Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ РАДИОАКТИВНОСТИ МЕЧЕННЫХ ТРИТИЕМ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ПРИ ИХ ПОЛУЧЕНИИ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА ТЕРМИЧЕСКОЙ АКТИВАЦИИ ТРИТИЯ

Изобретение относится к изотопно-меченным веществам и может использоваться для введения радиоактивной метки в органические вещества с целью изучения их поведения в различных системах, включая биологические.

В биохимических и физико-химических исследованиях широко применяются меченные тритием вещества в качестве индикатора их количества. Метод введения тритиевой метки в биологически активные соединения с помощью метода термической активации трития впервые был использован в работе [Шишков А.В., Филатов Э.С., Симонов Е.Ф. и др. // Докл. АН СССР. 1976. Т.228. С.1237-1241]. В настоящее время этот метод применяется для введения тритиевой метки в различные органические вещества. Метод был использован для введения радиоактивной метки в гуминовые вещества с равномерным распределением трития по компонентам сложной смеси молекул, входящих в состав этих веществ [Бадун Г.А. Позднякова В.Ю., Чернышева М.Г., Куликова Н.А., Перминова И.В., Шмит-Копплин Ф. Способ получения меченных тритием гуминовых и гуминоподобных веществ. Патент на изобретение №2295510. Заявка №2005139586. Приоритет изобретения 19.12.2005].

Типичные условия для введения трития в органические молекулы с помощью метода термической активации трития: температура стенок реакционного сосуда 77 K (охлаждение жидким азотом), давление газа в системе 0,5-2 Па, температура атомизатора (вольфрамовой проволоки) 1500-2000 K, время экспозиции от 10 секунд до нескольких минут.

Для многих соединений производился поиск оптимальных условий введения трития. На примере пантетина было показано, что наибольший выход меченого материнского соединения достигался при давлении 0,5 Па и продолжительности обработка атомами трития 10 секунд при температуре вольфрамовой проволоки 1700 K [Бадун Г.А., Филатов Э.С. // Радиохимия. 1991. Т.33 №1. С.75-77].

Оказалось, что такое низкое давление трития эффективно для введения трития в аминокислоты [Бадун Г.А., Лукашина Е.В., Ксенофонтов А.Л., Федосеев В.М. // Радиохимия. 2001. Т.43 №3. С.272-276], сахара и диазины [Бадун Г.А., Ксенофонтов А.Л., Лукашина Е.В., Позднякова В.Ю., Федосеев В.М. // Радиохимия. 2005. Т.47 №3. С.281-283; Сидоров Г.В., Бадун Г.А. и др.// Радиохимия. 2005. Т.47 №3. С.284-288] и многие другие соединения.

Соотношение меченых соединений (меченого материнского и побочных продуктов) зависело от времени обработки и температуры вольфрамовой проволоки, и для каждого соединения можно подобрать оптимальные условия получения требуемого продукта [Чернышева М.Г., Бадун Г.А. и др. // Радиохимия. 2007. Т.49 №2. С.166-169].

В прототипе [Шишков А.В., Филатов Э.С., Симонов Е.Ф. и др. // Докл. АН СССР. 1976. Т.228. С.1237-1241] было сформулировано важное условие применения метода термической активации трития: температура органического вещества должна быть 77 K, так как это позволяло стабилизировать промежуточные радикалы, образующиеся при введении тритиевой метки. При таких условиях выполнялись все описанные выше работы. Дополнительным фактором применения низкой температуры является удерживание в связанном состоянии летучих побочных продуктов (вода, аммиак, углекислый газ и др.).

Вместе с тем низкая температура мишени органического вещества снижает его реакционную способность и приводит к быстрой термализации горячих атомов трития, попадающих на мишень. Кроме того, для общепринятого размера реакционного сосуда (диаметр цилиндрической части 6-7 см) при температуре газа 77 K условие свободного пробега атомов от вольфрамовой проволоки до стенок сосуда выполняется при давлении не более 0,5 Па. Совокупность указанных причин ограничивает общую и удельную радиоактивность меченого соединения.

