Вид РИД
Изобретение
Изобретение относится к области медицины, а именно кардиологии, и может быть использовано при определении риска раннего развития ишемической болезни сердца (ИБС) у пациентов с клиническим диагнозом семейная гиперхолестеринемия, гетерозиготная форма (СГХС).
СГХС - моногенное аутосомно-доминантное заболевание, характеризующееся высокой концентрацией холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛПНП), сухожильными ксантомами и повышенным риском раннего возникновения ИБС [Civeira F., 2004]. СГХС является одним из наиболее частых моногенных заболеваний. Гетерозиготная форма СГХС в большинстве стран встречается с частотой 1 на 500 в общей популяции. СГХС может быть обусловлена мутациями нескольких генов: гена рецептора ЛПНП - LDLR, гена аполипопротеина В 100 - АРОВ, гена PCSK9 кодирующего конвертазу. Наиболее часто встречаются мутации генов LDLR и АРОВ, мутации гена PCSK9 встречаются только в 1-2% случаев. В настоящее время в мире известно более 1000 разных мутаций в гене LDLR, приводящих к развитию СГХС и три патогенные мутации в гене АРОВ: R3500Q, R3500W, R3531C [Soutar AK, 2007].
СГХС характеризуется высокой частотой раннего развития ИБС (в возрасте <55 лет у мужчин и <60 лет у женщин), что во многих семьях приводит к уменьшению продолжительности жизни. При этом заболевании клинически распознаваемая ИБС обычно отмечается в возрасте 45-48 лет у пациентов мужского пола и 55-58 лет - женского. Приблизительно у 85% мужчин и 50% женщин с не леченной СГХС развивается какое-либо сердечно-сосудистое осложнение до 65 лет. Длительные наблюдения показали, что ИБС является основной причиной смерти пациентов с СГХС [DeMott К, 2008; Civeira F, 2004; Sijbrands EJ, 2000]. В некоторых семьях отмечается особенно тяжёлое течение СГХС с ранними фатальными исходами у многих членов одной семьи, особенно при отсутствии адекватной терапии или при несвоевременном ее начале. Нередки случаи, когда ИБС появляется у мужчин-гетерозигот в 3-й декаде жизни, а у пациенток - до наступления менопаузы. Ежегодно в мире погибает около 200 тыс больных с СГХС вследствие потенциально предотвратимых сердечных приступов, а при длительной адекватной медикаментозной терапии, существенно снижающей уровень ХС ЛПНП, можно увеличить продолжительность жизни многих пациентов на 10-30 лет [Civeira F, 2004]. Вместе с тем ранний атеросклероз развивается далеко не у всех больных с СГХС, и нередко эти пациенты имеют нормальную продолжительность жизни даже без лечения, направленного на снижение уровня ХС [Jansen AC, 2005; Sijbrands EJ, 2000].
Понимание причин фенотипической разнородности СГХС необходимо для оценки индивидуального риска развития ИБС и подбора адекватной гиполипидемической терапии, в том числе с применением ЛПНП-афереза, в связи с чем в последнее время проводится активное изучение факторов риска развития ИБС у этих больных. Все факторы, так или иначе влияющие на сердечно-сосудистый риск при СГХС, можно разделить на 3 основные группы: 1) связанные с характером основного генетического дефекта (наличие мутации в одном из трех генов LDLR АРОВ PCSK9), 2) классические и 3) другие генетические-полигенные.
В заявляемом техническом решении разработан метод определения риска развития ранней ИБС, основанный на характеристике основного генетического дефекта.
Риск ИБС у больных СГХС в 20 раз выше, чем в общей популяции [Hopkins PN, 2011]. Согласно данным Slack и др. у больных СГХС мужчин ИБС развивалась к 30 годам у 5,4%, к 50 годам - 51,4%, к 60 годам - 85,4%, а у женщин к 50 годам - 12,2% и к 60 годам - 53,3% [Slack J., 1969]. По данным регистра Саймона Брума при исследовании 282 мужчин и 244 женщин больных СГХС смертность от ИБС самой высокой была в возрасте 20-39 лет и достоверно уменьшалась с возрастом [Betteridge DJ, 1991]. При исследовании больных СГХС из российской популяции у 61,5% больных была диагностирована ИБС, и у 31% - инфаркт миокарда [Мешков А.Н., 2009].
