Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ ОЦЕНКИ РАЗЛИЧНЫХ УРОВНЕЙ ПОРАЖЕНИЯ СТРУКТУР ВЕГЕТАТИВНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и может быть использовано для выявления поражения периферических структур симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы на ганглионарном уровне и на уровне эффекторного органа у широкого круга пациентов, а также на надсегментарном уровне.

Сведения о вегетативных нарушениях и их локализации могут содействовать решению вопроса о характере и расположении патологического процесса. Иногда особую значимость имеет выявление признаков вегетативного дисбаланса. Изменение функций гипоталамуса и других надсегментарных структур вегетативной нервной системы ведет к генерализованным вегетативным расстройствам. Поражение вегетативных ядер в стволе мозга и спинном мозге, а также периферических отделов вегетативной нервной системы обычно сопровождается развитием сегментарных вегетативных расстройств в более или менее ограниченной части тела. Изучение состояния вегетативных функций может дать важную информацию о наличии у больного функционального или органического поражения нервной системы, нередко способствуя решению вопроса о топическом и нозологическом диагнозе.

Известные клинические (дермографизм, пупиллометрия, пиломоторный рефлекс, динамика артериального давления и частоты сердечных сокращений в орто-, клиностатических и рефлекторных пробах с вычислением разнообразных коэффициентов и т.д.) и электрофизиологические (измерение R-R интервала при различных нагрузках, оценка кожно-гальванического рефлекса и др.) способы исследования позволяют установить преобладание симпатического или парасимпатического отдела вегетативной нервной системы (ВНС) при различных патологических состояниях. Известен также способ оценки состояния ВНС с проведением фармакологических проб (адрено- и холиноактивные средства) на наличие вегетативной дисфункции и в ряде случаев локализации уровня ее поражения. Однако введение этих (в основном сильнодействующих группы А) препаратов связано с риском развития выраженных побочных эффектов, особенно у пациентов с органическим поражением жизненно важных структур периферического отдела ВНС. (В кн. Вегетативные расстройства. Клиника, диагностика, лечение. Под ред. А.М.Вейна. - М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2003, с.44-102). Однако эти методы не позволяют установить причину и уровень поражения ВНС.

Наиболее близкими к изобретению являются способ выявления поражения отдельных структур периферического отдела ВНС путем определения антител к ганглионарной субъединице α3-ацетилхолинового рецептора (α3-АХР) и антител к другим антигенным мишеням методом радиоиммунопреципитации у пациентов с неврологическими и онкологическими заболеваниями. При этом 1% больных был серопозитивным (уровень антител к α3-АХР от 0,03 до 18,8 нмоль/л, в контроле ≤0,02 нмоль/л), большинство составили больные с пандизавтономией, ограниченной дизавтономией, периферической полиневропатией, энцефалопатией, а также некоторыми онкологическими (карциномы и аденокарциномы различной локализации, тимома, рак щитовидной железы и др.) заболеваниями (Мс Keon A., Lennon V.A., Lachance D.H., Fealcy R.D., Pittock S.J. Ganglionic Acetylcholine Receptor Autoantibody. Oncological, Neurological, and Serological Accompaniments. Arch. Neurol. 2009. Vol.66 (№6), 735-741).

Данный способ позволяет установить уровень поражения ВНС за счет радиоиммунологического определения антител в сыворотке крови, однако он трудоемок в исполнении, так как предполагает работу с радиоактивными изотопами, клеточными культурами, биологическим материалом, полученным от животных, что требует специального оборудования, помещений и соответственно существенных капиталовложений.

Предлагаемый нами способ является более дешевым и безопасным для определения специфических антител в сыворотке крови по взаимодействию со следующими антигенами: α3-АХР, β2-АР, ФРН, методом твердофазного иммуноферментного анализа. Кроме того, данный способ позволяет при той же специфичности более простым и экономичным путем (в частности не требующим мер защиты от радиации и работы с клетками) осуществить диагностику различных уровней поражения структур ВНС.