В изобретении предлагается использовать охлаждение до 77 K жидким азотом реакционного сосуда не полностью, а только нижней его части, на которую не наносится мишень органического вещества. В этом случае мишень органического вещества остается при комнатной температуре (291-298 K). В результате создаются более благоприятные условия введения трития в органические молекулы: условие свободного пробега выполняется до давления трития 1,2 Па; атомы трития не столь быстро термализуются при попадании в мишень, молекулы мишени имеют более высокую реакционную способность. Охлаждаемая жидким азотом до 77 K нижняя часть реакционного сосуда является ловушкой для летучих побочных продуктов. Обработку вещества атомами трития (нагревание вольфрамовой проволоки до температуры 1500-2000 K) необходимо проводить короткими импульсами не более 10 секунд, что предотвращает разогрев стенок реакционного сосуда и нанесенного на них вещества. В результате общая и удельная радиоактивность меченых соединений возрастает в 2-450 раз.

Данный подход применим к веществам, неспособным испаряться (возгоняться) при комнатной температуре и остаточном давлении газа 0,01 Па.

Применение предложенного изобретения описано в Примерах 1-11.

Эксперименты проводили со смесью трития с водородом с различным содержанием трития в смеси. Каждый раз содержание трития в используемом газе контролировали, проводя эксперимент с полным связыванием трития с коричной кислотой. По радиоактивности меченого продукта определяли содержание трития в исходном газе. Для унификации результатов данные приведены в пересчете на 100%-ное содержание трития.

Пример 1. 0,8 мл водного раствора лизоцима белка куриного яйца с концентрацией 1,25 г/л равномерно распределяли по стенкам реакционного сосуда, быстро замораживали жидким азотом и воду удаляли лиофилизацией. Реакционный сосуд с готовой мишенью присоединяли к специальному устройству для работы с газообразным тритием. Воздух из реактора откачивали до остаточного давления 0,01 Па. Дно реакционного сосуда охлаждали жидким азотом, при этом стенки сосуда находились при комнатной температуре (от 291 до 298 K). В реакционный сосуд напускали протий-тритиевую смесь с содержанием трития 30% до давления 1,2 Па. Нагревали вольфрамовую проволоку до 1800 K электрическим током в течение 10 сек. Остаточный газ откачивали из системы до давления 0,01 Па.

Обработанную мишень лизоцима растворяли в 4 мл соляного фосфатного буфера (PH 7,2±0,1; ионная сила 0,16 М). Радиоактивность составила 745 МБк. Раствор помещали в пластиковую пробирку, закрывали диализной мембраной MWCO 14000. Диализную очистку белка проводили в течение 7 суток против соляного фосфатного буфера (pH 7,2±0,1; ионная сила 0,16 М). Радиоактивность препарата после диализной очистки составила 242 МБк.

Анализ и дополнительную очистку вещества проводили с помощью эксклюзионной хроматографии, используя стеклянную хроматографическую колонку (⌀ 15 мм, L=350 мм), заполненную гелем «Fractogel» TSK HW-40(F) (Merck). В качестве подвижной фазы использовали соляной фосфатный буфер (pH 7,2±0,1; ионная сила 0,16 М). Скорость элюирования составляла 0,15 мл/мин. Время выхода вещества определяли по реакции с реагентом Кумасси по методике Брэкфорда [Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: 1991. С.466]. С помощью жидкостного сцинтилляционного спектрометра определяли удельную радиоактивность элюата. Концентрацию вещества в пробах, содержащих белок, определяли по УФ-поглощению при длине волны 280 нм, используя независимо полученные калибровочные кривые. Был получен [³H]лизоцима с радиохимической чистотой 97% и удельной радиоактивностью 1,7 ТБк/ммоль, что в 9,5 раз больше, чем при температуре мишени 77 K (пример 2).

Пример 2 (сравнительный). 0,8 мл водного раствора лизоцима белка куриного яйца с концентрацией 1,25 г/л равномерно распределяли по стенкам реакционного сосуда, быстро замораживали жидким азотом и воду удаляли лиофилизацией. Реакционный сосуд с готовой мишенью присоединяли к специальному устройству для работы с газообразным тритием. Воздух из реактора откачивали до остаточного давления 0.01 Па, охлаждая стенки сосуда жидким азотом (77 K). В реакционный сосуд напускали протий-тритиевую смесь с содержанием трития 30% до давления 1,2 Па. Нагревали вольфрамовую проволоку до 1800 K электрическим током в течение 10 сек. Остаточный газ откачивали из системы до давления 0.01 Па.

