Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ НЕХОДЖКИНСКИХ ЛИМФОМ

Изобретение относится к медицине, а именно, к гематологии, может быть использовано для прогнозирования индолентной, агрессивной и высокоагрессивной формы неходжкинских лимфом.

Неходжкинские лимфомы - это злокачественные опухоли с быстрым ростом заболеваемости во всем мире. За последние 20 лет заболеваемость увеличилась более чем на 50% в развитых странах, то есть темп прироста заболеваемости НХЛ превышает таковой при лимфоме Ходжкина. В России НХЛ составляют 2,55% от всех злокачественных опухолей; в 2002 г. выявлено 5532 новых случая. Стандартизованный показатель заболеваемости среди мужчин составил 8,2, а среди женщин - 7,2 на 100000.

Основными моментами, определяющими клинические черты заболевания и прогноз, являются стадия дифференцировки клеток, из которых состоит опухоль, и характер роста внутри вовлеченного лимфоузла (фолликулярный или диффузный). Достижения иммунологии, цитогенетики и молекулярной биологии позволяют выделять специфические субтипы лимфом, различающиеся клиническим течением, ответом на терапию и прогнозом.

К индолентной форме НХЛ относят лимфомы: мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, лимфомы селезенки, нодальные и экстранодальные лимфомы, фолликулярные лимфомы 1-2 тип, грибовидный микоз, ангиоиммунобластную лимфому, анапластическую крупноклеточную лимфому (ALK+). К агрессивным относят: фолликулярную лимфому 3 типа, диффузную В-крупноклеточную лимфому, первичную медиастинальную В-крупноклеточную лимфому, плазмоцитомы, анапластическую крупноклеточную лимфому (ALK-). К высокоагрессивным форме относят:

В-лимфобластную лимфому, лимфому зоны мантии, лимфому Беркита, переферические Т-клеточные лимфомы, тонкокишечную Т-клеточную лимфому. Ценность прогнозирования форм НХЛ заключается в раннем прогнозировании течения заболевания, раннем прогнозировании исхода и правильном выборе адекватной химиотерапии.

Известен способ ультразвукового прогнозирования лечения неходжкинских лимфом (Сидоренко Ю.С., Максимова Н.А., Айрапетов К.Г., Верховцева А.И.), основанный на ультразвуковом исследовании лимфоузлов [патент RU 2211665,

2003 г.]. Недостатком данного способа является: поздняя диагностика, которая проходит уже в разгар заболевания и невозможность оценить клетки происхождения опухоли.

Также известен способ прогнозирования варианта течения неходжкинских лимфом (Левитан Н.В., Лосева М.И.), заключающийся в определении в периферической крови больного процентного содержания лимфоидных клеток с повышенным уровнем активности нуклеолярного аппарата и находящихся в стадии S/G2 клеточного цикла [патент RU 2082976, 1997 г.]. Недостатками данного способа является то, что данный способ достаточно трудоемок, занимает долгое время, и для проведения данного исследования необходимы высокоподготовленные кадры. Также с помощью этого метода невозможна ранняя и превинтивная диагностика.

Прототипом данного изобретения является способ определения предрасположенности человека к развитию агрессивных неходжкинских лимфом (Воропаева Е.Н., Поспелова Т.И., Ковынев И.Б., Воевода М.И., Скворцова Н.В., Лямкина А.С.), основанный на определении генотипа 399-го кодона гена XRCC1 [патент RU 2373862, 2009 г.]. Недостатками данного метода является определение только агрессивной формы заболевания, не определяют индолентную и высокоагрессивную форму.

Техническим результатом изобретения является повышение точности прогнозирования формы НХЛ, получение дополнительного критерия при оценке и прогнозе НХЛ.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования течения неходжкинских лимфом, включающем выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови с последующими ПЦР и рестрикцией продуктов амплификации, согласно изобретению проводят генотипирование полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 и при выявлении у больного генотипа ТТ прогнозируют индолентную форму неходжкинских лимфом, генотипа TG прогнозируют агрессивную форму неходжкинских лимфом, генотипа GG прогнозируют высокоагрессивную форму неходжкинских лимфом.

Предлагаемый способ прогнозирования течения НХЛ осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0.48% лимонной кислоты, 1.32% цитрата натрия, 1.47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 4 мл крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press.; - 1984. - V.2. - P.31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляли 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трисHCl (pH 7,6).

