СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОТРОПНОГО СРЕДСТВА КАК ОСНОВЫ ДЛЯ ПРЕПАРАТА "ИММУНОФЛАН"

Изобретение относится к относится к области медицины, конкретно к фармакологии и касается разработки средств, улучшающих, а в ряде случаев полностью нормализующих, иммунный статус организма.

В настоящее время известны иммунотропные средства синтетического, растительного и животного происхождения: тиролон, арбидол, кагоцел, циклоферон, эхинацея пурпурная и ряд адаптогенов с выраженным иммунотропным действием (родиола розовая, женьшень, цветки липы, пантокрин и др.). Известно использование Лофанта анисового как гепато-, кардиопротективного, дерматологического, урологического средства в народной медицине.

Известен фармакопейный метод получения флавоноидов [1], в котором измельченное сырье травы зверобоя заливают очищенной водой комнатной температуры в соотношении 1:10, взятом с учетом коэффициента водопоглощения настаивают на кипящей водяной бане в течение 15 мин, охлаждают 45 мин, процеживают, отжимая сырье, и прибавляют воду до требуемого объема извлечения. В настое, получаемом фармакопейным методом, содержание флавоноидов составляет 0,2%. [2].

Известен способ (патент №2158740 RU), при котором воздушно-сухое сырье травы зверобоя, измельченное до размеров частиц 2-3 мм, заливают очищенной водой комнатной температуры, взятой с учетом коэффициента водопоглощения в соотношении 1:6,6 и настаивают на кипящей водяной бане. Полученное извлечение отфильтровывают через ватный фильтр, затем в целях максимальной очистки от сопутствующих веществ извлечение помещают на колонку диаметром 5 см с 6 г полиамидного сорбента (ТУ 6-09-10-822-73) с размером частиц 0,1-0,25 мм. После прохождения через колонку всей жидкости сорбент обрабатывают 150 мл очищенной воды в три приема. Полноту очистки извлечения контролируют визуально в видимом и УФ-свете, а также качественной реакцией с 5%-ным спиртовым раствором алюминия хлорида (III). Для элюирования полифенолов используют 70%-ный этанол в количестве 50 мл, время прохождения через колонку 7-8 мин, скорость прохождения 70-80 капель в 1 мин. Количество элюирующей смеси, необходимой для полной десорбции флавоноидов, устанавливают экспериментально. Этанол из собранного элюата отгоняют при температуре выше 70°C, экстракт высушивают до постоянной массы. Выход флавоноидов в данном способе составляет 0,4-0,9%.

Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала средств, обладающих иммунотропной активностью, т.к. вопрос расширения группы иммунотропных средств является чрезвычайно актуальным, формируя социальный заказ на разработку и воспроизводство лекарственных средств, применяемых в различных сферах практической медицины, а также более эффективного способа получения средства с высоким выходом продукта (смеси флавоноидов).

Данная задача достигается за счет того, что в предлагаемом изобретении в качестве иммунотропного средства предлагается использовать смесь флавоноидов, полученных путем извлечения их из водно-спиртовой вытяжки листьев Лофанта анисового Lophanthus anisatus Benth (сортов «Астраханский 100» и «Астраханский 101») с размером частиц 1-3 мм, собранных в период цветения. Предлагаемый способ позволяет получить выход продукта (смеси флавоноидов) при экстракции в размере 3%.

Свойства полученной смеси флавоноидов Лофанта анисового как иммунотропного средства изучены в эксперименте на организме лабораторных животных в фоновых условиях, а также при циклофосфамидной иммунодепрессии. О наличии иммунотропной активности судили по следующим показателям: общее число лейкоцитов, популяционный состав лейкоцитарной формулы, клеточное (реакция гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) с определением индекса реакции), гуморальное (реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) с определением титра антител) и фагоцитарное (латексный тест по изучению фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови с определением фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа) звенья иммуногенеза. При постановке РГЗТ и РПГА в качестве антигенного стимула использовали эритроциты барана.

Осуществление заявляемого способа получения смеси флавоноидов их применение в качестве иммунотропного средства проиллюстрировано на нижеследующих примерах.

Пример 1. Способ получения иммунотропного средства заключается в следующем: 50 г воздушно-сухого сырья листьев Лофанта анисового с размером частиц 1-3 мм, собранных в период цветения, заливают 500 мл 60% водного раствора этанола и нагревают на водяной бане в течение 2.5 ч. Раствор охлаждают до 50°C и отфильтровывают, а растворитель выпаривают на роторном испарителе (остаточное давление 1-2 мм). Остаток растворяют в 200 мл воды, нагретой до температуры 50°C и экстрагируют 50 мл хлороформа. Водный слой отстаивают 24 ч при температуре 5°C. Осадок отфильтровывают и высушивают на воздухе. Получают 1,2 г смеси флавоноидов Лофанта анисового: выход составил 3% от массы воздушно-сухового сырья.

Пример 2. Исследовалось влияние смеси флавоноидов Лофанта анисового при курсовом пероральном введении в дозе 75 мг/кг на общее количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу.

Эксперимент проводился на половозрелых крысах линии Wistar. Животные были разделены на следующие группы: контрольная - особи, которые получали дистиллированную воду в эквивалентном объеме и опытная - особи получали смесь флавоноидов лофанта анисового при 10-ти дневном введении per os, в дозе 75 мг/кг. Результаты отражены в таб. №1.

