Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ ПЕЧЕНИ РЫБ ТРЕСКОВЫХ ПОРОД

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к способам получения биологически активных веществ из субпродуктов животного происхождения, в частности к получению биологически активных комплексов из печени рыб семейства тресковых (Gadidae), обладающих выраженными противовоспалительным, иммуностимулирующим, цитопротекторным и нормализующими метаболизм свойствами.

За рубежом разработан и успешно применяется в клинической практике целый арсенал препаратов на основе комплекса биологически активных веществ, получаемых из экстрактов, вытяжек и лизатов органов и тканей животных (раверон, румалон, солкосерил, церебролизин и т.д.). В нашей стране выпуск подобных препаратов еще только осваивается, причем для получения препаратов из животного сырья используют экстракцию измельченных органов убойного скота. Однако получаемые таким способом препараты содержат значительное количество высокомолекулярных белковых примесей, обусловливающих их высокую реактогенность.

Мировой и отечественный опыт фармации свидетельствует об огромном потенциале морских гидробионтов как сырьевых источников для создания оригинальных фармацевтических субстанций и лекарственных средств. В отличие от показателей видового обилия филогенетическое (макротаксономическое) разнообразие в море гораздо выше. По-видимому, благодаря адаптации к разнообразным факторам окружающей среды ряд морских животных и растений выработал способность к продуцированию уникальных вторичных метаболитов, многие из которых обладают высокой фармакологической активностью (Мальцева и др. Разнообразие антимикробных пептидов в кислых экстрактах из целомоцитов морской звезды Asterias rubens L. // Вестник СПбГУ, 2007, 3 (1), С.85-94). Биологически активные вещества морского происхождения могут использоваться в качестве фармацевтических субстанций и служить синтонами для получения лекарств с новыми или улучшенными фармакологическими характеристиками. Эти вещества являются вторичными метаболитами, то есть природными соединениями, не имеющими всеобщего распространения и присутствующими только у представителей отдельных таксонов.

Результаты исследований по выделению биологически активных веществ из гидробионтов, обитающих в различных водных ресурсах, показывают, что основными классами биологически активных соединений являются полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), полисахариды, витамины и минералы, антиоксиданты, ферменты и пептиды (Kobayashi М., Satan R.R. Overview of marine natural products chemistry // Proc. Seminar biotechnology. Indonesia. 1998. P.23-32).

Открытие биорегулирующей роли различных эндогенных пептидов в организме, полученных из природных источников, способствовали их рассмотрению в качестве перспективных кандидатов для создания лекарственных препаратов (Miljanich G.P. Venom peptides as human pharmaceuticals // Sci. Med. 1997. P.6-15).

Выделенные из морских гидробионтов пептидные комплексы могут проявлять цитотоксические, антимикробные свойства; выступать в роли специфических блокаторов ионных каналов. В зависимости от химической структуры такие комплексы обладают полифармакологической активностью (Aneiros A, Garateix A. Bioactive peptides from marine sources: pharmacological properties and isolation procedures // J Chromatogr B.2004. V.803. P.41-53).

Сырьем для выделения биологически активных пептидных комплексов могут служить как филе и обрезки самих рыб, так и рыбные субпродукты: внутренние органы, скелет, кожа (Kim S.K., Mendis E. Bioactive compounds from marine processing byproducts - A review // Food Res Int. 2006. V.39. P.383-393).

Одним из основных субпродуктов, богатых полезными протеинами, является печень. Содержание протеинов в печени, в зависимости от вида рыб, может достигать 20% (Bechtel et al. Chemical characterization of liver lipid and protein from cold-water fish species. J. Food Sci., 2006, 71(6), 480-485).

Печень рыб семейства тресковых характеризуется достаточно большим размером по сравнению с другими видами (Kryvi, H. Generell anatomi. In Fiskens fysiologi, John Grieg forlag, Bergen. 1992. P.8-32) и может служить сырьем для выделения из нее множество биологически активных компонентов.

В настоящее время печень трески активно перерабатывается с целью получения рыбьего жира. Однако результаты литературных данных, посвященных изучению химического состава печени рыб (например, Bechtel P.J., Oliveira A.C.M., 2006), показывают, что помимо высокого содержания полиненасыщенных жирных кислот, печень содержит пептиды, незаменимые и заменимые аминокислоты.

