Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ R-БРУЦЕЛЛЕЗНОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА)

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способам изготовления диагностических препаратов, применяемых при серологических исследованиях в ветеринарии и может быть использовано в медицине.

Известен способ приготовления антигена для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза у животных, включающий получение бактериальной массы штамма В.abortus R-1096 и инактивацию ее путем гамма-облучения [SU 946039 А, 05.02.79 г.]. Однако антиген, полученный таким способом, используется только для постановки реакции агглютинации и реакции связывания комплемента.

Известен также способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе, включающий приготовление формалинизированных эритроцитов барана, их обработку додецилсульфатом натрия в 1% концентрации при 50-60°С в течение 30 минут, с последующей сенсибилизацией сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы бруцелл штамма В.abortus 19, смывом ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивацией, экстрагированием и отделением сенситина центрифугированием [RU 2283498 С1, 22.02.2005 г.].

Данный способ получения бруцеллезного антигена для РНГА при бруцеллезе не позволяет получить антиген для выявления в сыворотке крови R-гемагглютининов, т.к. для его изготовления используют штамм бруцелл в S-форме.

Техническим результатом изобретения является получение активного и специфичного R-бруцеллезного эритроцитарного антигена для выявления в сыворотке крови R-бруцеллезных антител в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Технический результат способа изготовления R-бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации достигается приготовлением формалинизированных эритроцитов барана, с последующей их сенсибилизацией сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы В.abortus 16/4, смывом ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивацию, экстрагирование, отделение сенситина центрифугированием, воздействием на бактериальные клетки 0,5% концентрацией додецилсульфата натрия при температуре 68-70°С в течение 60 минут.

Способ осуществления. Трехсуточную агаровую культуру бруцелл вакцинного штамма В.abortus 16/4 смывают 12% раствором хлорида натрия, фильтруют и подвергают автоклавированию при 1 атм. (120°С) в течение 20-30 минут, доводят концентрацию бруцелл до 40-50 млрд м.к. в 1 мл 12% раствором NaCl. К бактериальной взвеси добавляют 0,5% додецилсульфата натрия, после чего ее нагревают в водяной бане при температуре 68-70°С в течение 60 минут, при периодическом перемешивании. Взвесь декантируют путем центрифугирования при 8-10 тыс об/мин в течение 60 минут, полученный экстракт используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана.

Формалинизацию эритроцитов барана проводят по методу R.Weinbach (1958), при этом концентрация формальдегида в процессе обработки эритроцитов составляет 1,5%, соотношение фиксатора и эритроцитов 0,375:1. Полученную взвесь эритроцитов с формальдегидом переносят в термостат и формалинизируют при температуре 37-38°С в течение 18-20 часов. После окончания формалинизации эритроциты отмывают от избытка формалина 3 раза 10-кратным объемом физиологического раствора на центрифуге при 1000-1500 об/мин в течение 10-15 минут (Каральник Б.Н. Эритроцитарные диагностикумы. - М., Медицина. - 1976. - 164 с.).

В таблице 1 представлены результаты воздействия на бактериальную массу с целью извлечения сенситина разных концентраций додецилсульфата натрия.

Анализ данных таблицы 1 показывает, что оптимальной концентрацией детергента при изготовлении R-антигена является 0,5% додецилсульфата натрия, при этом специфичный эритроцитарный антиген с заданной активностью не ниже 1:3200 при титрации с R-бруцеллезной сывороткой можно получить при соотношении формалинизированных эритроцитов и сенситина 1:0,5. При применении 0,25% концентрации додецилсульфата в процессе извлечения сенситина диагностикум не обладает достаточной активностью. При использовании додецилсульфата натрия в концентрации 1,0% эритроцитарный диагностикум становится неспецифичным, получены положительные результаты с негативной сывороткой крупного рогатого скота в разведении 1:50 и выше и с физиологическим раствором.

Сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов проводят оптимальной дозой сенситина, которую определяют путем титрации его с использованием R-бруцеллезной агглютинирующей сыворотки. При титрации сенситина для сенсибилизации эритроцитов к 1 мл 5,0% взвеси эритроцитов добавляют его в количествах 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2; 3,0 мл. Результаты испытания специфичности R-бруцеллезного эритроцитарного антигена представлены в таблице 2.

Из представленных в таблице 2 данных следует, что предложенный способ позволяет получить специфичный R-бруцеллезный эритроцитарный антиген, т.к. позволяет получить отрицательные результаты РИГА у здоровых и сенсибилизированным бруцеллезным S-антигеном животных. Результаты испытания активности R-бруцеллезного антигена отражены в таблице 3.

Из таблицы 3 следует, что R-бруцеллезный эритроцитарный антиген обладает активностью, так гемагглютинины в сыворотке крови кроликов, зараженных R-формой бруцелл, содержались в титре от 1:100 до 1:3200, в сыворотке крови крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В.abortus 82 от 1:200 до 1:3200.

Определение чувствительности R-бруцеллезного эритроцитарного антигена проводили при исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма В.abortus 82, в благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах (таб. 4, 5).

Обследование благополучного по бруцеллезу крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В.abortus 82, показало, что с помощью R-бруцеллезного эритроцитарного антигена на протяжении 210 суток удалось обнаружить от 11,5 до 86,4% реагирующих животных.

Данные таблицы 5 показывают, что R-бруцеллезные антитела в сыворотке крови больных бруцеллезом животных, привитых вакциной из штамма В.abortus 82 (SR-форма), можно диагностировать с помощью R-бруцеллезного эритроцитарного антигена, изготовленного данным способом, в разные сроки после иммунизации животных.

Предлагаемый R-бруцеллезный эритроцитарный антиген обладает специфичностью и чувствительностью, его используют в лаборатории ГНУ ВНИИБТЖ при проведении контроля иммунного ответа у крупного рогатого скота, иммунизированного противобруцеллезными вакцинами, а также при оздоровлении неблагополучных по бруцеллезу хозяйств с целью сохранения от необоснованного убоя животных с поствакцинальными реакциями.