СПОСОБ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА НИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА

Предлагаемый способ относится к медицине, в частности к онкологии, и может быть применен для определения содержания активных форм кислорода, а именно пероксида водорода (H₂O₂), в опухолевых клетках при воздействии на них противоопухолевого препарата, в частности цисплатина.

Химиотерапия является одним из основных методов лечения злокачественных новообразований. Известно, что химиотерапевтические методы, по крайней мере, частично, основаны на чувствительности раковых клеток к окислительному стрессу (1), а активные формы кислорода (АФК), в том числе и H₂O₂, играют важнейшую роль в реализации цитотоксического действия противоопухолевых препаратов (1, 2).

Известно, что окислительный стресс, вызываемый в тканях цитотоксическими препаратами в ходе химиотерапии, инициирует перекисное окисление липидов и, соответственно, продукцию множества электрофильных альдегидов, атакующих внутриклеточные мишени (3). Другой проблемой современной химиотерапии являются серьезные токсические эффекты в отношении нормальных тканей, в том числе и в отношении жизненно важных органов (4). Понимание механизмов, регулирующих генерацию и метаболизм АФК, является исключительно важным для разработки патогенетически обоснованных методов лечения злокачественных новообразований, в том числе, путем создания более активных и менее токсичных лекарственных средств.

С этой точки зрения особенно актуальны исследования, посвященные изучению природы окислительного стресса, особенностям его развития в злокачественных новообразованиях, возможностям воздействия на оксидантный статус опухоли с целью повышения эффективности терапии. До настоящего времени остается неясным, в каких именно клеточных структурах происходит генерация АФК, и какие именно формы АФК принимают участие в развитии клеточного повреждения, вызванного лекарственным препаратом. Нерешенными остаются вопросы участия конкретных форм АФК (сайт генерации, основные мишени, пути утилизации) в развитии ответа злокачественных новообразований на различные виды противоопухолевых воздействий. Особый интерес для понимания механизмов реализации противоопухолевых эффектов лекарственных препаратов представляет такая форма АФК, как пероксид водорода (H₂O₂), который является сигнальной молекулой, регулирующей пролиферацию и миграцию как нормальных, так и раковых клеток (5). Несмотря на важную роль, которую играет H₂O₂ в развитии клеточного повреждения при воздействии противоопухолевых препаратов токсических агентов, места образования накопления и деградации H₂O₂, остаются недостаточно разъясненными.

Исследования функции H₂O₂ в клетках осложняются рядом серьезных ограничений вследствие высокой его реактивности, короткого времени жизни и низкой концентрации данной биологической молекулы. Для оценки участия АФК и, в частности, пероксида водорода, в развитии клеточного повреждения предложены различные биохимические и оптические методы:

Так известен способ выявления участия АФК в процессах цисплатин-индуцированного клеточного повреждения на основе ингибирования развития окислительного стресса ловушками АФК (6). Указанный способ является косвенным и не дает возможности прямой оценки количества АФК в клетках, а также не позволяет селективно определить уровень пероксида водорода.

Известны также способы определения продукции АФК в клетках методом выявления хемилюминесценции люминола или люциногена (7, 8).

Основным недостатком данных способов является отсутствие специфичности по отношению к отдельным формам АФК, в частности, к пероксиду водорода. Кроме того, люцигенин способен вызывать дополнительную продукцию супероксид-анион радикала (9).

Наиболее близким по совокупности существенных признаков и техническому результату к предлагаемому способу является способ оценки в динамике содержания пероксида водорода в опухолевых клетках простаты при воздействии на них противоопухолевого препарата цисплатина, который выбран авторами в качестве прототипа.

Данный способ осуществляют путем воздействия противоопухолевого препарата цисплатина на клетки человеческого рака простаты, представляющие собой гормонорезистентные и гормоночувствительные клеточные линии, и измерения внутриклеточного содержания H₂O₂, при этом измерения внутриклеточного содержания H₂O₂ осуществляют с использованием специфических флуоресцентных зондов (сенсоров), представляющих собой экзогенно введенные флуорофоры, изменяющие свои свойства при взаимодействии с H₂O₂ (10).

Способ позволяет определить содержание H₂O₂ в клетках человеческого рака простаты при воздействии цисплатина в динамике.

Однако данный способ не позволяет выявить клеточные структуры, в которых происходит изменение содержания пероксида водорода и, как следствие, отсутствует возможность судить о механизмах токсического действия цисплатина на молекулярном уровне. Кроме того, недостатком способа является возможная погрешность оценки содержания пероксида водорода, обусловленная неспецифическим накоплением сенсора (11-14).

