Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ АТРОФИИ ЗРИТЕЛЬНОГО НЕРВА РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ

Изобретение относится к медицине, а точнее к офтальмологии, и может быть использовано для лечения атрофии зрительного нерва различной этиологии.

Атрофия зрительного нерва (АЗН) является одной из самых распространенных и прогностически неблагоприятных поражений органа зрения, приводящих к значительному необратимому снижению зрительных функций. Данное заболевание является последствием весьма разнообразных патологических процессов: воспаления, дегенеративных изменений, отека, сдавления и повреждении ЗН. Различают приобретенную АЗН, которая возникает в результате повреждения зрительного нерва, и врожденную, генетически обусловленную. В основании патогенеза АЗН лежат два основных процесса: распад нервных волокон и заместительные процессы. Атрофированные нервные волокна впоследствии замещаются соединительной тканью. Наряду с этим происходит нарушение кровообращения зрительного нерва - запустевают капилляры, питающие пораженные участки. В результате этих изменений атрофия приводит к истончению зрительного нерва. Состояние зрительных функций при этом зависит как от локализации, так и от интенсивности склеротического процесса.

В настоящее время наибольшее распространение в лечении АЗН имеет комплексный подход, включающий проведение медикаментозной терапии в комбинации с методом чрезкожной электростимуляции зрительного нерва (Шандурина А Н. Клинико-физиологичсские основы нового способа восстановления зрения путем прямых электростимуляций пораженных зрительных нервов. Автореф. дис. …д-ра мед. наук - Л., 1985; Шигина Н А. Клинический анализ результатов лечения пациентов с атрофией зрительного нерва. Глаукома. - 2002 - №1. С.28-34). Недостатками данной комплексной системы являются: чрезмерная фармакологическая нагрузка па организм и возможность побочных реакций, недостаточный функциональный эффект и недостаточная длительность его сохранения: улучшение зрительных функций - в 64-70,3% случаев, стабилизация результатов лишь на 3-4 месяца.

Одним из перспективных методов лечения атрофии зрительного нерва различной этиологии может явиться применение мезенхимальных стволовых клеток (МСК), однако такие методы еще недостаточно разработаны.

Стволовые клетки обладают рядом существенных достоинств: могут обеспечивать регенерацию поврежденных участков через продукцию различных факторов роста и ключевых метаболитов; способны разворачивать программы пролиферации и дифференцировки, восполняя тем самым недостаток активно работающих клеток. В офтальмологии терапевтический потенциал стволовых клеток изучался на животных (Lund et al. Subretinal transplantation of genetically modified human cell lines attenuates loss of visual function in dystrophic rats // PNAS. - 2001. - V.98. - N.17. P.9942-9947; Rander et al. Light-driven retinal ganglion cell responses in blind rd mice after neuronal transplantation // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2001. - V.42. - P.1057-1065; Woch et al., 2001; Sagdullaev et al. Retinal transplantation-induced recovery of retinotectal visual function in rodent model of retinitis pigmentosa // Invest. Ophthal. Vis. Sci - 2003. - V.44. - P.1686-1695).

Хотя стволовые клетки взрослого организма обладают более ограниченным потенциалом дифференцировки, чем эмбриональные стволовые клетки, получаемые при культивировании клеток бластоцисты, их применение более безопасно. Кроме того, с точки зрения этики, они являются более приемлемым для клинического использования материалом.

Существенной проблемой клеточной терапии является направленная доставка стволовых клеток к патологическому очагу и удержание их в нем в течение времени, необходимого для достижения лечебного эффекта.

Задачей изобретения является повышение эффективности лечения атрофии зрительного нерва различной этиологии.

Техническим результатом является улучшение или стойкая стабилизация зрительных функций, расширение границ поля зрения, ускорение гемодинамики в сетчатке и зрительном нерве. Технический результат достигается за счет того, что:

1. Используют трехкомпонентный комплекс, содержащий МСК, меченные магнитными микрочастицами, транспонированные в биологический или синтетический мелкопористый материал, который прочно скреплен с полимерным магнитным материалом с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием.

2. Транслоцирование МСК, меченных магнитными микрочастицами, в биологический или синтетический мелкопористый материал в сочетании с плотным прикреплением к полимерному магнитному материалу с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием обеспечивает глубокое проникновение МСК в слои биологического или синтетического мелкопористого материала, удержание и равномерное распределение МСК в области патологического очага при имплантации трехкомпонентного комплекса так, чтобы он охватывал зрительный нерв, задние короткие цилиарные артерии и часть ретробульбарной клетчатки, не смыкая их, в течение времени, необходимого для достижения лечебного эффекта, за счет взаимодействия магнитных полей микрочастиц и магнитного материала.

