Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА ДЛЯ СОЗДАНИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ КАНДИДАТНОГО ПРОТИВОРАКОВОГО ПРЕПАРАТА И ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ ОНКОЛИЗИСА

Изобретение относится к штаммам вируса болезни Ньюкасла для изучения онколитических свойств и механизмов онколизиса, а также для разработки кандидатных противораковых препаратов на основе вирусов, способных селективно лизировать новообразования млекопитающих и может быть использовано в вирусологии, микробиологии, медицине и ветеринарии.

По данным Всемирной Организации Здравоохранения ежегодно в мире от злокачественных новообразований умирает более пяти миллионов человек, и регистрируется более трех миллионов случаев новых заболеваний. На сегодняшний день излечиваемость онкологических заболеваний составляет всего 26%. Показатели смертности от онкологии в Новосибирской области одни из самых высоких в Сибири и превышают средний по России уровень. В динамике выявляемости и смертности населения от онкологических болезней по Новосибирску наблюдается неуклонный рост.

Разработка высокоэффективных методов лечения онкологических заболеваний является одной из наиболее актуальных задач современной медицины. Несмотря на некоторый прогресс в этой области наши возможности по выявлению опухолей на ранних стадиях и избирательному воздействию на них остаются крайне ограниченными.

Основным недостатком используемых в настоящее время методов химио- и радиотерапии является их низкий терапевтический индекс (ТИ). Данный показатель характеризует различие в степени воздействия соответствующего терапевтического агента на опухолевые и нормальные клетки организма (в упрощенном виде, соотношение количества убитых раковых клеток к количеству убитых нормальных клеток). Терапевтический индекс современных химиотерапевтических средств не превышает 6:1. По принятому в международном научном сообществе мнению, ТИ медикаментозных средств, направленно доставляемых бактериальными векторами, и онколитических вирусов может достигать 100000:1, что обусловлено их высокой специфичностью к опухолевым клеткам.

Идея о возможности использования вирусов для терапии опухолей возникла в первой половине 20 века. Однако датой рождения современной «виротерапии» считается 1991 г., когда в журнале "Science" были опубликованы результаты исследования онколитического потенциала генетически модифицированного вируса простого герпеса 1 типа (Martuza RL, Malick A, Markert JM, Ruffner KL, Coen DM. (1991) / Experimental therapy of human glioma by means of a genetically engineered virus mutant. // Science. 1991 May 10; 252(5007):854-6). К настоящему времени в мире, в результате проведения масштабных исследований, получен целый ряд перспективных препаратов на основе различных онколитических вирусов. Тем не менее, на сегодняшний день получение таких препаратов связано со сложными манипуляциями на генетическом уровне. Не следует также забывать, что для создания имеющихся противораковых препаратов на вирусной основе были использованы вирусы млекопитающих, которые являются условно патогенными для человека и могут существенно увеличить свою патогенность в ходе эволюции или за счет спонтанного мутагенеза.

В настоящее время получены данные о том, что вирус болезни Ньюкасла (далее - ВБН) обладает онколитической активностью и способен селективно лизировать раковые клетки, оставаясь при этом безопасным для нормальных клеток тканей млекопитающих. В нескольких исследованиях была продемонстрирована способность данного вируса к специфическому онколизису. Выявлено существенное отличие в скорости репликации вируса в опухолевых и нормальных клетках млекопитающих (Zhan X, Slobod KS, Krishnamurthy S, Luque LE, Takimoto T, Jones B, Surman S, Russell CJ, Portner A, Hurwitz JL. (2008) / Sendai virus recombinant vaccine expressing hPIV-3 HN or F elicits protective immunity and combines with a second recombinant to prevent hPIV-1, hPIV-3 and RSV infections. // Vaccine. 2008 Jun 25; 26(27-28): 3480-8. Epub 2008 May 1). Существует предположение, что высокая тропность ВБН к опухолевым клеткам обусловлена нарушением синтеза белков, отвечающих за элиминацию ВБН (Elankumaran S, Rockemann D, Samal SK. (2006) / Newcastle disease virus exerts oncolysis by both intrinsic and extrinsic caspase-dependent pathways of cell death. // J Virol. 2006 Aug; 80(15): 7522-34).