2. Смесь центрифугируется 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, pH 8.0, суспендируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°C.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1М трисHCl до pH 7.8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной H₂O; раствор хранят при -20°C.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательность олигонуклеотидных праймеров для полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 F: 5'-CGCGGGAGTTCAGGGTAAAG-3', 5'-CTGAGTCAACCTGCCCACTG-3'. Состав реакционной смеси для ПЦР был следующим: 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещали в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6.7 mM MgCl2, 16,6 тМ (NH4)2SO4, 0.01% Tween-20. Полученную смесь прогревают 2 минуты при 940C, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 940C - 45 секунд, 550C - 45 секунд, 720C - 45 секунд. После 30-го цикла проводили инкубацию при 720C в течение 7 минут.

Нуклеотидную замену T→G в положении 309 гена MDM2 выявляют при помощи рестрикционного анализа. Для этого 7 мкл амплификата смешивают с 5 ед. эндонуклеазы рестрикции Msp А II, смесь выдерживают при 37°C в течение 10-12 часов в термостате. Затем проводят электрофорез в вертикальном 7% полиакриламидном геле. В качестве электролита для электрофореза применяют 1X боратный буфер (0,089 М трис HCl pH=7,8; 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА с pH=8,0).

Перед нанесением на вертикальный электрофорез пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят в при постоянном напряжении 10 вольт/см после 15-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромистым этидием в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Генотипы полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 типируются по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции и соответствующего фрагмента на электрофорезе так, что при наличии фрагмента размером 157 пар нуклеотидов (пн) идентифируется аллель Т и гомозиготный генотип ТТ, при наличии двух фрагментов размером 157 и 109 пн идентифицируется гетерозиготный генотип TG, при наличии фрагмента размером 109 пн идентифицируется гомозиготный по редкому аллелю генотип GG. При генотипировании полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 генетическим маркерами индолентной формы НХЛ были генотип ТТ, агрессивной формы генотип TG, высокоагрессивной формы генотип GG.

Нами проанализированно течение и исходы заболевания у 115 больных НХЛ в возрасте от 17 до 88 лет (средний возраст 52,5±3,1 лет), которым проводилось лечение в гематологическом отделении РКБ им. Г.Г. Куватова г.Уфа в 2005-2011 годах. Клиническое и гистологическое обследование больных проводилось врачами больницы и включало в себя обязательные и дополнительные методы исследования.

Проведен анализ ассоциаций между индолентной, агрессивной и всокоагрессивной формами НХЛ и генотипами полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 (таблица).

При проведении статистического анализа ассоциаций между исследованным полиморфным локусом и формой НХЛ была обнаружена ассоциация между полиморфным локусом 309T>G гена MDM2 и различными формами НХЛ. Так в группе больных с индолентной формой НХЛ чаще встречался генотип ТТ (χ2=11,26; p=0,01). В группе больных агрессивной формой заболевания статистически значимо чаще встречался гетерозиготный генотип TG (χ2=3,92; p=0,05), а в группе с высокоагрессивной формой НХЛ чаще встречался генотип GG (χ2=25,50; p=0,01). Таким образом маркером индолентной формы НХЛ являлся генотип ТТ (OR=4,65), агрессивной формы генотип TG (OR=2,43), высокоагрессивной формы генотип GG (OR=13,67).

Для иллюстрации приведем клинические примеры:

Пример 1. Пациентка Б-ва 1974 года рождения, г.Уфа, Республика Башкортостан. Диагноз НХЛ установлен в июне 2010 года. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Msp А II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлен генотип ТТ, что позволило прогнозировать индолентную форму. Что подтвердилось при наблюдении за пациентом: пациент ответил на монотерапию алкилирующими препаратами, ухудшения не наблюдалось.

Пример 2. Пациентка Р-ва 1978 года рождения, г.Уфа, Республика Башкортостан. Диагноз НХЛ установлен в августе 2007 года. При молекулярно-генетическом тестировании у больной было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Msp А II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлен генотип TG, что позволило прогнозировать агрессивную форму. Что подтвердилось при наблюдении за пациентом: пациент не отвечал на монотерапию, ответ наблюдался при проведении полихимиотерапии.

Пример 3. Пациент П-в 1981 года рождения, г.Стерлитамак, Республика Башкортостан. Диагноз НХЛ установлен в сентябре 2009 года. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Msp AII провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлен генотип GG, что позволило нам прогнозировать высокоагрессивную форму. Что подтвердилось при наблюдении за пациентом: пациент не отвечал на все виды лечения. Выживаемость 3 месяца.