На клинический фенотип заболевания может оказывать влияние функциональный класс мутации, приводящей к дефектному рецептору. В одном из наиболее крупных исследований в неотобранной группе пациентов с СГХС [Defesche et al. 2003] показано, что риск ССЗ значительно различается в зависимости от типа мутации гена LDLR; у носителей мутации 1359-1 отмечался наибольший сердечно-сосудистый риск по сравнению со здоровыми родственниками, а у носителей мутации V408M наименьший (таблица 1).
|
Следует отметить, что вышеуказанная работа имела ряд недостатков, затрудняющих применение результатов в клинической практике: в работе сравнивались носители мутаций гена LDLR только со здоровыми родственниками и не проводилось сравнение с больными СГХС, у которых мутации в генах LDLR и АРОВ отсутствовали, некоторые пациенты до включения в исследования ранее принимали гиполипидемические препараты, что искажало естественную картину заболевания, мутации, которые описаны в работе, не встречаются в России. Работы других авторов также показали, что риск ССЗ значительно различается в зависимости от типа мутации гена LDLR, и для каждой новой описанной мутации гена LDLR требуется проведение исследований подтверждающих и уточняющих степень сердечно-сосудистого риска [Gudnason V, 1994; Gudnason V, 1995; Bertolini S,
2000; Dedoussis G.V.Z., 2004].
С учетом этих фактов были проведены исследования по поиску таких мутаций гена LDLR, по которым можно было бы делать более достоверный прогноз о крайне высоком риске раннего развития ИБС. В исследовании была проведена выборка пациентов с СГХС, ранее не получавших гиполипидемическую терапию, и сравнение с пациентами у которых при генетическом анализе мутации в генах LDLR и АРОВ отсутствовали. В результате исследований были выявлены 5 мутаций гена LDLR: 478T>G (C139G), 1252GТ (Е397Х), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>A, 2389+5G>C, являющихся индикаторами крайне высокого риска раннего развития ИБС. Полученные результаты не известны из уровня техники, каждая мутация встречается у 2 и более неродственных пациентов.
Задачей изобретения является создание более достоверного способа прогнозирования риска раннего развития ишемической болезни сердца у пациентов с клиническим диагнозом семейная гиперхолестеринемия.
Достигаемым техническим результатом является определение риска раннего развития ишемической болезни сердца у пациентов с клиническим диагнозом семейная гиперхолестеринемия.
Поставленная задача решается тем, что в способе прогнозирования риска раннего развития ишемической болезни сердца у пациентов с семейной гиперхолестеринемией по мутации гена LDLR вывод о крайне-высоком риске раннего развития ИБС делают при наличии одной любой мутации из списка 5 мутации гена LDLR: 478T>G (C139G), 1252G>T (Е397Х), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>A или 2389+5G>C.
В основе предлагаемого способа прогнозирования риска раннего развития ишемической болезни сердца (у мужчин до 55 лет, у женщин до 60 лет) лежит определение мутаций в генах АРОВ и LDLR. При выявлении любой мутации гена LDLR из списка (478T>G (C139G), 1252GТ (Е397Х), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>A или 2389+5G>С) прогнозируют крайне-высокий риск раннего развития ИБС (абсолютный риск развития ИБС у мужчин до 55 лет и у женщин до 60 лет составляет более 50%); при отсутствии мутаций генов АРОВ или LDLR прогнозируют средний риск
раннего развития ИБС (абсолютный риск около 30%).
Выявленные прогностические признаки были получены в результате
проведения следующего исследования:
1. Критерии отбора больных для исследования
В исследование включались пациенты с клиническим диагнозом СГХС, гетерозиготная форма установленным на основании диагностической системы The Dutch Lipid Clinic Network (Таблица 2) - с количеством баллов 6 и более, обоих полов, ранее не получавшие гиполипидемическую терапию [DeMott К, 2008]. В исследование включались как пробанды, так и их больные родственники 1 и 2 степени родства. Пациентам проводилось обследование на наличие ИБС и наличие мутаций генов LDLR и АРОВ. Мутации в генах определяли методом анализа кривых плавления высокого разрешения (АКП) с последующим секвенированием фрагментов с аномальной кривой плавления.
|
|
2. Диагностика ИБС
Диагноз ИБС устанавливали, когда: 1) отмечалась типичная ангинозная боль, а ЭКГ-проба с нагрузкой не проводилась, 2) отмечались стенокардия и положительный ЭКГ-тест с нагрузкой (когда такая проба проводилась), 3) пациент перенёс документированный инфаркт миокарда (ИМ) (см. ниже), 4) при проведении коронарографии выявлялось гемодинамически значимое поражение коронарного русла - более 50% для ствола левой коронарной артерии или более 70% при иной локализации, 5) проводились эндоваскулярные коронарные вмешательства или операция коронарного шунтирования.
3. Выделение геномной ДНК
Выделение ДНК из исследуемых образцов крови проводилось с помощью стандартной методики, селективным осаждением ДНК из лизата при помощи детергентов, с использованием коммерческих наборов фирмы «Синтол».