Известны противоопухолевые препараты на основе ВБН линии Р V1 703 и Cassell73, которые проходят первую стадию клинических испытаний (Ravindra PV, Tiwari AK, Sharma В, Chauhan RS. / Newcastle disease virus as an oncolytic agent. // Indian J Med Res. 2009 Nov; 130(5): 507-13).

Однако информация о данных штаммах, их свойствах и возможности применения в настоящее время не опубликованы.

Известны рекомбинантные вирусы болезни Ньюкасла с онколитической активностью (заявка США №20100178684, МПК C12N 7/01, опубл. 15.07.2010 г. и заявка США №20080206201, МПК C12N 7/00, опубл. 28.08.2008 г.).

Однако при использовании данных генно-инженерных конструкцй существует высокая вероятность обратных мутаций, низкая жизнеспособность и сложная технология получения. Кроме того, существует вероятность инициации мутаций в ДНК хозяина за счет наличия в геноме данных вирусов векторных структур.

По меннию заявителей, наиболее близким онколитическим штаммом (прототипом) является штамм вируса Ньюкастла NDV HUJ, депонированный в 2006 г. в коллекции вирусов в Великобритании под номером 06072401, который адаптирован к клеткам куриных эмбрионов и прошел несколько пассажей. Штамм-прототип NDV HUJ опубликован и описан в патенте США №7223389, МПК А61К 48/00, опубл. 29.05.2007 г. «Композиция и способ лечения опухолей».

Однако штамм-прототип при использовании в терапии опухолей требует предварительной адаптации к культуре опухолевых клеток, что снижает его терапевтические возможности при использовании в онкологии.

Техническим результатом заявляемого технического решения является создание онколитического штамма вируса болезни Ньюкасла, способного специфически разрушать новообразования млекопитающих в системе in vivo без предварительной адаптации на культуре опухолевых клеток.

Указанный технический результат достигается получением нового штамма NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 вируса болезни Ньюкасла, способного избирательно лизировать раковые клетки млекопитающих, не вызывая при этом инфекционного заболевания и гибели млекопитающих.

Штамм вируса болезни Ньюкасла NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 для создания на его основе кандидатного противоракового препарата и изучения и механизмов онколизиса, депонированный в Коллекции культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером №V-512.

Полученные данные выявляют наличие у штамма NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 способности специфически разрушать новообразования млекопитающих в системе in vivo без предварительной адаптации на культуре опухолевых клеток, что на сегодняшний день не описано в литературе. Это делает данный штамм перспективным агентом для создания на его основе путем предварительной адаптации противораковых препаратов с широким спектром взаимодействия и высоким терапевтическим индексом.

Таким образом, получение отечественного штамма-продуцента ВБН для создания на его основе препарата, обладающего онколитической активностью, является перспективным. Актуальность этого подтверждает отсутствие в России коммерческих аналогов подобных штаммов.

Рекомендуемый штамм эффективно культивируется в системе развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) в титрах 5,2±0,2 lg ЭИД₅₀/мл. Штамм не вызывает заболевания с летальным исходом у мышей при интраназальном и любой из разновидностей парентерального инфицирования. При этом вирус является высокопатогенным для кур (ICPI=2), вызывая гибель всех зараженных цыплят в течении 24 часов с момента заражения. У данного штамма была обнаружена способность к специфическому лизису опухолевых клеток млекопитающих.

Для выявления онколитических свойств штамма NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 были проведены эксперименты по заражению мышей опухолевыми клетками, предварительно инкубированными со штаммом NDV/ Mallard/Adigeya/8/2008. Результаты данного эксперимента выявили наличие у предлагаемого штамма ВБН способность нейтрализовать опухолевые клетки, препятствуя формированию опухоли. Это может происходить под воздействием иммунной системы, индуцированной наличием вируса, или, что более вероятно, по механизму прямого лизиса предлагаемым нами штаммом NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 опухолевых клеток. В пользу второй гипотезы говорит также и то, что при введении штамма NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 в уже сформировавшуюся опухоль, наблюдалось снижение динамики роста опухоли. При морфологическом исследовании было выявлено разрушение опухолевой ткани исследуемым штаммом, а на ультраструктурном уровне вирусные частицы были обнаружены внутри раковых клеток. При введении животным убитого вируса каких-либо изменений в динамике роста новообразований не наблюдалось. Таким образом, для проявления онколитической активности необходимо наличие живых вирусных частиц, причем, одними из вероятных маркеров онколитической активности являются строение сайта расщепления белка слияния, соответствующее высокопатогенным вариантам ВБН и способность лизировать клетки. Предлагаемый штамм имеет данные маркеры.