Технический результат достигается тем, что для оценки различных уровней поражения вегетативной нервной системы проводят исследование сыворотки крови, при этом в образцах сыворотки крови определяют методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) аутоантитела к ганглионарной субъединице а3-ацетилхолинового рецептора (α3-АХР), β2-адренорецептору (β2-АР) и фактору роста нервов (ФРН), измеряют на ИФА-анализаторе оптическое поглощение света (OD) в образцах при длине волны 450 нм и при значении уровня аутоантител к α3-АХР 0,24 и более, уровня аутоантител к β2-АР менее 0,24 и уровня аутоантител к ФРН менее 0,37 оценивают поражение структур вегетативной нервной системы на ганглионарном уровне, при значении уровня аутоантител к α3-АХР менее 0,24, уровня аутоантител к β2-АР 0,24 и более и уровня аутоантител к ФРН 0,37 и более оценивают поражение структур вегетативной нервной системы на уровне эффекторного органа, при отсутствии аутоантител к α3-АХР, β2-АР и ФРН оценивают поражение структур вегетативной нервной системы на надсегментарном уровне.

Способ осуществляют следующим образом.

Пациенту производят забор крови из кубитальной вены, затем отделяют сыворотку от кровяного сгустка путем центрифугирования в течение 15 минут при 3000 об/мин.

Сыворотку тестируют на наличие антител к α3-АХР, β2-АР, ФРН в тИФА.

В качестве антигена для определения аутоантител методом тИФА используют рекомбинантные протеины: α3-АХР, β2-АР, ФРН, полученные методом генетической инженерии в лаборатории готовых лекарственных форм Центра «Биоинженерия» РАН (рук. лаб. - к.б.н. Зейналов О.А.).

Для количественного определения уровня аутоантител к α3-АХР, β2-АР, ФРН проводят следующий этап тИФА.

На 96-ти луночные планшеты фирмы «Costar» сорбируют домен α3-АХР, β2-АР, ФРН в концентрации 2 мкг/лунку, 4 мгк/лунку, 4 мкг/лунку и инкубируют в течение 60 минут при температуре 37°С. Первый ряд лунок оставляют свободным для коньюгатного контроля. Для блокирования неспецифического связывания в лунки вносят 2% раствор BSA (Sigma) в PBS/Твин-20 по 200 мкл/лунку и инкубируют 60 минут при температуре 37°С. После инкубации во второй ряд вносят сыворотки контрольных доноров, во все последующие ряды - вносят сыворотки больных в разведении 1:100 и инкубируют 60 мин при 37°С с последующим 3-х кратным отмыванием (0,2% BSA в PBS/Твин-20 по 200 мкл/лунку) в течение 3-х минут. Наличие антител определяют окрашиванием с использованием коньюгата пероксидазы с анти-IgG человека (Sigma), который вносят по 100 мкл/лунку при разведении 1:1000 и инкубируют 60 минут при температуре 37°С, после чего проводят 3-х кратное отмывание (0,2% BSA в PBS/Твин-20 по 200 мкл/лунку) в течение 3-х минут. В качестве хромогена используют тетраметиленбензидин (Sigma): 10 мг растворяют в 5 мл цитратного буфера (рН 4,5) и 15 мкл пероксида водорода и вносят по 100 мкл/лунку. Окрашивание развивалось в течение 20 минут. Торможение реакции осуществляют 0,25 М раствором серной кислоты - 100 мкл/лунку. Измерение оптического поглощения света при длине волны 450 нм проводят на ИФА-анализаторе.

Результаты выражают в единицах оптической плотности (OD). Высоким уровнем антител считались показатели: для α3-АХР - более 0,24 OD450 нм, для β2-АР также более 0,24 OD450 нм и для ФРН - более 0,37 OD450 нм.

