РЕКОМБИНАНТНЫЙ ГИБРИДНЫЙ ИНГИБИТОР АНГИОГЕНЕЗА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к области биомолекулярной фармакологии, биотехнологии и генетической инженерии, в частности, к разработке нового рекомбинантного гибридного ингибитора ангиогенеза, обладающего специфической антипролиферационной активностью в отношении эндотелиальных клеток кровеносных сосудов. Изобретение относится также к разработке эффективного способа получения этого препарата путем экспрессии его гена в Е. coli в составе плазмидной ДНК с последующей очисткой. Изобретение может быть использовано в медицине и в медицинской промышленности для создания новых лекарственных средств с антиангиогенным терапевтическим эффектом.

Одной из неразрешенных проблем современной медицины остается проблема неконтролируемого клеточного роста, приводящего к развитию злокачественных опухолей. Несмотря на интенсивные исследования, в области противоопухолевой химиотерапии пока не достигнуто кардинальных успехов. Важным достижением последних лет, тем не менее, стало открытие способности опухолей к индукции специфических ингибиторов, обладающих антиангиогенной активностью и эффективно подавляющих васкуляризацию вторичных опухолей, препятствуя их быстрому развитию и гибели организма-опухоленосителя. Такими ингибиторами, в частности, являются продукты ограниченного протеолиза ферментами, секретируемыми опухолевой тканью, физиологического белка плазминогена [Cao Y. et al. Kringle structures and antiangiogenesis; Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents, 2: 667-681 (2002); Gately S. et al. The mechanism of cancer-mediated conversion of plasminogen to the angiogenesis inhibitor angiostatin; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 10868-10872 (1997)]. Плазминоген обладает структурой, включающей пять так называемых крингл-доменов, особых структур полипептидной цепи, включающих около 80 аминокислотных остатков и поддерживаемых тремя дисульфидными связями. В молекуле плазминогена имеется пять крингл-доменов, расположенных последовательно и обозначаемых номерами от 1 до 5. Белок ангиостатин, являясь фрагментом плазминогена, состоит из четырех крингл-доменов (К1-4); молекулярная масса его колеблется в пределах 37-42 кДа в зависимости от длины не входящих в состав крингл-доменов полипептидных группировок [O'Reilly M.S. et al. Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma; Cell, 79: 315-328 (1994), Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease; Nat Med, 1: 27-31 (1995)]. Доказана мощная ингибирующая активность ангиостатина на процессы, модулирующие прогрессию опухоли, и на ряд типов злокачественных образований. In vitro ангиостатин ингибирует пролиферацию эндотелиальных клеток, причем проявляя специфичность, действуя лишь на эндотелиоциты сосудов, инфильтрирующие опухолевые ткани, а также ингибирует миграцию эндотелиальных клеток и образование кровеносных сосудов [Moser T.L. et al. Angiostatin binds ATP synthase on the surface of human endothelial cells; Proc Natl Acad Sci USA, 96(6): 2811-6 (1999)].

При протеолизе плазминогена ферментами, экспрессирующимися в нормальных и особенно в непластических тканях, кроме ангиостатина образуются и другие полипептидные фрагменты. При исследованиях их ингибирующего потенциала на культурах эндотелиальных клеток капилляров быка наибольшая ингибирующая активность была выявлена не у ангиостатина (К1-4), а у фрагментов К1-3 и К5 [Cao Y. and Xue L. Angiostatin; Semin Thromb Hemostas, 30(1): 83-93 (2004)].

Описан способ получения рекомбинатного К1-3 с помощью внедрения экспрессионного вектора pMETK1 в штамм-продуцент Е. coli [Young-Ae Joe et al. Inhibition of human malignant glioma growth in vivo by human recombinant plasminogen kringles 1-3; Int J Cancer: 82: 694-699 (1999)]. При использовании этой методики регистрировался сравнительно низкий выход целевого протеина, а кроме того, способ обеспечивает ренатурацию лишь доли продукта, что в итоге приводит к весьма низкому выходу биологически активного К1-3 и делает использование этой методики сложным и экономически невыгодным.