Полученные данные выявляют наличие у штамма NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 способности специфически разрушать новообразования млекопитающих в системе in vivo без предварительной адаптации на культуре опухолевых клеток, что на сегодняшний день не описано в литературе. Это делает данный штамм перспективным агентом для создания на его основе путем предварительной адаптации противораковых препаратов с широким спектром взаимодействия и высоким терапевтическим индексом.

Характеристика заявляемого штамма. Штамм NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 является типичным представителем вируса болезни Ньюкасла род Avulavirus семейство Paromyxoviridae. Заявляемый штамм выделен от погибшей утки при вспышке на территории республики Адыгея. Штамм депонирован в коллекцию культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») Роспотребнадзора под регистрационным номером №V-512.

Источник получения. Из патологического материала, полученного от птицы, погибшей при вспышке на территории республики Адыгея (селезенка, легкое, тонкий кишечник, головной мозг), был выделен изолят вируса болезни Ньюкасла, который получил название NDV/Mallard/Adigeya/8/2008. Вирус был выделен на РКЭ на первом пассаже, гибель РКЭ наблюдалась через 1,5-2 суток с момента инфицирования. Индикация вируса была проведена в РГА с эритроцитами петуха, но не агглютинировал эритроциты лошади: показатели гемагглютинирующей активности составляли 1:64-1:128 ГАЕ/0,2 мл. Инфекционная активность выделенного вируса составляла 5,2 lg ЭИД₅₀/мл.

Идентификация вируса. Первичная идентификация изолированного вируса гриппа А осуществлялась методом ОТ-ПЦР с детекцией результатов в закрытой пробирке в режиме реального времени с использованием праймеров и зонда, специфичных к консервативным участкам М-гена вируса болезни Ньюкасла, согласно (Miller PJ, Decanini EL, Afonso CL. / Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges. / nfect Genet Evol. 2010 Jan; 10(1): 26-35. Epub 2009 Sep 30).

Генетический и филогенетический анализ: Экстракцию РНК из суспензии вирусов проводили с использованием набора реагентов «Рибосорб» (ФГУН ЦНИИЭ), реакцию обратной транскрипции проводили с концевого, универсального праймера Random dN6 с помощью фермента M-MuLV обратной транскриптазы (ФГУН ЦНИИЭ). Для секвенирования был выбран участок генома вируса болезни Ньюкасла, содержащий С-концевой сегмент М-гена, N-концевой сегмент F-гена и межгенную область. По нуклеотидной последовательности данного участка можно воссоздать аминокислотную последовательность сайта протеолитического расщепления белка слияния, которая является основным маркером патогенности для вируса болезни Ньюкасла. Для секвенирования были использованы праймеры, разработанные на базе SEPRL (Kim LM, King DJ, Curry PE, Suarez DL, Swayne DE, Stallknecht DE, Slemons RD, Pedersen JC, Senne DA, Winker K, Afonso CL. / Phylogenetic diversity among low-virulence newcastle disease viruses from waterfowl and shorebirds and comparison of genotype distributions to those of poultry-origin isolates. // J Virol. 2007 Nov; 81(22):12641-53. Epub 2007 Sep 12).

ПЦР проводили на приборах «DNA-Engine» (Bio Rad, США) с использованием реагентов производства ФГУН ЦНИИЭ. Секвенирование фрагментов амплификации выполняли методом "cycle sequence" с набором ABI PRISM Big Dye™ v.1.1 (Applied Biosystems, USA), согласно инструкции изготовителя с использованием капиллярного автоматического секвенатора ABI-3100 PRISM™ Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Выравнивание нуклеотидных последовательностей выполнялось с использованием блока программ DNASTAR по алгоритму Clustal.