Причем при значении уровня аутоантител к α3-АХР 0,24 и более, уровня аутоантител к β2-АР менее 0,24 и уровня аутоантител к ФРН менее 0,37 оценивают поражение структур вегетативной нервной системы аутоиммунного генеза на ганглионарном уровне. При значении уровня аутоантител к α3-АХР менее 0,24, уровня аутоантител к β2-АР 0,24 и более и уровня аутоантител к ФРН 0,37 и более оценивают поражение структур вегетативной нервной системы аутоиммунного генеза на уровне эффекторного органа. При полном отсутствии аутоантител к α3-АХР, β2-АР и ФРН оценивают поражение структур вегетативной нервной системы на надсегментарном уровне.

Таким образом, способ, предлагаемый нами, отличается от известного уровня техники следующим:

1) позволяет проводить оценку ВНС с высокой точностью за счет исследования крови пациентов разработанным нами методом тИФА в сыворотке крови по взаимодействию с тремя антигенами α3-АХР, β2-АР, ФРН;

2) позволяет оценить уровень поражения ВНС;

3) позволяет отказаться от использования радиоактивных изотопов в качестве реагентов при выполнении методики;

4) позволяет проводить диагностику, дифференциальную диагностику, объективизировать динамику патологического процесса, а также облегчает выбор адекватной терапии у больных с признаками периферической вегетативной недостаточности (ПВН);

5) является более экономичным и не менее чувствительным по сравнению с другими методами;

6) не требует введения в организм пациентов сильнодействующих лекарственных препаратов, находящихся на специальном учете;

7) позволяет количественно определять концентрацию аутоантител к α3-АХР, β2-АР, ФРН и позволяет диагностировать аутоиммунное поражение периферического отдела ВНС на уровне поражения периферических структур симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы на ганглионарном, эффекторного органа уровнях, а также и надсегментарном уровне, не связанных с аутоиммунным поражением.

Примеры реализации способа

Пример 1

Больная Б., 58 лет, наблюдалась в клинике нервных болезней им. Кожевникова I МГМУ им. И.М.Сеченова с признаками периферической вегетативной недостаточности, прогрессирующей в течение 8 лет: синдром Горнера справа, нарушение аккомодации с извращенной реакцией зрачков в пробе с адреналином, обратная реакция артериального давления в клиностатической и ортостатической пробах (повышение в положении лежа и существенное снижение в положении стоя), отсутствие динамики частоты сердечных сокращений при изменении позы, смена запоров учащенным жидким стулом (до 13-16 раз за ночь), слабость в положении стоя и сидя, невозможность передвигаться без утягивающей одежды, быстрая утомляемость, сухость кожи и слизистых оболочек с проксимальным гипергидрозом. Получала симптоматическую терапию (усиленный водный режим, минералокортикоиды, утягивающая одежда) с незначительным временным эффектом на фоне прогрессирования заболевания. Проведенное исследование сыворотки крови пациентки предлагаемым способом выявило значительное повышение уровня аутоантител к α3-АХР - 1,79 OD_{450 нм}. А также снижение уровня аутоантител к β2-АР - 0,14 OD_{450 нм} и уровня аутоантител к ФРН - 0,17 OD_{450 нм}. Это указывает на поражение периферических структур вегетативной нервной системы аутоиммунного генеза на ганглионарном уровне.

На основании анализа был поставлен диагноз аутоиммунной вегетативной ганглиопатии, минералокортикоиды были заменены на глюкокортикоиды, состояние больной постепенно улучшилось на фоне иммуносупрессивной терапии.

Пример 2

Больная У., 36 лет наблюдается в клинике нервных болезней им. Кожевникова 1 МГМУ им. И.М.Сеченова с признаками периферической вегетативной недостаточности: ортостатическая гипотензия, эректильная дисфункция, гипогидроз кожи с сухостью слизистых оболочек. Проведенное исследование сыворотки крови пациентки методом твердофазного иммуноферментного анализа выявило повышение уровня аутоантител к β2-АР - 1,3 OD_{450 нм} и уровня аутоантител к

ФРН - 0,87 OD_{450 нм} и снижение уровня аутоантител к α3-АХР - 0,21 OD_{450 нм}. Выявлена недостаточность симпатического отдела ВНС на уровне эффекторных органов аутоиммунного характера, рекомендована иммуносупрессивная терапия, на фоне которой состояние больной улучшилось.

