Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ В-КЛЕТОЧНЫХ И Т-КЛЕТОЧНЫХ НЕХОДЖКИНСКИХ ЛИМФОМ

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, может быть использовано для прогнозирования развития В-клеточных и T-клеточных неходжкинских лимфом, ответа на проводимую химиотерапию при хроническом лимфолейкозе.

Неходжкинские лимфомы (НХЛ) - это группа злокачественных опухолей, развивающихся из лимфоидной ткани и различающихся по биологическим свойствам, морфологическому строению, клиническим проявлениям, ответу на терапию и прогнозу. В России на долю НХЛ приходится 2,6% всех злокачественных новообразований. В последние годы заболеваемость НХЛ имеет неизменную тенденцию к росту. Несмотря на улучшение результатов терапии, связанное с применением высокодозной программной химиотерапии, смертность от НХЛ увеличивается приблизительно на 2% в год. Это определяет необходимость дальнейшего изучения механизмов злокачественной трансформации лимфоидных клеток и поиска новых диагностических показателей развития НХЛ.

Различают НХЛ про происхождению из B-клеточного звена и T-клеточного звена. К B-клеточным лимфомам относят: мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, фолликулярную лимфому 3 типа, диффузную B-крупноклеточную лимфому, первичную медиастинальную В-крупноклеточную лимфому, плазмоцитомы, B-лимфобластную лимфому, лимфому зоны мантии, лимфому Беркита. К T-клеточным лимфомам относят: грибовидный микоз, ангиоиммунобластную лимфому, анапластическую крупноклеточную лимфому, переферические T-клеточные лимфомы, тонкокишечную T-клеточную лимфому. Ценность прогнозирования развития B-клеточных и T-клеточных лимфом заключается в раннем прогнозировании течения заболевания, раннем прогнозировании исхода и правильном выборе адекватной химиотерапии.

Известен способ ультразвукового прогнозирования лечения неходжкинских лимфом (Сидоренко Ю.С., Максимова Н.А., Айрапетов К.Г., Верховцева А.И.), основанный на ультразвуковом исследовании лимфоузлов [патент RU 2211665, 2003 г.] Недостатком данного способа является: поздняя диагностика, которая проходит уже в разгар заболевания и невозможность оценить клетки происхождения опухоли.

Также известен способ прогнозирования варианта течения неходжкинских лимфом (Левитан Н.В., Лосева М.И.), заключающийся в определении в периферической крови больного процентного содержания лимфоидных клеток с повышенным уровнем активности нуклеолярного аппарата и находящихся в стадии S/G2 клеточного цикла [патент RU 2082976, 1997 г.]. Недостатками данного способа является то, что данный способ достаточно трудоемок, занимает долгое время и для проведения данного исследования необходимы высокоподготовленные кадры. Также с помощью этого метода невозможны ранняя и превентивная диагностика и определение клеточного происхождения.

Прототипом изобретения является способ определения предрасположенности человека к развитию агрессивных неходжкинских лимфом (Воропаева Е.Н., Поспелова Т.Н., Ковынев И.Б., Воевода М.И., Скворцова Н.В., Лямкина А.С.), включающий определение генотипа 399-го кодона гена XRCC1 [патент RU 2373862, 2009 г.]. Недостатком данного метода является определение только агрессивной В-клеточной формы заболевания.

Техническим результатом изобретения является повышение точности прогнозирования формы НХЛ, получение дополнительного критерия при непонятной гистологической картине заболевания.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования формы неходжкинских лимфом, включающем выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови с последующими ПЦР и рестрикцией продуктов амплификации, согласно изобретению проводят генотипированием полиморфного локуса -248G>A гена Bcl-2 ассоциированного X белка (BAX -248G>A), и при выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития В-клеточной формы неходжскинских лимфом, генотипа GA или аллела A прогнозируют высокую вероятность развития T-клеточной формы неходжкинских лимфом..

Предлагаемый способ прогнозирования развития B-клеточных и T-клеточных НХЛ осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0,48% лимонной кислоты, 1,32% цитрата натрия, 1,47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 4 мл крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press; - 1984. - V.2. - P.31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляли 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трисHCl (рН 7,6).