Известен способ получения лекарственного препарата «Скваакан» из печени черноморской акулы катран. Способ заключается в том, что печень акулы катран гомогенизируют, обезжиривают путем холодного отстоя при +1…+5°С в течение 20-24 ч, затем обезжиренный гомогенат направляют на термическую и химическую коагуляцию белков при рН 1,0-6,0, отстаивают при комнатной температуре в течение 5-6 ч с получением стабилизированного экстракта, который после центрифугирования и мембранной фильтрации ампулируют и автоклавируют (Патент RU 2211700, C2, опубл. 10.09.2003).

Недостатком данного способа является применение для очистки от белков воздействие высоких температур и химических реагентов, что в свою очередь может привести к разрушению нативной структуры пептидных компонентов, содержащихся в печени катрана.

Известен способ получения водорастворимого полипептидного комплекса из печени рыб лососевых пород, включающий измельчение исходного сырья, экстракцию дистиллированной водой при соотношении сырье: экстрагент 1:5-1:30 с последующим подщелачиванием суспензии до рН 8-9 и настаиванием ее при комнатной температуре в течение 2-4 часов с перемешиванием, очистку целевого продукта путем обработки жидкой фракции 0,3% раствором хитозана в 3% растворе пищевой органической кислоты при рН 2,5-3,0 в соотношении 1:20 с перемешиванием в течение 1 часа и последующим инкубированием смеси в течение 2-3 часов и двойным разделением путем сепарирования на твердую и жидкую фракции с последующим соединением жидких фракций (патент RU 2409291 (C1), опубл. 20.01.2011).

Недостатком этого способа является большое количество рабочих стадий, применение кислот и щелочей, что ведет к большому количеству стоков, требующих очистки, использование дорогостоящего хитозана, обладающего собственной биологической активность.

Известен способ комплексной переработки печени рыб семейства тресковых. Способ предусматривает измельчение печени и смешивание ее с маслом и водой при определенных соотношениях, расслаивание, центрифугирование и сепарирование, в результате чего получают липидный и гидрофильный комплексы и плотную фракцию. Способ позволяет без термообработки перерабатывать печень рыб семейства тресковых с сохранением ценных биологически активных веществ (патент РФ №2420213, опубл. 10.06.2011). Данный патент не предусматривает получения комплекса биологически активных веществ, содержащих сумму фосфолипидов и пептидов. Липидный комплекс, полученный по известному методу, требует дополнительной стабилизации для хранения с помощью введения антиоксидантов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения пептидов, ассоциированных с фосфолипидами (Заявка РФ 2010148917/15, 29.11.2010, опубл. 10.06.2012), выбранный авторами за прототип. Способ включает гомогенизацию сырья, обработку экстрагентом в водной среде, отделение балластных веществ, осаждение пептидно-фосфолипидного комплекса, отделение осадка и высушивание конечного продукта, отличается тем, что в качестве сырья используют печень тресковых рыб, в качестве экстрагента - масло растительное, а осаждение пептидов проводят этиловым спиртом при объемном соотношении экстракт-спирт 1-(2÷5) при температуре (-5)-(+10)°С.

Недостатком данного способа является то, что при использовании указанных режимов происходит частичная потеря части биологически активных веществ - аминокислот, минералов и других.

Задачей изобретения является промышленная переработка печени рыб тресковых пород с получением комплекса биологически активных веществ, обладающих сбалансированным аминокислотным составом, повышенным содержанием пептидов, фосфолипидов и минералов.

Задача изобретения решается новым способом получения комплекса биологически активных веществ из печени рыб тресковых пород, включающим гомогенизацию печени рыб семейства тресковых (Gadidae), обработку экстрагентом, представляющим собой смесь масла растительного с водой при соотношении сырье: экстрагент 1:0,2÷2, при комнатной температуре в течение 10 мин - 1 часа с перемешиванием мешалкой при скорости 50-200 об/мин, отделение осадка балластных веществ, осаждение высокомолекулярных белков путем обработки органическим растворителем, выбранным из ряда 95% этиловый спирт, ацетон, ацетонитрил, изопропанол, при объемном соотношении экстракт-растворитель, равном 1:1÷5, при -5-+10°С, отстаивание при комнатной температуре в течение 5-6 ч, отделение осадка фильтрованием и высушивание водного остатка, содержащего конечный продукт - комплекс биологически активных веществ.

Причем в качестве сырья используют печень рыб тресковых пород в свежем или замороженном виде.

В качестве растительного масла можно использовать любые пищевые масла: подсолнечное, оливковое, кукурузное, льняное и др., предпочтительно используется кукурузное масло.