Известно, что ассоциация многих членов семейства интегринов, молекул клеточной адгезии, соединяющих цитоскелет с внеклеточным матриксом других клеток и опосредующих такие клеточные функции, как перемещение, инвазию, пролиферацию и др., с патофизиологической картиной развития многих болезней, в том числе и раковых опухолей, делает изучение интегринов привлекательной задачей для исследований в области противоопухолевой терапии [Mousa S.A. Anti-integrin as novel drug-discovery targets: Potential therapeutic and diagnostic implications; Curr Opin Chem Biol, 6(4): 534-541 (2002)]. В состав интегринов входят, в частности, так называемые RGD-рецепторы, распознающие короткую аминокислотную последовательность RGD (Arg-Gly-Asp), присутствие которой обнаружено в ряде лигандов интегринов. RGD-рецепторы, в частности, входят в состав рецепторов, опосредующих процесс ангиогенеза, таких как αv-интегрины. Антагонисты αvβ3-интегринов с различными механизмами действия находятся в настоящее время в стадии клинических исследований в странах Западной Европы (например, Vitaxin-1 и -2, Cilengitide, ATN-161) [Kerr J.S. et al. The αv integrin antagonists as novel anticancer agents: An update; Expert Opin Investig Drugs, 11(12): 1765-1774 (2002)]. Олигопептид Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys использовался для направленного транспорта лекарственных препаратов, например, доксорубицина и тахиплесина, в опухолевые ткани [Arap W. et al. Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model; Science, 279 (5349): 377-380 (1998)]. При этом было достигнуто как повышение избирательности действия препаратов и их кумуляция в патогенном очаге, так и потенцирование эффекта за счет специфического ингибирования интегрин-опосредованных процессов в опухолевой ткани.

Задачей изобретения являлось создание препарата, сочетающего в себе как антиангиогенные свойства крингл-доменов плазминогена, так и селективность действия, вносимую RGD-компонентом, и разработка способа получения предлагаемого препарата.

Для решения изобретательской задачи предлагается новый гибридный ингибитор ангиогенеза, представляющий собой белок, включающий ковалентно связанные между собой аминокислотную последовательность плазминогена человека с 82 по 341 аминокислоту и последовательность Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys, обладающий антиангиогенной активностью и повышенной селективностью действия в отношении опухолевого эндотелия. Предлагается также способ получения гибридного ингибитора в качестве рекомбинантного продукта, при использовании которого ингибитор получают путем экспрессии его гена в клетках штамма-продуцента Е. coli, трансфецированных рекомбинантной плазмидной ДНК pBSRK13, имеющей размер 4155 пар оснований и содержащей данный ген, а также ген сигнального пептида OmpA, lac-оператор, ген устойчивости к канамицину, репликативный ориджин pUC ori и ген, кодирующий lac-репрессор под контролем промотора T7, при этом целевой белок выделяют из периплазматической области бактериальных клеток аффинной и гельфильтрационной хроматографией.

Разработанный экспрессионный вектор несет ген, кодирующий белок, представляющий собой крингл-домены 1, 2 и 3 плазминогена человека с несколькими дополнительными аминокислотными остатками: 11 - с N-конца и 8 - с C-конца. Аминокислотная последовательность предлагаемого ингибитора приведена на фиг.1. Такая полипептидная последовательность точно соответствует аминокислотным остаткам Ser 82-Glu 341 плазминогена человека, у которого с N-конца ковалентно присоединена интегрин-ингибирующая последовательность Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (SEQ ID NO 1). Схема генетической конструкции представлена на фиг.2.

В предлагаемом способе экспрессию гена в клетках штамма-продуцента осуществляют в рекомбинантной плазмидной ДНК pBSRK13 в среде для роста Е. coli, сначала в отсутствие индуктора lac-промотора изопропилтио-β-D-галактопиранозида (IPTG), а по достижении мутности среды 0,4-0,6 OD - добавляя индуктор IPTG до концентрации 0,1-0,3 мМ и продолжая экспрессию под контролем индуцированного lac-промотора рекомбинантной плазмиды. Целевой белок, накапливающийся в бактериальных клетках в периплазматической области, выделяют с помощью последовательно применяемых стадий аффинной и гельфильтрационной хроматографии.