4. Выполнение метода анализа кривых плавления высокого разрешения
ПЦР проводилась в термоциклере «ABI 7500 fast» фирмы "Applied Biosystems". Использовалась смесь, содержащая 10 мкл ×2 MeltDoctor™ HRM master mix(Applied Biosystems), смысловой и антисмысловой праймеры к соответствующим участкам исследуемых генов, MgCl2, геномную ДНК (200 нг/мкл), H2O. Последовательность праймеров для амплификации фрагментов генов LDLR, АРОВ, используемых в тест системе на основе метода анализа кривых плавления высокого разрешения, представлены в Таблице 3. Анализ кривых высокого разрешения проводился с помощью пакета программ High Resolution Melting (HRM) Software, фирмы Applied Biosystems.
|
5. Секвенирование фрагментов с аномальной температурой плавления ПЦР-амплификация фрагментов генов для ссквенирования: ПЦР проводилась в термоциклере «Mastercycler Gradien» фирмы "Eppendorf". Использовалась смесь, содержащая 2 мкл ×10 ПЦР-буфера с 15 мМ MgCl2 (MBI Fermentas), смысловой и антисмысловой праймеры к соответствующим участкам исследуемых генов, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, геномную ДНК (200 нг/мкл), 2-3 ед рекомбинантной термостабильной Taq-полимеразы (MBI Fermentas) и деионизированную воду до конечного объема. Последовательность праймеров для амплификации фрагментов генов LDLR, АРОВ, используемых в тест-системе на основе метода прямого секвенирования, представлены в Таблице 4.
|
Перед секвенированием исследуемый фрагмент ДНК очищался от неспецифических продуктов ПЦР с использованием коммерческого реактива ExoSAP-ITR по протоколу фирмы ABI[Applied Biosystems Chemistry Guide]. Нуклеотидная последовательность продуктов ПЦР определялась методом циклического секвенирования с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems.
При выявлении нуклеотидной замены в последовательности гена АРОВ или LDLR, описанной в базе мутаций как вызывающей развитие СГХС, пациенту выставляется генетически подтвержденный диагноз СГХС. База мутаций доступна по адресу (http://www.ucl.ac.uk/ldlr/Current/) и насчитывает более 1000 патогенных мутаций гена LDLR. Для гена АРОВ известны три патогенные мутации, вызывающие развитие СГХС: R3500Q, R3500W, R3531C. В анализ включались пациенты с мутациями гена LDLR (478T>G (C139G), 1252G>T (E397X), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>A, 2389+5G>C), в сравнении с пациентами у которых при генетическом анализе мутации в генах LDLR и АРОВ отсутствовали.
Статистическая обработка результатов
Статистический анализ был выполнен с помощью статистической программы Statistica 6.0. Для проведения сравнения при нормальном распределении переменных применяли параметрический метод (непарный t-тест), при отклонении от нормального - непараметрический (тест Манна-Уитни); величины выражали как среднее ± стандартное отклонение. Частоту ИБС в группах сравнивали с помощью χ2-теста.
Таким образом, в исследование было включено 294 пациента с клиническим диагнозом СГХС гетерозиготная форма. 158 мужчин и 136 женщин в возрасте от 25 до 55 лет у мужчин и от 30 до 60 лет у женщин. У 37 пациентов была выявлена одна из 5 мутаций гена LDLR: (478T>G (C139G), 1252G>T (E397X), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>A, 2389+5G>C). У 124 пациентов были выявлены другие мутации гена LDLR или мутации гена АРОВ. У 133 пациентов мутаций генов LDLR и АРОВ не было выявлено.
|
Частота ИБС была достоверно выше в группе больных с мутацией в гене LDLR, чем у больных с СГХС без выявленной мутацией (табл.5). По частоте классических факторов риска ИБС (мужской пол, факт курения, наличие артериальной гипертензии (АГ), возраст) группы статистически не отличались. В связи с этим можно сделать вывод, что риск ИБС зависит от типа основного генетического дефекта (наличие мутации гена LDLR или иного дефекта).
Использование предлагаемого способа позволяет прогнозировать риск раннего развития ИБС у пациента с СГХС. Что способствует выбору правильной тактики лечения данных пациентов: проведению более агрессивной терапии пациентам с СГХС с крайне-высоким риском ранней ИБС с помощью комбинированной гиполипидемической терапии или проведением процедур ЛПНП-афереза.
Способ апробирован в отделе возрастных проблем сердечно-сосудистых заболеваний НИИ кардиологии им. А.Л.Мясникова ФГУ «РКНПК МЗ и СР РФ». Он дал достоверно положительные результаты и найдет широкое применение в медицинской практике.
Способ прогнозирования риска раннего развития ишемической болезни сердца у пациентов с семейной гиперхолестеринемией по мутации гена LDLR, характеризующийся тем, что определяют наличие мутации гена LDLR и при выявлении хотя бы одной мутации из 478T>G (C139G), 1252G>Т (E397Х), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>А или 2389+5G>С прогнозируют крайне высокий риск раннего развития ИБС.