Обработанную мишень лизоцима растворяли в 4 мл соляного фосфатного буфера (pH 7,2±0,1; ионная сила 0,16 М). Радиоактивность составила 155 МБк. Раствор помещали в пластиковую пробирку, закрывали диализной мембраной MWCO 14000. Диализную очистку белка проводили в течение 7 суток против соляного фосфатного буфера (pH 7,2±0,1; ионная сила 0,16 М). Радиоактивность препарата после диализной очистки составила 20 МБк. Анализ и дополнительную очистку вещества проводили с помощью эксклюзионной хроматографии, как описано в примере 1.

Удельная радиоактивность продукта составила 0,18 ТБк/ммоль, что в 9,5 раз ниже, чем при температуре мишени 298 K (пример 1). Радиохимическая чистота [³H]лизоцима составила 95%.

Пример 3. Мишень белка сывороточного альбумина человека готовили нанесением на стенки реакционного сосуда 0,8 мл водного раствора белка с концентрацией 1,25 г/л. Подготовку мишени и реакцию с атомарным тритием проводили аналогично описанию Пример 1.

Обработанную мишень сывороточного альбумина человека растворяли в 4 мл соляного фосфатного буфера (pH 7,2±0,1; ионная сила 0,16 М). Радиоактивность составила 741 МБк. Раствор помещали в пластиковую пробирку, закрывали диализной мембраной MWCO 14000. Диализную очистку белка проводили в течение 7 суток против соляного фосфатного буфера (pH 7,2±0,1; ионная сила 0,16 М). Радиоактивность препарата после диализной очистки составила 318 МБк.

Анализ и дополнительную очистку вещества проводили с помощью эксклюзионной хроматографии, используя стеклянную хроматографическую колонку (⌀ 15 мм, L=350 мм), заполненную гелем Sephadex G-150 (Pharmacia). В качестве подвижной фазы использовали соляной фосфатный буфер (pH 7,2±0,1; ионная сила 0,16 М). Скорость элюирования составляла 0,22 мл/мин, объем элюированной пробы 1,5 мл. Время выхода вещества определяли по реакции с реагентом Кумасси по методике Брэкфорда [Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: 1991. С.466]. С помощью жидкостного сцинтилляционного спектрометра определяли удельную радиоактивность элюата. Концентрацию вещества в пробах, содержащих белок, определяли по УФ-поглощению при длине волны 280 нм, используя независимо полученные калибровочные кривые. Был получен меченный тритием сывороточный альбумин человека с радиохимической чистотой 96% и удельной радиоактивностью 3,32 ТБк/моль, что в 450 раз больше полученной в работе [Нейман Л.А., Смоляков B.C., Шишков А.В. Итоги науки и техники, 1985, Т.2. 207 с.] при температуре мишени 77 K (0,0074 ТБк/ммоль).

Пример 4. Мишень белка сывороточного альбумина быка готовили нанесением на стенки реакционного сосуда 0,8 мл водного раствора белка с концентрацией 1,25 г/л. Подготовку мишени и реакцию с атомарным тритием проводили аналогично описанию Пример 1. Очистку и анализ белка сывороточного альбумина быка проводили аналогично описанию Пример 3. Удельная радиоактивность полученного сывороточного альбумина быка составила 3,83 ТБк/ммоль, радиохимическая чистота 94%. Согласно работе [Нейман Л.А., Смоляков B.C., Шишков А.В. Итоги науки и техники, 1985, Т.2. 207 с.] удельная радиоактивность бычьего сывороточного альбумина, полученного при температуре мишени 77 K составляла 0,059 ТБк/ммоль, что в 65 раз меньше.

Пример 5. 0,8 мл раствора бромида додецилтриметиламмония (ДТАБ) в этаноле с концентрацией 0,75 мг/мл равномерно распределяли по стенкам реакционного сосуда, удаляя растворитель током воздуха. Реакционный сосуд с готовой мишенью присоединяли к специальному устройству для работы с газообразным тритием. Процедуру обработки ДТАБ атомарным тритием проводили аналогично описанию Пример 1. Обработанную атомарным тритием мишень ДТАБ растворяли в 20% растворе этанола. Радиоактивность составила 463 МБк. Раствор упарили с помощью роторного испарителя. Остаток растворили в 1 мл этанола. Радиоактивность составила 337 МБк.