Предлагаемый способ позволяет достичь высокого уровня экспрессии (около 60 мг целевого белка с 1 л культуральной среды) рекомбинантного гибридного ингибитора в виде секретируемого в периплазму клеток Е. coli естественным образом окисленорефолдированного протеина, выделить и очистить данный препарат.

Предлагаемый ингибитор может служить для лечения онкологических и других заболеваний, сопровождающихся неадекватной васкуляризацией тканей, причем как при монотерапии, так и при комбинированной терапии в сочетании с другими химиопрепаратами или нелекарственными методами лечения, например, хирургическими манипуляциями и радиолучевой терапией.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Конструирование генетической конструкции, кодирующей биосинтез рекомбинантного гибридного ингибитора в клетках E. coli.

A) Синтез последовательности, кодирующей 3'-часть гена K1-3 (3K13).

выделенный фрагмент - сайт узнавания ферментом рестрикции SacII, подчеркнутый - сайт узнавания ферментом рестрикции HindIII.

Нами также была получена синтетическим путем последовательность ДНК, содержащая сайт рестрикции фермента BamHI, старт-кодон, ген, кодирующий сигнальный пептид, последовательность, кодирующую последовательность Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys, а также фрагмент, кодирующий 5'-часть гена K1-3 с сайтом рестрикции фермента SacII (SSR5K13, SEQ ID NO 5).

Последовательность SSR5K13:

подчеркнутый фрагмент - сайт узнавания ферментом рестрикции BamHI, выделеный - сайт узнавания ферментом рестрикции SacII.

Б) Синтез последовательности ДНК, содержащей сайт рестрикции фермента BamHI, старт-кодон, ген, кодирующий сигнальный пептид OmpA, последовательность, кодирующую гибридный белок, состоящий из пептида Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys и К1-3, а также стоп-кодон и сайт рестрикции фермента HindIII (SSRK13, SEQ ID NO 6).

Для создания SSRK13 фрагменты SSR5K13 и 3К13 обрабатывали ферментом рестрикции SacII и лигировали между собой с помощью лигазы фага Т4.

Последовательность SSRK13:

подчеркнутый фрагмент - сайт узнавания ферментом рестрикции BamHI, выделений - сайт узнавания ферментом рестрикции HindIII.

Для создания экспрессионного вектора последовательность SSRK13 обрабатывали ферментами рестрикции BamHI и HindIII и лигировали с вектором pBSH2, который предварительно был обработан этими же рестриктазами. Полученный вектор назвали pBSRK13 (фиг.2).

Пример 2. Продукция целевого белка в клетках штамма-продуцента Е. coli.

Экспрессионный вектор pBSRK13, полученный как описано в примере 1, был инкорпорирован в штамм Е. coli BL-21/DE3. Для осуществления экспрессии целевого белка 30 мл трансфецированного штамма выдерживали при покачивании в течение 2-3 ч в среде LB при 37°C с добавлением канамицина (50 мкг/мл) и глюкозы (0,2%). Затем разбавляли эту культуру в 20 раз свежей средой LB, содержащей канамицин (40 мкг/мл) и наращивали 2-3 ч при покачивании. По достижении культуральной средой плотности OD_{280 нм}=0,5 вносили в нее изопропилтио-β-D-галактопиранозид (IPTG) до концентрации 0,5 мМ для индукции биосинтеза К1-3. Затем инкубировали данную культуру около 5 ч при 37°C при покачивании, центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин, супернатант отбрасывали.

Пример 3. Выделение и очистка целевого белка.