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа оценки содержания пероксида водорода в опухолевых клетках при воздействии на них противоопухолевого препарата, позволяющего выявить место образования пероксида водорода в клетке, и на основе этого судить о механизмах токсического действия цисплатина на молекулярном уровне, а также позволяет исключить возможную погрешность оценки содержания пероксида водорода, обусловленную неспецифическим накоплением сенсора.

Поставленная задача решается предлагаемым способом оценки содержания пероксида водорода в опухолевых клетках при воздействии на них противоопухолевого препарата, включающем воздействие препарата цисплатина на опухолевые клетки человека и последующее измерение внутриклеточного содержания H₂O₂ флуоресцентным сенсором, согласно изобретения, что в качестве опухолевых клеток человека берут клеточную линию аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto, в качестве флуоресцентного сенсора пероксида водорода используют генетически-кодируемый белок HyPer-cyto, измерение внутриклеточного содержания H₂O₂ осуществляют методом лазерной сканирующей микроскопии, определяя интенсивность сигнала флуоресценции при возбуждении сенсора на длинах волн 458 нм и 488 нм, затем рассчитывают величину отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм, по которой и судят о внутриклеточном содержании пероксида водорода.

Предпочтительно воздействие на опухолевые клетки человека - клеточную линию аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto осуществляют при концентрации цисплатина 1,85-3,85 мкг/мл.

Предпочтительно для оценки содержания пероксида водорода в динамике осуществляют определение интенсивности сигнала флуоресценции при возбуждении сенсора на длинах волн 458 нм и 488 нм, и расчет величины отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм, по которой и судят о внутриклеточном содержании пероксида водорода, каждые 60 секунд в течение 30 минут.

Техническим результатом предлагаемого способа является выявление места образования H₂O₂ в клетке, что позволяет судить о механизмах токсического действия цисплатина на молекулярном уровне и исключение возможной погрешности оценки содержания пероксида водорода, обусловленной неспецифическим накоплением сенсора.

Данный технический результат достигается тем, что в качестве опухолевых клеток человека берут клеточную линию аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto, в качестве флуоресцентного сенсора пероксида водорода используют генетически-кодируемый белок HyPer-cyto, измерение внутриклеточного содержания H₂O₂ осуществляют методом лазерной сканирующей микроскопии, определяя интенсивность сигнала флуоресценции при возбуждении сенсора на длинах волн 458 нм и 488 нм, затем рассчитывают величину отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм, по которой и судят о внутриклеточном содержании пероксида водорода, при этом воздействие на опухолевые клетки осуществляют при концентрации цисплатина 1,85-3,85 мкг/мл, а для оценки пероксида водорода в динамике осуществляют определение интенсивности сигнала флуоресценции при возбуждении сенсора на длинах волн 458 нм и 488 нм, и расчет величины отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм, по которой и судят о внутриклеточном содержании пероксида водорода, каждые 60 секунд в течение 30 минут.

Данный технический результат обусловлен тем, что в качестве опухолевых клеток человека используют клеточную линию аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto, стабильно экспрессирующую генетически-кодируемый сенсор пероксида водорода белок HyPer-cyto, локализованный в цитоплазме клетки. Генетически кодируемый клетками аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto сенсор HyPer-cyto для детекции внутриклеточного H₂O₂ представляет собой химерный белок, состоящий из двух доменов: чувствительного к H₂O₂ (регуляторный домен транскрипционного фактора OxyR из Escherichia coli) и флуоресцентного (т.н. круговой пермутант желтого флуоресцентного белка - cpYFP) (15),

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом

На опухолевые клетки, которые представляют собой клеточную линию аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto, стабильно экспрессирующую генетически-кодируемый сенсор пероксида водорода HyPer-cyto, воздействуют противоопухолевым препаратом - цисплатином при его концентрации 1,85-3,85 мкг/мл и измеряют внутриклеточное содержания H₂O₂ методом лазерной сканирующей микроскопии, определяя интенсивность сигнала флуоресценции при возбуждении сенсора на длинах волн 458 нм и 488 нм, после чего рассчитывают величину отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм (F₄₈₈/F₄₅₈), по которой и судят о внутриклеточном содержании пероксида водорода.

Для оценки содержания пероксида водорода в динамике осуществляют определение интенсивности сигнала флуоресценции при возбуждении сенсора на длинах волн 458 нм и 488 нм, и расчет величины отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм, по которой и судят о внутриклеточном содержании пероксида водорода, каждые 60 секунд в течение 30 минут.

При возрастании уровня H₂O₂ в клетках происходит пропорциональное уменьшение интенсивности флуоресценции при возбуждении в диапазоне 400-460 нм и увеличение интенсивности флуоресценции при возбуждении в диапазоне 450-510 нм (15).