Анализ и очистку меченного тритием ДТАБ проводили методом тонкослойной хроматографии на хроматографических пластинках Silufol. В качестве подвижной фазы использовали смесь бутанола, уксусной кислоты и воды в объемном отношении 3:1:1. Положение ДТАБ на пластинке определяли с помощью реакции Драгендорфа [Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: 1991. С.383]. Значение R_f ДТАБ в системе бутанол - уксусная кислота - вода в объемном отношении 3:1:1 составило 0,36. После проведения хроматографии пластинку с меченым веществом сканировали с помощью сканера радиоактивности БетаХром.

Зону, соответствующую положению вещества, счищали, вещество с силикагеля экстрагировали 0,01 М HBr. Удельная радиоактивность продукта составила 0,16 ТБк/ммоль, радиохимическая чистота 96%. Реакция при температуре мишени 77 K приводила к образованию продукта с удельной радиоактивностью 0,08 ТБк/ммоль [Чернышева М.Г, Бадун Г.А. и др. // Радиохимия. 2007. Т.49 №2. С.166-169]. Увеличение удельной радиоактивности ДТАБ при переходе температуры мишени от 77 до 295 К составило 2 раза.

Пример 6. 0,8 мл раствора додецилсульфата натрия (ДСН) в этаноле с концентрацией 0,75 мг/мл равномерно распределяли по стенкам реакционного сосуда, удаляя растворитель током воздуха. Реакцию с атомарным тритием проводили аналогично описанию Пример 5. После растворения мишени радиоактивность составила 648 МБк. Раствор упарили с помощью роторного испарителя. Осадок растворили в 1 мл этанола. Радиоактивность составила 530 МБк.

Анализ и очистку меченного тритием ДСН проводили методом тонкослойной хроматографии на хроматографических пластинках Silufol. В качестве подвижной фазы использовали смесь бутанол - уксусная кислота -вода в объемном отношении 3:1:1. Положение ДСН на пластинке определяли с помощью йодной камеры. Значение R_f ДСН составило 0,53. После проведения хроматографии пластинку с меченым веществом сканировали с помощью сканера радиоактивности БетаХром.

Зону, соответствующую положению вещества, счищали, вещество с силикагеля экстрагировали 0,01 М NaOH. Радиохимическая чистота меченого соединения составила 96%. Удельная радиоактивность продукта составила 0,16 ТБк/ммоль, что в 2,3 раз больше, чем при температуре мишени 77 K (пример 7).

Пример 7 (сравнительный). 0,8 мл раствора ДСН в этаноле с концентрацией 0,75 мг/мл равномерно распределяли по стенкам реакционного сосуда, удаляя растворитель током воздуха. Реакцию с атомарным тритием проводили при температуре стенок реакционного сосуда 77 K аналогично описанию Пример 2. Анализ и очистку меченого продукта проводили аналогично описанию Пример 6. Радиохимическая чистота меченого соединения составила 97%. Удельная радиоактивность продукта составила 0,07 ТБк/ммоль, что в 2,3 раза ниже, чем при температуре стенок реакционного сосуда 298 K (пример 6).

Пример 8. 1 мл водного раствора L-аргинина с концентрацией 0,15 мг/мл равномерно распределяли по стенкам реакционного сосуда, быстро замораживали жидким азотом и лиофильно высушивали. Реакцию с атомарным тритием проводили аналогично описанию Пример 1. После обработки мишени атомами трития L-аргинин растворяли в 1,5 мл воды. Радиоактивность препарата составила 298 МБк. Раствор упарили на роторном испарителе, вещество растворили в 0,5 мл воды. Радиоактивность составила 97 МБк.

Анализ и очистку меченного тритием L-аргинина проводили методом тонкослойной хроматографии на хроматографических пластинках Silufol. В качестве подвижной фазы использовали смесь хлороформа, метанола, аммиака и воды в объемном отношении 1:9:4:2. Положение L-аргинина на пластинке определяли с помощью реакции с нингидрином. Значение R_f L-аргинина в системе хлороформ-метанол-аммиак-вода 1:9:4:2 составило 0,22. После проведения хроматографии пластинку с меченым веществом сканировали с помощью сканера радиоактивности БетаХром.