Осадок клеток, полученный как описано в примере 2, обрабатывали ультразвуком с помощью щелевого зонда в буфере А (50 мМ Трис, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 0,11% натрий N-лаурилсаркозин). К полученной суспензии добавляли лизоцим до концентрации 30 мкг/мл, выдерживали 25 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин при 4°C, осадок отбрасывали. Полученный раствор затем наносили на хроматографическую колонку, заполненную сорбентом лизин-сефарозой 4В (Amersham Biosciences, USA), предварительно уравновешенную буфером Б (50 мМ натрий гидрофосфат, pH 7,4). После нанесения раствора, содержащего целевой белок, колонку промывали двумя объемами буфера Б, а затем буфером В (50 мМ натрий гидрофосфат, 0,15 М натрий хлорид, pH 7,4) до регистрации базовой линии. Затем элюировали целевой белок 0,2 М раствором ε-аминокапроновой кислоты в буфере В. Фракции, содержащие целевой рекомбинантный протеин, собирали и концентрировали на мембране для ультрафильтрации (MW=10 кДа). Дальнейшую очистку проводили путем гельфильтрационной хроматографии, нанося сконцентрированные фракции на хроматографическую колонку, заполненную сорбентом Sephacryl S-300 (Amersham Biosciences, USA), предварительно уравновешенную буфером Г (10 мМ натрий гидрофосфат, 2,7 мМ калий хлорид, 0,137 М натрий хлорид, pH 7,4) (процедуру проводили при 4°C). Собирали фракции, содержащие очищенный целевой белок.

Объединенные фракции, содержащие целевой белок, помещали в диализные мешки с проницаемостью пор молекулярным весом 8 кДа и диализовали при 4°C 8 ч против буфера Д (10 мМ натрий гидрофосфат, 15 мМ натрий хлорид, 0,02% натрий азид, pH 7,0), а затем против буфера Г в течение 5 ч. Итоговый продукт представлял собой рекомбинантный гибридный полипептид с молекулярной массой 42 кДа и чистотой не менее 99% по данным ДСН-электрофореза.

Пример 4. Определение биологической активности рекомбинантного гибридного ингибитора ангиогенеза in vitro.

Определение биологической активности полученного ингибитора проводили путем оценки его способности ингибировать пролиферацию эндотелиальных клеток человека in vitro. Исследование пролиферации эндотелиальных клеток проводили описанным ранее методом [O'Reilly M. et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth; Cell, 88: 277-285 (1997)]. Клетки HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) из монослоя трипсинизировали и ресуспендировали в среде M199, содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки. Затем клетки рассеивали в 96-луночные планшеты, покрытые желатином, в плотности 5000 клеток в лунку. Через 24 ч добавляли раствор ингибитора в различных концентрациях. По прошествии 20 мин культуры клеток обрабатывались 5 нг/мл раствором основного фактора роста фибробластов (Life Technilogies Inc., USA) в присутствии гепарина (1 мкг/мл). Выживаемость клеток в контрольной и в обработанной раствором К 1-3 группах определяли с помощью МТТ-теста через 72 ч инкубации. МТТ-тест эффективно определяет метаболитическую активность митохондрий, и его результат прямо коррелирует с числом живых клеток. По результатам анализа были получены данные, подтверждающие высокую антиэндотелиальную активность предлагаемого ингибитора (фиг.3).

Пример 5. Определение противоопухолевой активности рекомбинантного гибридного ингибитора ангиогенеза in vivo.

Клетки меланомы линии В16 поддерживали путем еженедельной внутрибрюшинной перевивки мышам С57 В1/6. Для индукции солидных опухолей мышам вводили подкожно клеточную суспензию (2·10⁵ клеток в 0,1 мл физиологического раствора). Ингибитор в физ. растворе вводили опытным животным внутривенно. В качестве дополнительных контрольных препаратов использовали нативный ангиостатин К1-3, выделенный из плазмы крови человека, и пептид Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys, полученный методом твердофазного пептидного синтеза. Размер солидных опухолей измеряли один раз в 2-3 дня. Относительный размер опухолей (ОРО) определяли по формуле: , где P_оп - средний размер опухолей в опытной группе, P_к - средний размер опухолей у нелеченых контрольных животных. Увеличение продолжительности жизни леченых животных по сравнению с контролем определяли по формуле: , где T - средняя продолжительность жизни (СПЖ) леченых животных, дни, C - СПЖ контрольных животных, дни.

Результаты эксперимента приведены в таблице. По сравнению со слабовыраженным эффектом от применения пептида Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys и недостаточным эффектом от применения нативного ангиостатина К1-3, терапия заявляемым гибридным ингибитором приводила к значительному торможению роста опухолей как в период курса лечения, так и после его отмены, и увеличению средней продолжительности жизни леченных животных.

Таким образом, предлагаемый рекомбинантный гибридный ингибитор ангиогенеза способен эффективно подавлять развитие злокачественных опухолей.