3. Размещение трехкомпонентного комплекса так, чтобы он охватывал зрительный нерв, задние короткие цилиарные артерии и часть ретробульбарной клетчатки, не смыкая их, достигается за счет выполнения его в форме двух полуцилиндров.

4. Имплантация трехкомпонентного комплекса так, чтобы он охватывал зрительный нерв, задние короткие цилиарные артерии и часть ретробульбарной клетчатки, не смыкая их, сопровождается направленной избирательной адгезией МСК в области патологического очага, что способствует активации репаративных процессов за счет приживления трансплантированных стволовых клеток в непосредственной близости от поврежденного участка, оказывает биостимулирующее воздействие на ретробульбарную часть зрительного нерва, способствует улучшению микроциркуляции и трофики в зрительном нерве, ускорению метаболизма и гемодинамики как в зрительном нерве, так и в сетчатке.

Возможность подобных процессов для эмбриональных стволовых клеток и для стволовых клеток взрослого организма показана в экспериментах на животных (Lamba D.A., Karl M.O., Ware C.B., Reh T.A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells // PNAS, 2006, v.103, n.34, pp.12769-12774. Meyer J.S., Katz M.L., Maruniak J.A., Kirk M.D. Embrionic stem cell-derived neural progenitors incorporate into degenerating retina and enhance survival of host photoreceptora // Stem Cells, 2006, v.24, n.2, pp.274-283. Fiedlander M. Fibosis and diseases of the eye // J. Clin. Invest., 2007, v.117, n.3, pp.576-586), хотя многие из механизмов реализации терапевтического эффекта изучены не до конца.

Способ осуществляется следующим образом.

На предварительном этапе подготавливают трехкомпонентный комплекс, содержащий МСК, меченные магнитными микрочастицами, транспонированные в биологический или синтетический мелкопористый материал, который скреплен с полимерным магнитным материалом с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием.

МСК выращивают в культуре клеток костного мозга, взятых у пациента во время диагностической пункции из грудины или подвздошной кости (объем - 0,5-1,0 мл). Выращивание культуры проводят в специальном боксе для клеточных культур с использованием следующего оборудования - центрифуга с одноразовыми стерильными центрифужными пробирками на 50 мл, термостат воздушный, ламинарный бокс, инвертированный и обычный микроскопы, автоматические пипетки, баллоны с углекислым газом и воздухом, камеры Горяева для подсчета концентрации клеток. Для культивирования клеток исходного костного мозга используют стерильные одноразовые пластиковые культуральные флаконы с площадью дна в 25 и 150 см². При размножении МСК используют следующие среды и растворы: среда RPMI-1640, среда 199, антибиотики: пенициллин, амфотерицин, - раствор L-глютамина, эмбриональная телячья сыворотка. За 12-14 последовательных удвоений (в течение 25-30 суток) из исходного количества недифференцированных МСК, содержащихся в полученном пунктате костного мозга пациента и составляющем примерно 10³ клеток, продуцируется примерно (1-2)×10⁷ МСК, необходимых для проведения успешной трансплантации стволовых клеток.

Магнитные частицы (d=2,8 мкм) вводят в цитоплазму мезенхимальных стволовых клеток по следующей методике. По достижении 80-90% конфлюентности к культуре МСК добавляют суспензию магнитных частиц. Магнитные частицы предварительно обрабатываю поверхностно-активными веществами для создания условий проникновения в цитоплазму клетки. Клетки инкубируют с частицами 24 ч в CO2-инкубаторе. После инкубации культуральную среду меняют и клетки 5-кратно отмывают от свободных магнитных частиц раствором Хенкса. Эффективность мечения МСК магнитными частицами по данной технологии составляет порядка 90%. Жизнеспособность стволовых клеток составляет 95%.

Готовый трехкомпонентный комплекс должен иметь форму двух полуцилиндров. Высота каждого полуцилиндра - 4 мм, внутренний радиус основания - 4 мм. Для этого выполняют заготовку в форме двух полуцилиндров, каждый высотой 4 мм и с внутренним радиусом основания 4 мм, из полимерного магнитного материала системы самарий-кобальт или ниодим-железо-бор с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл с многополюсным реверсивным намагничиванием. Толщина магнитного материала - 0,3 мм. Намагничивание полимерного магнитного материала может быть произведено, например, как описано в патенте РФ №2187162.