Технический результат - стабилизация биологически активного органопрепарата, максимальное извлечение клеточного сока, повышение выхода комплекса биологически активных веществ, пригодных для создания качественного лекарственного препарата из печени рыб семейства тресковых.

Печень и почки содержат достаточно высокую концентрацию основных аминокислот. Суммарное содержание аминокислот в печени составляет 130 мкмоль/г, для сравнения в плазме - около 2.0 мкмоль/г (Jürss К., Bastrop R., Chapter 7 Ammo acid metabolism in fish, Biochem. Molecular Biol. of Fishes, 1995, 4 (С), 159-189). Поскольку основные превращения протеинов происходят в печени, следует ожидать достаточно высокую концентрацию аминокислот в препаратах, полученных из печени тресковых, что и было обнаружено нами.

Температура воды в Антарктике и Арктике близка к точке замерзания в течение года и рыбы в этих водах всегда имеют повышенный уровень так называемых антифризов - пептидов и гликопептидов. Вещества-антифризы синтезируются в печени осенью и выполняют защитную функцию (De Vries Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes // Ann. Rev. Physiol., 1983, 45, 245-260). Принимая во внимание вышесказанное, в качестве сырья выбрана печень рыб тресковых пород, широко распространенных в Арктических широтах.

Сущность способа заключается в следующем: свежую или замороженную печень рыб тресковых пород (сем. Gadidae) (треска, пикша, минтай) измельчают на куттере или электромясорубке. Как показали предварительные опыты, более тщательное измельчение с разрушением клеток не требуется. Фарш свежей или замороженной печени заливают смесью растительного масла и воды при соотношении сырье : экстрагент 1:0,2÷2. Авторами установлено, что добавление масла растительного к воде для обезжиривания измельченной печени способствует более быстрому и полному процессу без применения химических реагентов и без дополнительного термического воздействия.

Суспензию инкубируют при комнатной температуре с перемешиванием в течение 10 мин-1 часа, затем отделяют осадок балластных веществ, что целесообразно проводить на промышленном сепараторе или проточной центрифуге непрерывного действия. Жидкую фракцию очищают от высокомолекулярных примесей путем их осаждения (коагуляции) при добавлении органического растворителя (95% спирта этилового, ацетона, ацетонитрила, изопропанола), выдерживают при температуре от -5°С до +10°С до полного осаждения высокомолекулярных примесей, для лучшего эффекта выдерживают при комнатной температуре 5-6 часов, разделяют, полученный водный остаток высушивают любым известным методом за исключением высокотемпературного выпаривания: вакуумной сушкой, распылительной сушкой, лиофилизацией. Предпочтительно - путем концентрирования с помощью роторно-пленочного испарителя и последующей лиофильной сушки.

Конечный продукт представляет собой субстанцию от желтого до желто-бурого цвета, от мазеобразной до более плотной консистенции с характерным запахом, не содержит токсичных элементов в количествах, превышающих ПДК, и патогенную микрофлору, т.е. является безопасным.

Продукт на 35 и более процентов состоит из пептидов. При проведении электрофореза в полиакриламидном геле установили, что из большого спектра белков и полипептидов, присутствующих в водном экстракте печени рыб семейства Gadidae, в конечном продукте большую часть составляют пептидные компоненты с молекулярной массой менее 1 кДа (простые пептиды), а так же присутствует не менее 10 различных пептидных соединений с молекулярными массами в диапазоне приблизительно от 3 до 19 кДа. В пептидной субстанции отсутствуют высокомолекулярные белковые соединения (по качественной реакции на белок методом осаждения трихлоруксусной кислотой). Содержание свободных аминокислот составило 20-55%, среди которых основными являются: L-глутаминовая кислота, L-аспарагиновая кислота и L-серин. Методом ВЭЖХ-ELSD установлено, что исследуемая субстанция содержит фосфолипиды, эфиры холестерина, холестерин, свободные жирные кислоты, моноглицериды и др. вещества, при этом основными фосфолипидными компонентами являются фосфатидилхолин, содержание которого составляет не менее 40 мг/г, и сфингомиелин. Суммарное содержание микро- и макроэлементов, определенное методом атомно-эмиссионной спектрометрии, составило 91100±4100 мг/кг.