Зону, соответствующую положению вещества, счищали, вещество с силикагеля экстрагировали 0,1 М HCl. Удельная радиоактивность продукта составила 0,056 ТБк/ммоль, что в 3,3 раз больше, чем при температуре мишени 77 K (пример 9). Радиохимическая чистота меченого соединения составила 95%.

Пример 9 (сравнительный). 1 мл водного раствора L-аргинина с концентрацией 0,15 мг/мл равномерно распределяли по стенкам реакционного сосуда, быстро замораживали жидким азотом и лиофильно высушивали. Реакцию с атомарным тритием проводили аналогично описанию Пример 2. Анализ и очистку меченого продукта проводили аналогично описанию Пример 8. Удельная радиоактивность продукта составила 0,017 ТБк/ммоль, что в 3,3 раза ниже, чем при температуре стенок реакционного сосуда 298 K (пример 8). Радиохимическая чистота меченого соединения составила 96%.

Пример 10. 1 мл водного раствора валина с концентрацией 0,3 мг/мл равномерно распределяли по стенкам реакционного сосуда, быстро замораживали жидким азотом и лиофильно высушивали. Реакцию с атомарным тритием проводили аналогично описанию Пример 1. После обработки мишени атомами трития валин растворяли в 1,5 мл воды. Радиоактивность препарата составила 493 МБк. Раствор упарили на роторном испарителе, вещество растворили в 0,5 мл воды. Радиоактивность составила 299 МБк.

Анализ и очистку меченного тритием валина проводили методом тонкослойной хроматографии на хроматографических пластинках Silufol. В качестве подвижной фазы использовали смесь бутанол - уксусная кислота - вода в объемном отношении 3:1:1. Положение валина на пластинке определяли с помощью реакции с нингидрином. Значение R_f валина составило 0,25. После проведения хроматографии пластинку с меченым веществом сканировали с помощью сканера радиоактивности БетаХром.

Зону, соответствующую положению вещества, счищали, вещество с силикагеля экстрагировали водой. Удельная радиоактивность продукта составила 0,087 ТБк/ммоль, радиохимическая чистота 96%. Реакция при температуре мишени 77 K приводила к образованию продукта с удельной радиоактивностью 0,03 ТБк/ммоль [Чернышева М.Г., Бадун Г.А. и др. // Радиохимия. 2007. Т.49 №2. С.166-169]. Увеличение удельной радиоактивности валина при переходе температуры мишени от 77 до 295 K составило 2,9 раза.

Пример 11. 0,8 мл раствора пантетина 0,25 мг/мл в метаноле равномерно наносили на стенки реакционного сосуда, удаляя метанол током воздуха. Реакцию с атомарным тритием проводили аналогично описанию Пример 1. После обработки мишени атомами трития пантетин растворяли в 3,2 мл этанола. Радиоактивность препарата составила 1472 МБк. Раствор высушили на воздухе, вещество растворили в 0,8 мл этанола. Радиоактивность составила 830 МБк.

Анализ и очистку меченного тритием пантетина проводили методом тонкослойной хроматографии на хроматографических пластинках Silufol. В качестве подвижной фазы использовали смесь бутанол - уксусная кислота - вода в объемном отношении 3:1:1. Положение пантетина на пластинке определяли с помощью йодной камеры. Значение R_f пантетина составило 0,35. После проведения хроматографии пластинку с меченым веществом сканировали с помощью сканера радиоактивности БетаХром.

Зону, соответствующую положению вещества счищали, вещество с силикагеля экстрагировали этанолом. Был получен меченный тритием пантетин с радиохимической чистотой 96% и удельной радиоактивностью 0,37 ТБк/ммоль, что в 3,7 раз больше, чем описано в работе [А.Г. Мойсеенок, В.А. Гуринович, И.Н. Катковская и др. // Вести НАН Беларуси, серия мед. Наук 2008 №4. С.45-51], когда реакция проводилась при температуре мишени 77 K и было получено соединение с удельной радиоактивностью 0,10 ТБк/ммоль.