Филогенетический анализ проводился с помощью программы MEGA 3.1 методом Neighbor Joining по алгоритму Kimura 2-parameter с выполнением Bootstrap Test of Phylogeny (1000 повторов) [Kumar S.].

Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности генов показал принадлежность штамма NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 к классу 2, генотипу 7. Штамм наиболее близок к штаммам ранее описанным в Юго-Восточной Азии.

Культуральные свойства. Штамм NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 при культивировании на монослое первичной культуры клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) вызывает цитопатическое действие (ЦПД) на 2-4 сутки (температура культивирования 37°С, в атмосфере 5% СО₂).

Патогенность для человека. Штаммы вируса болезни Ньюкасла не являются патогенными для человека.

Патогенность для птицы. Штамм NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 относится к высокопатогенным вариантам вируса болезни Ньюкасла: интрацеребральный индекс патогенности = 2.

Патогенность для млекопитающих. Штамм не проявляет патогенности для млекопитающих.

Для длительного хранения штамм необходимо лиофилизировать с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение не менее 2 лет при хранении на -70°С.

Для культивирования штамма в культуре клеток используют следующие питательные среды: Игла МЭМ, Игла МЭМ ×2АВК, среда 199, ДМЭМ, содержащие 2 мкг/мл трипсина, 2 ммоль/л глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина.

Изобретение иллюстрируется следующими чертежами. На фиг.1 приведена динамика роста опухолей KREBS, нкубированных с высоко- и низкопатогенными штаммами ВБН, у мышей линии BALB/C. На фиг.2 приведен график изменения динамики роста опухолей KREBS у мышей линии BALB/C, зараженных низко- и высокопатогенным штаммами ВБН через две недели после прививки опухолевых клеток. На фиг.3 изображена центральная часть опухоли - поля некрозов и опухолевые «островки». На фиг.4 изображены активированные макрофаги в опухоли. На фиг.5 приведены миелинезированные структуры и вирусные частицы в межклеточном пространстве. На фиг.6 изображено формирование вирусных частиц в области ЭПР. На фиг.7 представлена опухолевая клетка, зараженная ВБН. На фиг.8 представлена вироплазма в перинуклеарном пространстве. На фиг.9 изображена разрушенная опухолевая клетка, заполненная вироплазмой и вирусоподобными частицами.

Пример 1. Выявление онколитических свойств штамма NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 при заражении мышей клетками перевиваемой линии опухолей KREBS 2, предварительно инкубированными со штаммом NDV/Mallard/Adigeya/8/2008.

Для выявления нейтрализующей активности, трем группам по 10 мышей ввели опухолевые клетки, инкубированные с NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 (высокопатогенный), опухолевые клетки, инкубированные с NDV/Chukotka/goose/7/2008 (низкопатогенный, полученный из коллекции отдела зоонозных инфекций и гриппа ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»), опухолевые клетки, инкубированные с физ. раствором (контрольная группа). Измерение опухолей начали проводить с 15-го дня эксперимента, когда опухоль в контрольной группе явно определялась визуально и тактильно. Динамика роста опухолей наблюдалась в течении 28 дней. Каких-либо достоверных отличий в динамике роста новообразований в контрольной группе и в группе, зараженной штаммом NDV/goose/Chukotka/7/2008, выявлено не было. В группе, зараженной NDV/Mallard/Adigeya/8/2008, формирование опухоли не наблюдалось.

Результаты данного эксперимента показывают наличие у патогенного для птиц штамма ВБН способности нейтрализовать опухолевые клетки млекопитающих и предотвращать формирование опухоли. Этот процесс может происходить под воздействием иммунной системы, индуцированной наличием вируса, или по механизму прямого лизиса вирусными частицами опухолевых клеток. Если считать второе предположение верным, то наличие онколитической активности у патогенного для птиц штамма и отсутствие ее у непатогенного объясняется тем, что апатогенные штаммы ВБН не способны лизировать клетки, в то время как исследуемый штамм, напротив, обладает этой способностью, которая позволяет ему лизировать раковые клетки млекопитающих, предотвращая формирование опухоли. На фиг.1 приведена динамика роста опухолей KREBS, нкубированных с высоко и низкопатогенными штаммами ВБН, у мышей линии BALB/C. По оси абсцисс отложено время измерения размера опухоли (дни), по оси ординат - объем опухоли (мм³).

