ПРОДУЦЕНТ ИНГИБИТОРА ВИРУСА НЕКРОТИЧЕСКОЙ ПЯТНИСТОСТИ БАЛЬЗАМИНА

Изобретение относится к биохимии и может найти применение в агробиотехнологии, микробиологии и растениеводстве.

В последние годы в Российскую Федерацию из европейских стран ежегодно импортируются сотни тысяч цветочно-декоративных растений, которые могут являться хозяевами тосповируса некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot tospovirus). В связи с тем что этот вирус имеет чрезвычайно широкий круг растений-хозяев на большинстве декоративных и овощных культур, создается опасность заражения потенциальных растений-хозяев данным вирусом. Вирус некротической пятнистости бальзамина приносит значительные убытки производству декоративных культур во многих Европейских странах.

Impatiens necrotic spot tospovirus причинял большой вред различным видам декоративных и овощных культур, выращиваемых в теплицах на территории Мексики, США и на юге Канады и странах Европы. Потери урожая доходили до 100% (4, 5).

Из уровня техники известен ингибитор вируса герпеса простого 1-го типа (1) и ингибитор вируса иммунодефицита человека (2), в качестве ингибитора которых использовался метаболит штамма Trichoderma harzianum Rifai - гомогенный фермент L-лизин-α-оксидаза.

Также из уровня техники известна возможность использования гена, ингибирующего вирус пятнистости бальзамина путем его введения в растение семейства Бальзаминовых с получением трансгенных растений, устойчивых к такому вирусу (US 6528703 B1, 04.03.2003) - прототип. Однако такая методика является трудоемкой и требует больших финансовых и временных затрат.

Техническим результатом изобретения является снижение потерь декоративных и овощных культур, вызванных вирусом Impatiens necrotic spot tospovirus.

Технический результат достигается тем, что штамм Trichoderma harzianum Rifai является продуцентом ингибитора тосповируса некротической пятнистости бальзамина. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под №F-180 (Москва, Дорожный 1-й проезд, д.1, Институт генетики и селекции, 1987 г.).

Морфолого-биохимическая характеристика штамма

Штамм Trichoderma harzianum Rifai на среде сусло-агар образует колонии быстрорастущие. Мицелий гриба бесцветный, септированный, распростертый. На 4-е - 5-е сутки роста появляются дерновинки с конидиеносцами, подушковидные, сначала белые, со временем желто- или темно-зеленого цвета. Фиалиды бутыльчатые /9-12µ/, расположены мутовками по 3 и более. На каждой фиалиде образуются конидии, склеенные в головку. Конидии гриба округлые, гладкие, мелкие /3-5µ/, в проходящем свете бледно-зеленые, а в массе - темные.

На агаризованной среде Чапека колонии штамма-продуцента быстрорастущие, но слабо спороносящие. Штамм хорошо растет на среде Чапека, однако лучший рост наблюдается на среде сусло-агар. Агар и желатину не разжижает, молоко не пептонизирует. Аэробный гриб. Температурный оптимум +28 - +29°С. На картофельно-декстрозном агаре наблюдается снижение интенсивности роста, образование воздушного мицелия и спороношения. Оптимальные условия роста гриба при рН 4-6, однако может расти и при рН от 1,5 до 9.

Trichoderma harziatum Rifai в одинаковой степени усваивает как аммонийные, так и азотнокислые соли. Лучшим источником азота из органических соединений является пептон. Хорошо растет на средах с аспарагином и с глутаминовой кислотой. Лучшими источниками углерода являются ксилоза, глюкоза, сахароза, лактоза, галактоза, маннит, крахмал. На средах с этими сахарами наблюдается интенсивный рост. Слабо усваиваются спирты метиловый, этиловый, дульцит. Хорошо усваивает в качестве источника углерода пшеничные отруби. Инокулят гриба, выросший на среде с пшеничными отрубями, дает положительный результат при использовании его при ферментации на средах разного состава.

