штамма лактобактерий в опытной пробе по отношению к контрольной.

10. Препарат, содержащий пробиотический штамм, прирост биомассы которого, под влиянием вагинальных эпителиоцитов пациентки стимулируются наиболее выражено рекомендуют для эффективной интравагинальной пробиотической терапии.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Проводили индивидуальный подбор препарата, содержащего пробиотические штаммы лактобактерий, для интравагинальной терапии для пациентки О.

С боковой стенки влагалища пациентки О. ложечкой Фолькмана получали вагинальные эпителиоциты. Для освобождения их от сопутствующей микрофлоры, эпителиоциты инкубировали в течение часа в среде Хенкса, с добавлением с добавлением 50 мкг/мл цефуроксима и 10 мкг/мл лизоцима, после чего трехкратно отмывали десятикратным объемом физиологического раствора и готовили взвесь эпителиоцитов в среде Хенкса в концентрации 10⁶ кл/мл., отмывают и готовят взвесь с концентрацией 10⁸ кл/мл в физиологическом растворе.

Термоинактивировали нагреванием до 75°C в течение 20 минут суточные культуры пробиотических штаммов лактобактерий, выделенных из препаратов «Лактобактерин» (Пермь), «Гинофлор» (Medinowa, Германия), «Экофемин» (Pharma-vinci, Дания) и готовили их взвесь с концентрацией 10⁸ кл/мл в физиологическом растворе.

К 1 мл. взвеси эпителиоцитов добавляли 0,1 мл. взвеси термоинактивированных пробиотических штаммов лактобактерий. Инкубировали 4 часа при 37°C.

Затем культуральную жидкость эпителиоцитов собирали, фильтровали через бактериальные фильтры и добавляли в соотношении 1:7 к взвеси тестируемых пробиотических штаммов лактобактерий в среде MRS с концентрацией 10⁶ кл/мл. Контроль готовили из смеси среды для культивирования эпителиоцитов и взвеси тестируемых пробиотических штаммов лактобактерий в соотношении 1:7.

В ходе 4 часового инкубирования при 37° в опытных и контрольных пробах измеряли оптическую плотность (при λ=540 нм), рассчитали степень прироста биомассы в опыте относительно контроля.

Прирост биомассы лактобактерий, выделенных из препарата «Лактобактерин», по отношению к контролю составил 83%, лактобактерий, выделенных из препарата «Гинофлор», составил 110%, а лактобактерий, выделенных из препарата «Экофемин», составил 143%. Следовательно, вагинальные эпителиоциты пациентки О. оказывают наиболее выраженное стимулирующее влияние на прирост биомассы пробиотического штамма лактобактерий, содержащегося в препарате «Экофемин», и именно его необходимо выбрать для проведения эффективной интравагинальной пробиотической терапии.

Пример 2.

Проводили индивидуальный подбор препарата для интравагинальной пробиотической терапии для пациентки С.

Согласно заявляемому способу, аналогично примеру 1, определяли влияние вагинальных эпителиогцитов, предварительно стимулированных термоинактивированными пробиотическими штаммами лактобактерий на прирост биомассы этих тестируемых пробиотических штаммов.

Прирост биомассы пробиотического штамма лактобактерий, выделенных из препарата «Лактобактерин», по отношению к контролю составил 89%, пробиотического штамма лактобактерий, выделенных из препарата «Гинофлор», составил 133%, а пробиотического штамма лактобактерий, выделенных из препарата «Экофемин», составил 103%.

Следовательно, вагинальные эпителиоциты пациентки С. оказывают наиболее выраженное стимулирующее влияние на рост пробиотического штамма лактобактерий, содержащегося в препарате «Гинофлор», и именно его необходимо выбрать для проведения эффективной интравагинальной пробиотической терапии.

Пример 3.

Проводили индивидуальный подбор препарата для интравагинальной пробиотической терапий для пациентки X. Согласно заявляемому способу, аналогично примеру 1, определяли влияние вагинальных эпителиоцитов, предварительно стимулированных термоинактивированными пробиотическими штаммами лактобактерий на прирост биомассы тестируемых пробиотических штаммов лактобактерий.

Прирост биомассы пробиотического штамма лактобактерий, выделенных из препарата «Лактобактерин», по отношению к контролю составил 92%, пробиотического штамма лактобактерий, выделенных из препарата «Гинофлор» - 83%, а пробиотического штамма лактобактерий, выделенных из препарата «Экофемин» - 96%. Следовательно, вагинальные эпителиоциты пациентки X. не оказывают стимулирующего влияния на рост тестируемых пробиотических штаммов лактобактерий. Для проведения эффективной интравагинальной пробиотической терапии у пациентки X. эти пробиотические штаммы не могут быть рекомендованы.

Таким образом, заявляемый способ позволяет на основе определения взаимодействия пробиотических штаммов лактобактерий с вагинальными эпителиоцитами осуществлять индивидуальный подбор препаратов, содержащих пробиотические штаммы лактобактерий для эффективной интравагинальной терапии.