Пример 2. Изучение онколитических свойств штамма NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 на модели солидной опухоли мышей KREBS 2 при введении вируса в сформировавшуюся опухоль в системе in vivo.

Для оценки влияния ВБН на уже сформировавшуюся опухоль был поставлен следующий эксперимент: три группы по 13 мышей были внутримышечно заражены опухолью. Через 2 недели каждой группе ввели по 0,2 мл живого вируса NDV/Mallard/Adigeya/8/2008, убитого вируса NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 и физ. раствора соответственно. Динамика роста опухолей наблюдалась на протяжении 28 дней. Значимых отличий в динамике роста между группой, зараженной убитым NDV/Mallard/Adigeya/8/2008, и контрольной группой выявлено не было. В группе, зараженной живым NDV/Mallard/Adigeya/8/2008, наблюдалось уменьшение темпа роста опухоли. На фиг.2. приведен график изменения динамики роста опухолей KREBS у мышей линии BALB/C, зараженных низко- и высокопатогенным штаммами ВБН через две недели после прививки опухолевых клеток. По оси абсцисс отложено время измерения размера опухоли (дни), по оси ординат - объем опухоли

(мм³).

Через 12 часов после заражения 3 мыши из каждой группы были вскрыты. Визуальный анализ показал наличие многочисленных некрозов в теле опухоли у мышей, зараженных живым NDV/Mallard/Adigeya/8/2008. Структурный анализ на светооптическом уровне выявил увеличение макрофагальной активности в районе опухоли и наличие активного лизиса опухолевых клеток в области введения вируса (фиг.3, 4), также были выявлены клетки, с признаками инициации аппоптоза. На фиг.3 изображена центральная часть опухоли - поля некрозов и опухолевые «островки». На фиг.4 изображены активированные макрофаги в опухоли. На ультраструктурном уровне с использованием электронной микроскопии были выявлены миелинезированные структуры и вирусные частицы в межклеточном пространстве (фиг 5). На фиг.5 приведены миелинезированные структуры и вирусные частицы в межклеточном пространстве.

При морфологическом исследовании материала, отобранного на 11 день после заражения на светооптическом уровне, было выявлено почти полное разрушение опухолевой ткани, фактически активные митозы сохранились только в периферической области опухоли, также была отмечена макрофагальная активность.

На ультраструктурном уровне были выявлены вирусные частицы внутри опухолевых клеток, формирование вирусных частиц на ЭПР и отпочковывание свежесформированных вирионов, вироплазма в перинуклеарном пространстве, были также выявлены разрушенные опухолевые клетки, полностью заполненные вироплазмой и вирусоподобными частицами (фиг.6, 7, 8, 9). На фиг.6 изображено формирование вирусных частиц в области ЭПР. На фиг.7 представлена опухолевая клетка, зараженная ВБН. На фиг.8 представлена вироплазма в перинуклеарном пространстве. На фиг.9 изображена разрушенная опухолевая клетка, заполненная вироплазмой и вирусоподобными частицами.

Полученные данные указывают на уникальную способность штамма NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 проявлять избирательную литическую активность в отношении опухолевых клеток млекопитающих, а также активно реплицироваться и сохраняться в этих клетках на протяжении длительного времени без предварительной адаптации, разрушая новообразование.

Таким образом, уникальные свойства предлагаемого штамма позволяют использовать его для исследования механизмов разрушения раковых клеток млекопитающих на ультраструктурном уровне с помощью методов светооптической и электронной микроскопии. Данные свойства перспективны для фундаментальных и прикладных медицинских исследований.

Данные свойства делают штамм NDV/Mallard/Adigeya/8/2008 очень перспективным для дальнейшего исследования онколитической активности и разработки кандидатных противоопухолевых препаратов.