Как видно из представленной таблицы, курсовое введение смеси флавоноидов Лофанта анисового в дозе 75 мг/кг сопровождается увеличением общего количества лейкоцитов более чем на 20%, изменениями лейкоцитарной формулы в сторону преобладания сегментоядерной фракции нейтрофилов, что указывает на усиление неспецифической иммунореактивности. Отсутствие увеличения числа эозинофилов позволяет говорить о том, что смесь флавоноидов лофанта анисового не проявляет сенсибилизирующего воздействия на организм лабораторных животных.

Пример 3. Исследовалось влияние смеси флавоноидов Лофанта анисового при курсовом пероральном введении в дозе 75 мг/кг на клеточное, гуморальное и фагоцитарное звенья иммуногенеза.

Эксперимент проводился на половозрелых крысах линии Wistar. Животные были разделены на следующие группы: контрольная - особи, которые получали дистиллированную воду в эквивалентном объеме и опытная - особи получали смесь флавоноидов Лофанта анисового при 10-ти дневном введении per os, в дозе 75 мг/кг. При постановке РГЗТ и РПГА в качестве антигенного стимула использовали эритроциты барана. Результаты отражены в таб. №2.

Представленные данные демонстрируют, что под влиянием флавоноидов Лофанта анисового происходит усиление клеточного ответа - показатель местной реакции ГЗТ увеличивался более чем на 35%. Кроме того, отмечена активация процессов фагоцитоза: фагоцитарный индекс и фагоцитарное число достоверно превышают показатели интактных животных, что так же, как и в примере 1, подтверждает, усиление неспецифической резистентности. Введение смеси флавоноидов лофанта анисового лабораторным животным не способствует изменению процессов антителообразования (таб. №2).

Пример 4. Исследовалась способность смеси флавоноидов Лофанта анисового при курсовом пероральном введении в дозе 75 мг/кг устранять нарушения в процессах лейкопоэза, развивающиеся при циклофосфамидной иммунодепрессии.

Эксперимент проводился на половозрелых крысах линии Wistar. Животные были разделены на следующие группы: контроль №1 (особи, которые получали дистиллированную воду в эквивалентном объеме), контроль №2 (животные с иммунодепрессией, вызванной однократным внутрибрюшинным введением циклофосфамида в дозе 150 мг/кг) и опытная (особи с иммунодепрессией, получавшие per os смесь флавоноидов Лофанта анисового в дозе 75 мг/кг курсом 10 дней). Полученные результаты отражены в таблице №3.

Как видно из представленной таблицы, однократное введение циклофосфамида в дозе 150 мг/кг сопровождается развитием выраженной цитопении (общее количество лейкоцитов уменьшается на 90%), происходит также резкое смещение лейкоцитарной формулы влево в связи с увеличение процентного содержания палочкоядерных нейтрофилов. Введение смеси флавоноидов животным с экспериментальной иммунодепрессией сопровождается восстановлением общего числа лейкоцитов до 36% от исходного уровня и тенденцией к нормализации лейкоцитарной формулы (таб. №3).

Пример 5. Исследовалась способность смеси флавоноидов Лофанта анисового при курсовом пероральном введении в дозе 75 мг/кг устранять иммунные нарушения, развивающиеся при циклофосфамидной иммунодепрессии.

Эксперимент проводился на половозрелых крысах линии Wistar. Животные были разделены на следующие группы: контроль №1 (особи, которые получали дистиллированную воду в эквивалентном объеме), контроль №2 (животные с иммунодепрессией, вызванной однократным внутрибрюшинным введением циклофосфамида в дозе 150 мг/кг) и опытная (особи с иммунодепрессией, получавшие per os смесь флавоноидов Лофанта анисового в дозе 75 мг/кг курсом 10 дней). Полученные результаты отражены в таблице №4.

Представленные в таблице №4 данные демонстрируют, что индукция иммунодепрессии однократным введением циклофосфамида в дозе 150 мг/кг сопровождается усилением реакции на корпускулярный антиген (показатель реакции ГЗТ увеличился более чем в 5 раз) с одновременным снижением титра антиэритроцитарных антител (показатель РПГА уменьшился более чем в 2 раза). Активация в данном случае индекса РГЗТ при одновременном подавлении антителообразования обусловлена усилением активности Т-супрессорного звена иммунитета, что в итоге привело к угнетению антиэритроцитарного иммунного ответа. При введении смеси флавоноидов Лофанта анисового на фоне индуцированной патологии отмечалось практически восстановление местной реакции (более чем в 3 раза) и усиление процесса образования антиэритроцитарных антител (более чем в 1,5 раза) по сравнению с группой животных с иммунодепрессией (таб. №4).

Таким образом, полученные в ходе доклинических испытаний, данные об иммунотропных и иммунотерапевтических свойствах смеси флавоноидов Лофанта анисового дают основания для использования данного средства как основы для разработки нового препарата «Иммунофлан», который может выпускаться в виде высушенного сырья, настоек и таблеток.

Литература.

1. Государственная фармакопея СССР XI, вып.2, с.147.

2. Фармация, 1994., N1, с.30-34.