2. Смесь центрифугируется 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, рН 8,0, суспендируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1М трисHCl до рН 7,8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной H₂O, раствор хранят при - 20°C.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательность олигонуклеотидных праймеров для полиморфного локуса -248G>A гена BAX F: 5'-5'-CATTAGAGCTGCGATTGGACCG-3', R: 5'-GCTCCCTCGGGAGGTTTGGT-3'. Состав реакционной смеси для ПЦР был следующим: 0,1-1 мкг геномной ДНК, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещали в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, рН 8,8, 6,7 mM MgCl₂, 16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween-20. Полученную смесь прогревают 2 минуты при 94°C, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 94°C - 45 секунд, 55°C - 45 секунд, 72°С - 45 секунд. После 30-го цикла проводили инкубацию при 72°C в течение 7 минут.

Нуклеотидную замену G→A в положении - 248 гена BAX выявляют при помощи рестрикционного анализа. Для этого 7 мкл амплификата смешивают с 5 ед. эндонуклеазы рестрикции Msp I, смесь выдерживают при 37°C в течение 10-12 часов в термостате. Затем проводят электрофорез в вертикальном 7% полиакриламидном геле. В качестве электролита для электрофореза применяют 1X боратный буфер (0,089 М трис HCl pH=7,8; 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА с pH=8,0).

Перед нанесением на вертикальный электрофорез пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 10 вольт/см после 15-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромистым этидием в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Генотипы полиморфного локуса - 248 гена BAX типируются по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции и соответствующего фрагмента на электрофорезе так, что при наличии фрагмента размером 96 пар нуклеотидов (пн) идентифируется аллель G и гомозиготный генотип GG, при наличии двух фрагментов размером 96 и 76 пн идентифицируется гетерозиготный генотип GA, при наличии фрагмента размером 76 пн идентифицируется гомозиготный по редкому аллелю генотип АА. При выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития B-клеточной формы неходжкинских лимфом, генотипа GA или аллели A - высокую вероятность развития T-клеточной формы неходжкинских лимфом.

Нами оценена эффективность терапии 120 больных НХЛ в возрасте от 17 до 88 лет (средний возраст 52,8±3,4 лет), которым проводилось лечение в гематологическом отделении РКБ им. Г.Г. Куватова, г.Уфа, в 2005-2011 годах. Клиническое и гистологическое обследование больных проводилось врачами больницы и включало в себя обязательные и дополнительные методы исследования.

Проведен анализ ассоциаций между B-клеточной и T-клеточной формами НХЛ и генотипами полиморфного локуса - 248 гена BAX (таблица).

При проведении статистического анализа ассоциаций между исследованным полиморфным локусом и формой НХЛ была обнаружена ассоциация между полиморфным локусом -248 гена BAX и B-клеточными НХЛ. Так у больных с генотипом GG чаще встречалась B-клеточная форма НХЛ (χ2=9,15; p=0,003). Риск при наличии данного генотипа повышен практически в 4 раза (OR=3,75; 95% CI 1,65-8,54). У пациентов с генотипом GA и аллелем А напротив чаще встречалась T-клеточная форма НХЛ (χ2=4,29; р=0,039; χ2=11,46; p=0,002, соответственно).

Для иллюстрации приводим следующие клинические примеры.

Пример 1. Пациентка А-ва 1972 года рождения, г.Стерлитамак, Республика Башкортостан. Диагноз НХЛ установлен в октябре 2008 года. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена и в реакционной смеси, содержащей примерно 0,1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Hin1II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлен генотип GG, что позволило нам прогнозировать B-клеточное происхождение лимфомы. Прогноз подтвердился при гистологическом исследовании тканей опухоли (диффузная B-крупноклеточная лимфома).

Пример 2. Пациент Д-в 1982 года рождения, г.Ишимбай, Республика Башкортостан. Диагноз НХЛ установлен в ноябре 2009 года. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена и в реакционной смеси, содержащей примерно 0,1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Hin1II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлен генотип GA, что позволило нам прогнозировать T-клеточное происхождение лимфомы. Прогноз подтвердился при гистологическом исследовании тканей опухоли (анапластическая крупноклеточная лимфома (ALK-)).

Пример 3. Пациентка Х-ва 1956 года рождения, г.Салават, Республика Башкортостан. Диагноз НХЛ установлен в январе 2011 года. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена и в реакционной смеси, содержащей примерно 0,1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Hin1II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлено наличие аллеля А, что позволило нам прогнозировать Т-клеточное происхождение лимфомы. Прогноз подтвердился при гистологическом исследовании тканей опухоли (периферическая Т-клеточная лимфома).