Штамм Trichoderma harzianum Rifai обладает L-лизин-α-оксидазной активностью. Активность L-лизин-α-оксидазы в культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai рассчитывали по приросту Н ₂ О ₂ , количество которой определяли спектрофотометрическим ортодиазидиновым микрометодом. Сущность метода заключается во взаимодействии всей образующейся в реакции H ₂ O ₂ с O-дианизидингидрохлоридом. Инкубационная смесь содержала 20 мкг пероксидазы, 250 мкг O-дианизидингидрохлорида и 0,1-0,5 мг белка в 1 мл конечного объема. После 20 минут инкубирования в термостате при температуре +37°С пробы охлаждали до +4°С. Оптическую плотность окрашенных растворов опытной и контрольной (без субстрата) проб измеряли на спектрофотометре СФ-16 при 540 нм против второй контрольной пробы (без пероксидазы).

Для построения калибровочной кривой молярность свежеприготовленного раствора H ₂ O ₂ определяли перманганатометрией. Субстратами служили L и DL-формы аминокислот («Reanal», Венгрия). Применяли 0,05 М фосфатный буфер. В качестве катализатора пероксидазной реакции использовали пероксидазу фирмы «Reanal», а в качестве донора протонов - O-дианизидингидрохлорид («Merck», ФРГ). За единицу активности принимали количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоль Н ₂ О ₂ за 1 мин при температуре +37°С.

Удельную активность фермента выражали числом единиц активности на 1 мг белка или 1 мл культуральной жидкости. Белок определяли по методу Лоури. В качестве стандарта использовали 0.05%-ный раствор кристаллического бычьего альбумина («Reanal», Венгрия).

Для оценки чистоты препарата использовали электрофорез в 10% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия, а также капиллярный электрофорез на установке Капель 105 производства фирмы Люмекс (Санкт-Петербург).

Условия культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai

Ферментация штамма производилась на оборудовании Опытной технологической установки ИБФМ РАН им. Г.К.Скрябина (г.Пущино).

Использовали ферментер типа БИОР-01 производства ОКБ ТБМ, г.Кириши, объемом 100 л с коэффициентом заполнения 0,6. Ферментер оснащен магнитной мешалкой, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры и рН.

Питательную среду готовили непосредственно в аппарате. Для этого в аппарат заливали 60 л водопроводной воды, вносили 1% пшеничных отрубей, стимулятор - 0,1%, 1,3% сульфата аммония, значение рН 5.8-6,0 устанавливали 10%-ным раствором HCl. Пшеничные отруби и стимулятор предварительно замачивали в 10 л воды в течение 4-х ч, стерилизовали в автоклаве 1 ч при температуре +125°C. Затем подготовленный ферментер засевали посевным материалом из колб. Посевная доза не менее 5%. Культивирование проводили при температуре +26°С, расход воздуха на протяжении всей ферментации 30 л в минуту, скорость вращения мешалки 200 оборотов в минуту. Величину рН в процессе роста корректировали до 6,5. Продолжительность выращивания составила 94-98 ч, конечные значения рН от 5,3 до 7.5.

По окончании ферментации культуральную жидкость направляли на участок предварительной очистки, где мицелий гриба отделяли фильтрованием под вакуумом на нутч-фильтре. Вес полученной биомассы составил 3,5 кг. Полученный нативный раствор подвергали дополнительному сепарированию на сепараторе типа ОСБ при 9000 об/мин в течение часа при температуре +2 - +4°С. Затем нативный раствор в объеме 55 л, полученный после отделения биомассы, концентрировали до 1,5 л (концентрат).

Рибонуклеиновую кислоту (РНК) тосповируса некротической пятнистости бальзамина выделяли из декоративного горшечного растения Стрептокарпус (лат. Streptocarpus) семейства Геснериевые. Производили замораживание при температуре -20°C растительных образцов (листья декоративной культуры Стрептокарпус). Затем образцы растирали в фарфоровой ступке до гомогенного состояния с добавлением лизирующего буфера из набора «Проба НК» фирмы ООО «Агродиагностика». Из предварительно приготовленных образцов выделяли РНК с использованием наборов «Проба НК» фирмы ООО «Агродиагностика» по протоколу из набора.