Таким образом, повышение аутоантител к β2-АР, ФРН и снижение их к α3-АХР свидетельствует о недостаточности структур симпатического звена на уровне эффекторных органов.

Пример 3

Больная И., 46 лет, наблюдается в НЦ Неврологии РАМН с диагнозом миастения, генерализованная форма. У больной выявлены симптомы вегетативной дисфункции в виде приступов тахикардии, потливости с сухостью слизистых оболочек, нарушения зрения (помимо диплопии, связанной с миастеническим наружным офтальмопарезом, периодическая «расфокусировка» контуров предметов на среднем расстоянии). Кроме того, помимо слабости и утомляемости произвольных мышц общая слабость, повышенная утомляемость, не реагирующие на ингибиторы ацетилхолинэстеразы (АХЭ). Проведенное исследование сыворотки крови предлагаемым способом не выявило аутоантител в сыворотке крови, что позволило отнести эти нарушения к надсегментарному уровню дисфункции ВНС на фоне дисгормональных нарушений. Четыре года назад оперирована по поводу рака щитовидной железы, есть нарушения менструального цикла с чередованием маточных кровотечения и длительных периодов аменореи. Это позволило скорректировать проводимую терапию больной.

Таким образом, определение аутоантител к α3-АХР, β2-АР, ФРН методом тИФА в сыворотке крови отражает надсегментарный уровень поражения ВНС гормонального генеза.

Заявляемый способ оценки ВНС позволяет добиться улучшения диагностического процесса у больных, имеющих признаки вегетативной недостаточности в короткие сроки, проследить динамику патологического процесса и выбрать правильную тактику лечения.

Было исследовано 42 больных. Из них у 14 больных миастенией и поражением структур периферической вегетативной нервной системы на ганглионарном уровне выявлены аутоантитела к α3-АХР 1,5±1,26 (0,24-2,76), то есть 0,24 и более; к β2-АР 0,18±0,05 (0,13-0,23) - менее 0,24; к ФРН 0,27±0,09 (0,18-0,36) - менее 0,37. У 16 больных миастенией и поражением структур периферической вегетативной нервной системы на уровне эффекторных органов выявлены аутоантитела к α3-АХР 0,21±0,02 (0,19-0,23), то есть менее 0,24; к β2-АР 1,3±1,06 (0,24-2,36) - 0,24 и более и к ФРН 1,9±1,53 (0,37-3,43) - 0,37 и более. В данном случае наличие антител к β2-АР позволяет также выделить группу пациентов, резистентных к терапии β2-адреномиметиками. У 12 больных с надсегментарным уровнем поражения структур периферической нервной системы аутоантитела отсутствовали.

Таким образом, на основании вышеуказанных данных возможна оценка недостаточности ВНС как на уровне системных эффектов, так и на клетках, не имеющих прямой вегетативной иннервации (клетки иммунной системы), которая дает представление о механизмах, лежащих в основе клинической симптоматики, и позволяет проводить дифференциальную диагностику органического поражения ВНС.

На основе данных дифференциальной диагностики назначается адекватная терапия пациентам не только неврологических, но и кардиологических, гастроэнтерологических, урологических и офтальмологических клиник.

Таким образом, предложенный способ обладает высокой специфичностью выявления наличия антител к α3-АХР, β2-АР, ФРН в ИФА и позволяет с высокой точностью обнаруживать повышенное и пониженное количество антител, при котором диагностируют различные уровни поражения вегетативной нервной системы.

Это позволяет начать своевременное адекватное лечение, направленное на подавление причин поражения ВНС и улучшение качества жизни пациентов с ПВН.