Предлагаемым способом была осуществлена оценка содержания H₂O₂ в опухолевых клетках аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto, стабильно экспрессирующих генетически-кодируемый сенсор пероксида водорода HyPer-cyto при воздействии на них препарата цисплатина при его концентрации 1,85-3,85 мкг/мл в 8 экспериментах.

Введение цисплатина в указанных концентрациях вызывает повышение содержания H₂O₂ в клетках линии HeLa Kyoto, экспрессирующих HyPer-cyto непосредственно после добавления препарата в среду инкубации клеток.

Примеры конкретного использования предлагаемого способа

Пример 1. На опухолевые клетки аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto, стабильно экспрессирующие генетически-кодируемый сенсор пероксида водорода HyPer-cyto, и находящиеся в среде инкубации, воздействовали противоопухолевым препаратом - цисплатином при его концентрации 3,85 мкг/мл, при этом измерение внутриклеточного содержания H₂O₂ осуществляли каждые 60 секунд в течение 30 минут методом лазерной сканирующей микроскопии с помощью системы лазерной сканирующей микроскопии LSM 510 на базе инвертированного микроскопа Axiovert 200 М (Carl Zeiss GmbH, Jena, Germany), определяя интенсивность сигнала флуоресценции при возбуждении сенсора на длинах волн 458 нм и 488 нм, после чего рассчитали величину отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм, для каждого измерения.

Зависимость величины отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм от времени измерения приведена на графике 1 (фиг.1).

При этом график зависимости величины отношения (F₄₈₈/F₄₅₈) усреднен по данным об уровне флуоресценции 8 клеток после воздействия цисплатина. Данные представлены в виде средних вычислений. Вычисления проводились с использованием программы формирования изображений LSM 5 (Carl Zeiss) и лицензионного программного обеспечения Excel 5.0.

Динамику содержания пероксида водорода в опухолевых клетках оценивали по изменению величины отношения.

Контакт клеток с цисплатином в данной концентрации вызывает быстрое и относительно кратковременное повышение уровня генерации пероксида водорода в цитоплазме клеток линии HeLa-Kyoto-HyPer-cyto. При этом непосредственно после введения препарата в среду инкубации клеток отмечалось повышение величины отношения F₄₈₈/F₄₅₈, которое продолжалось в течение 5 минут.В дальнейшем, через 10 минут после введения цисплатина, концентрация H₂O₂ вновь падала, о чем свидетельствовало снижение величины отношения F₄₈₈/F₄₅₈ до исходных значений.

Пример 2.

Пример 2 осуществляли как пример 1, только воздействовали противоопухолевым препаратом - цисплатином при его концентрации 1,85 мкг/мл.

Зависимость величины отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм от времени измерения приведена на графике 2 (фиг.1).

При этом график зависимости величины отношения (F₄₈₈/F₄₅₈) усреднен по данным об уровне флуоресценции 8 клеток после воздействия цисплатина данной концентрации.

Содержание пероксида водорода в опухолевых клетках оценивали по изменению величины отношения во времени.

При этом наблюдается быстрое повышение содержания перексида водорода в цитоплазме, а затем постепенное снижение в течение 10 минут.

Пример 3.

Пример 3 осуществляли как пример 1, только воздействие противоопухолевым препаратом - цисплатином отсутствовало.

Зависимость величины отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм от времени измерения приведена на графике 3 (фиг.1).

При этом график зависимости величины отношения F₄₈₈/F₄₅₈ усреднен по данным об уровне флуоресценции 9 клеток в контроле.

Содержание пероксида водорода в опухолевых клетках оценивали по изменению величины отношения во времени. В данном случае подъема уровня пероксида не наблюдалось.

Как видно из полученных результатов, предлагаемый способ позволяет оценивать содержание пероксида водорода в опухолевых клетках при воздействии на них противоопухолевого препарата цисплатина, выявляя место образования пероксида водорода в клетке, и на основе этого судить о механизмах токсического действия цисплатина на молекулярном уровне, а также позволяет исключить возможную погрешность оценки содержания пероксида водорода, обусловленную неспецифическим накоплением сенсора.

Понимание механизмов, регулирующих генерацию и метаболизм, является исключительно важным для разработки патогенетически обоснованных методов лечения злокачественных новообразований, в том числе, и для разработки более активных и менее токсичных лекарственных средств. С этой точки зрения особенно актуальны исследования, посвященные изучению природы окислительного стресса, особенностям его развития в злокачественных новообразованиях, возможностям воздействия на оксидантный статус опухоли с целью повышения эффективности терапии.

Источники информации