Пример 1. 50 кг замороженной печени трески (Gadus morrhua L.) гомогенизируют путем измельчения электромясорубкой, добавляют в фарш смесь 10 л воды и 10 л масла кукурузного, экстрагируют в реакторе при комнатной температуре 15 минут при перемешивании на установке для смешивания P-5 при 100 об/мин. Отделяют осадок балластных веществ. К водному раствору прибавляют спирт этиловый в соотношении 1:2,6, выдерживают при температуре 0-6°С в течение 20-24 ч часов до полного осаждения высокомолекулярных примесей, отстаивают при комнатной температуре в течение 5 ч, фильтруют и полученный фильтрат лиофилизируют. Выход целевого продукта составляет 19 г на 1 кг исходного сырья.

Пример 2. 20 кг свежей печени минтая (Theragra chalcogramma P.) измельчают на волчке, добавляют в фарш смесь 5 л воды и 5 л масла подсолнечного и экстрагируют в реакторе при комнатной температуре 50 минут, при перемешивании на установке для смешивания P-5 при 150 об/мин. Отделяют осадок балластных веществ. К водному раствору прибавляют ацетон в соотношении 1:4, выдерживают при температуре -5-0°С в течение 18-24 ч часов до полного осаждения высокомолекулярных примесей, отстаивают при комнатной температуре в течение 5 ч, фильтруют и лиофилизируют. Выход целевого продукта составляет 17 г на 1 кг исходного сырья.

Пример 3. 10 кг замороженной печени наваги (Eleginus navaga K.) измельчают на волчке, добавляют в фарш смесь 3 л воды и 5 л масла кунжутного масла и экстрагируют в реакторе при комнатной температуре 20 минут при перемешивании на установке для смешивания P-5 при 150 об/мин. Отделяют осадок балластных веществ. К водному раствору прибавляют ацетонитрил в соотношении 1:2, выдерживают при температуре 5-10°С в течение 20-24 ч часов до полного осаждения высокомолекулярных примесей, отстаивают при комнатной температуре в течение 6 ч, фильтруют и полученный фильтрат высушивают путем предварительного концентрирования с помощью роторно-пленочного испарителя и последующей лиофильной сушки. Выход целевого продукта составляет 27 г на 1 кг исходного сырья.

Пример 4. Изучение биологической активности

По показателям острой токсичности тестируемая субстанция относится к VI классу практически не токсичных веществ по классификации Hodge и Sterner (Hodge H. et al., 1975).

При моделировании экспериментального адъювантного артрита, индуцированного полным адъювантом Фрейнда, удалось вызвать патологию по клиническим показателям, близкую к ревматоидному артриту у человека, которая сопровождалась выраженным локальным воспалительным процессом. В ходе эксперимента было установлено наличие выраженного противовоспалительного эффекта в дозах 5 и 10 мг/кг комплекса по примеру 1. Следует отметить, что при оценке противоотечного (антиэксудативного) эффекта эквивалентные дозы препаратов по трем примерам (0,1 мг/кг) оказались равноэффективны. Максимально эффективная доза составила 0,4 мг/кг.

Жаропонижающий эффект выделенного комплекса (примеры 1-3) установлен для всех исследуемых доз (0,1; 0,2; 0,4 мг/кг). Следует отметить, что данный эффект развивался спустя 4 дня применения.

При этом хондро- и остеопротекторное действие наблюдалось при применении комплекса по примерам 1-3 в дозе 0,1 мг/кг.

Результаты исследований комплекса показали, что он вызывает снижение лейкотриенов и простагландинов, образующихся в каскаде метаболизма арахидоновой кислоты, путем ферментативного катализа, с участием ферментов 5-ЛОГ (5-липоксигеназы) и ЦОГ-2 (циклооксигеназы-2), на которые препарат оказал ингибирующее влияние. Активность ЦОГ-1 (циклооксигеназы-1), которая широко распространена в организме и выполняет в норме различные функции, например обладает гастро-протективными свойствами, повышалась.

Сравнительное изучение противоаллергических свойств проводилось на модели аллергического контактного дерматита у мышей. Основные проявления данной патологии выражались отеком и эритемой "опытного" уха. Оценка эффективности препаратов проводилась по основному показателю - разнице массы "опытного" и "контрольного" ушей экспериментальных животных. По итогам проведенного исследования выраженный противоаллергический эффект, сравнимый с Супрастином.

Таким образом, биологически активный комплекс, полученный согласно заявленному способу, проявляет различную фармакологическую активность и может быть использован для получения препаратов широкого терапевтического спектра.

В частности он может использоваться в целях:

- коррекции патологий иммунитета

- стимуляции регенерации органов и тканей.