Для постановки обратной транскрипции (ОТ) в пробирки была добавлена следующая смесь для ОТ: ОТ-буфер AMV фирмы «Promega» (250 mM Трис-HCl, 250 mM KCl, 50 mM MgCl ₂ , 2,5 mM spermidine, 50 mM DTT) - 5 µ1, смесь дНТФ фирмы ЗАО «Диалат ЛТД» (дА, дТ, дГ, дЦ - по 200 µМ каждого) - 2,5 µl, РНазин - 40ед. (1 µ1), ревертаза AMV фирмы «Promega» (10 U/µl) - 3 µl, вода до общего объема 20 µl РНК образца - 5 µl. Реакция обратной транскрипции (процесс образования двуцепочечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК) происходила при температуре +42°С в течение 1 ч, при температуре +95°С - 5 мин.

На этапе обратной транскрипции к выделенной и очищенной РНК вируса некротической пятнистости бальзамина был добавлен концентрат культуральной жидкости в разных разведениях (от 5 до 0,025 Ед/мл). Далее для реакции амплификации готовили следующую смесь: 10х MagMIX - 2025 фирмы ЗАО «Диалат-ЛТД» - 2,5 µl на образец, праймеры INSV прямые (S1) и обратные (S2) - по 2 µl (10 ρmol/µl) на образец, кДНК - 5 µl, вода до 25 µ1, минеральное масло. В результате выделена комплементарная-дезоксирибонуклеиновая кислота (кДНК). Для получения продуктов реакции (ампликонов) проводили нагревание смеси по следующей схеме: один цикл при температуре +94°С в течение 15 минут, 30 циклов при температуре +94°С в течение 1 минуты, при температуре +48С в течение 1 минуты и при температуре +72°С в течение 1 минуты; один цикл при температуре +72°С в течение 10 минут. Хранение осуществляли при температуре +4°С. Полученные ампликоны (многократно увеличенное число копий изучаемого участка кДНК) вносили в 1,5% агарозный гель, после чего получали электрофореграммы и оценивали полученные результаты (6).

Пример 1

После проведения обратной транскрипции к образцам выделенной кДНК был добавлен фермент в концентрациях 2,5 Ед/мл и 5 Ед/мл. Также был взят контрольный образец кДНК, в который не был добавлен фермент. На электрофореграмме наличие темной полосы в контрольном образце свидетельствовало о сохранении вируса, отсутствие полосы означало его разрушение. При концентрации 2,5 Ед/мл и более кДНК вируса разрушается, при этом не наблюдается образования темной полосы.

Пример 2

После проведения обратной транскрипции к образцам выделенной кДНК был добавлен фермент в разных концентрациях (1, 0,1, 0,05, 0,025 Ед/мл). Также был взят контрольный образец кДНК без добавления фермента. На электрофореграмме наличие темной полосы в контрольном образце свидетельствовало о сохранении вируса, отсутствие полосы означало его разрушение. При концентрации более 1 Ед/мл кДНК вируса разрушалось, при этом не наблюдалось образования темной полосы. При большем разведении фермента вирусная кДНК сохраняется и наблюдается темная полоса.

Литература

1. Ингибитор вируса герпеса простого 1-го типа. Патент РФ №2022012, 1994. Алексеев С.Б, Берёзов Т.Т., Анджапаридзе О.Г. и др.

2. Ингибитор вируса иммунодефицита человека. Патент РФ №2022011, 1994. Алексеев С.Б., Веса B.C., Смирнова И.П. и др.

3. Смирнова И.П., Алексеев С.Б. Биосинтез противоопухолевого фермента L-лизин-α-оксидазы Trichoderma sp. // Антибиотики и химиотерапия. - 2009 - Т.54. - В.5-6. - С.8-11.

4. ОЕРР/ЕРРО (2004). Diagnostic protocol for regulated pests. PM 7/34(1). Tomato spotted wilt tospovirus, Impatiens necrotic spot tospovirus and Watermellon silver mottle tospovirus. Bulletin ОЕРР/ЕРРО Bulletin 34, 271-279.

5. Windham A.S., Hale F., Yanes J. Impatiens necrotic spot virus: a serious pathogen of floral crops (1998). Agricultural Extension Service University of Tennessee. SP370A.

6. Mumford R.A., Barker I., Wood K.R. (1996b) An improved method for the detection of Tospoviruses using the polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods 57, 109-115.