Из биологического материала, например, твердой мозговой оболочки или склеры, или коллагена, или аллопланта, или из синтетического мелкопористого материала, например, гидрогеля или дигеля, или полиэфирного полотна, или силиконовой губки и т.п. выполняют заготовку в форме двух полуцилиндров, каждый высотой 4 мм и с внутренним радиусом основания 4 мм, соответствующую заготовке из полимерного магнитного материала.

МСК, меченные магнитными микрочастицами, наслаивают на поверхность заготовки из биологического синтетического мелкопористого материала. Затем под чашку Петри с наслоенными на материал МСК, меченными магнитными микрочастицами, подводят внешнее магнитное поле с напряженностью 30 мТл. При этом размер и форма внешнего магнита соответствует размеру и форме заготовки из биологического или синтетического материала. Таким образом, между внешним магнитом и МСК, содержащими магнитные частицы, находится биологический или синтетический мелкопористый материал. МСК, содержащие магнитные частицы, быстро и глубоко транслоцируются в слои биологического или синтетического мелкопористого материала под действием магнитного поля. Их закрепление и распластывание происходит в течение 1-1,5 часов после нанесения. Закрепленные клетки прочно удерживаются в слоях пористого материала даже в токе культуральной жидкости, что моделировалось в эксперименте с использованием перистальтического насоса. Клетки, содержащие магнитные микрочастицы, пролиферируют, полностью покрывая поверхность биологического или синтетического мелкопористого материала, что доказывает сохранение функциональных свойств МСК.

В завершении полученную структуру «МСК - биологический или синтетический мелкопористый материал» прочно скрепляют, например, при помощи шовной фиксации или биологического клея с заготовкой из полимерного магнитного материала.

Трехкомпонентный комплекс имплантируют следующим образом. В нижне-внутреннем и верхне-наружном квадрантах, отступя от лимба 5 мм, выполняют два разреза конъюнктивы и теноновой оболочки на протяжении 7-8 мм, после чего тупым путем формируют два тоннеля к заднему полюсу глазного яблока навстречу друг к другу, затем в тоннели вводят и размещают трехкомпонентный комплекс, состоящий из двух полуцилиндров, которыми охватывают зрительный нерв, задние короткие цилиарные артерии и часть ретробульбарной клетчатки, не смыкая их. Операцию заканчивают наложением шва на конъюнктиву.

Изобретение поясняется следующими данными.

Под наблюдением находились 8 пациентов (8 глаз) в возрасте от 40 до 65 лет с атрофиями зрительного нерва различной этиологии. Острота зрения до лечения у пациентов варьировала от 0,05 до 0,125.

Пациенты были пролечены по предложенному способу.

Во всех случаях использовали трехкомпонентный комплекс в форме двух полуцилиндров, каждый высотой 4 мм, внутренний радиус основания - 4 мм, содержащий МСК, меченные магнитными микрочастицами, транслоцированные в биологический или синтетический мелкопористый материал, например, твердую мозговую оболочку или склеру, или коллаген, или синтетический мслкопористый материал, например, гидрогель или дигель, или полиэфирное полотно, или силиконовую губку, который скреплен с полимерным магнитным материалом системы самарий-кобальт или ниодим-железо-бор с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием.

В нижне-внутреннем и верхне-наружном квадрантах, отступя от лимба 5 мм, выполняли два разреза конъюнктивы и теноновой оболочки на протяжении 7-8 мм, после чего тупым путем формировали два тоннеля к заднему полюсу глазного яблока навстречу друг к другу, затем в тоннели вводили и размещали трехкомпонентный комплекс, состоящий из двух полуцилиндров, которыми охватывали зрительный нерв, задние короткие цилиарные артерии и часть ретробульбарной клетчатки, не смыкая их. Операцию заканчивали наложением обвивного непрерывного кетгутового шва на конъюнктиву.

Через 12 месяцев после лечения отмечено повышение остроты зрения во всех случаях от 0,05 до 0,1. У всех пациентов выявлено расширение границ поля зрения от 10 до 30 градусов, а также улучшение по данным ЭЛ и ПЭЧ. Линейная скорость кровотока в центральной артерии сетчатки во всех случаях увеличилась и составила в среднем 6,1±0,04 см/сек по сравнению с исходной 4,6±0,02 см/сек.

Таким образом, предложенный способ обеспечивает улучшение или стойкую стабилизацию зрительных функций, расширение границ поля зрения, ускорение гемодинамики в сетчатке и зрительном нерве.