КОМПОЗИЦИИ МОЮЩИХ СРЕДСТВ

Область техники

Данное изобретение относится к композициям, содержащим липазы и оттеночные агенты для ткани, и способам получения и использования таких продуктов.

Известный уровень техники

Появление липазных ферментов, пригодных для использования в моющих средствах, создает для разработчика новые возможности улучшить удаление жиров. Такие ферменты катализируют гидролиз триглицеридов, которые составляют основной компонент многих широко распространенных жировых загрязнений, таких как секрет сальных желез, животные жиры (например, лярд, топленый жир, масло) и растительные масла (например, оливковое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло). Однако эти ферменты типично обладают низкой эффективностью в первом цикле стирке и типично приводят к образованию неприятного запаха, возникающего, как считается, в результате гидролиза жиров, присутствующих в пятнах от молочных продуктов, таких как молочные напитки, сливки, масло и йогурты. Без ограничения теорией, считается, что такие загрязнения имеют тенденцию к образованию индуцируемого липазой неприятного запаха, поскольку они содержат триглицериды, функционализированные короткоцепочечными (например, C₄) жирными ацильными звеньями, которые после липолиза высвобождают неприятно пахнущие летучие жирные кислоты. Даже в случае улучшения эффективности таких ферментов проблема неприятного запаха остается. Таким образом, использование этой технологии сильно ограничено.

Мы обнаружили, что комбинация оттеночного агента для ткани с определенными вариантами липаз приводит к улучшению эффективности очистки, в то же время сводя к минимуму неприемлемый неприятный запах. Не желая быть связанными теорией, укажем, что такие полезные эффекты, как считается, вероятно, обеспечиваются следующими механизмами: выбранные варианты липаз повышают степень удаления жира, что приводит к улучшенному доступу оттеночного агента для ткани к поверхности ткани и, благодаря этому, улучшенному отложению. Полученная комбинация улучшенного удаления маслянистых загрязнений и отложения оттеночного красителя приводит к улучшению внешнего вида ткани; даже в случае недостаточного удаления масляных загрязнений гидролиз жиров до более гидрофильных жирных кислот, моно- и диглицеридов приводит к улучшенному отложению оттеночного красителя и, таким образом, ощущению чистоты; и присутствие молекул красителя, откладывающихся в масляные загрязнения, находящиеся на ткани, может ингибировать активность фермента, приводящую к появлению неприятного запаха.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим оттеночный агент для ткани и вариант липазы с уменьшенным потенциалом образования запаха и хорошей относительной эффективностью, без присоединения C-концевого удлинения. Вариант липазы получают путем введения мутаций в одну или больше областей, идентифицированных в родительской липазе. Вариант, полученный таким образом, должен иметь липазную активность, равную не менее 80% от активности родительской липазы, выраженной как относительная эффективность.

Краткое описание фигур

Фигура 1 изображает сравнительный анализ первичной структуры липаз.

Перечни последовательностей

SEQ ID NO: 1 изображает последовательность ДНК, кодирующую липазу Thermomyces lanoginosus.

SEQ ID NO: 2 изображает аминокислотную последовательность липазы Thermomyces lanoginosus.

SEQ ID NO: 3 изображает аминокислотную последовательность липазы Absidia reflexa.

SEQ ID NO: 4 изображает аминокислотную последовательность липазы Absidia corymbifera.

SEQ ID NO: 5 изображает аминокислотную последовательность липазы Rhizomucor miehei.

SEQ ID NO: 6 изображает аминокислотную последовательность липазы Rhizopus oryzae.

SEQ ID NO: 7 изображает аминокислотную последовательность липазы Aspergillus niger.

SEQ ID NO: 8 изображает аминокислотную последовательность липазы Aspergillus tubingensis.

SEQ ID NO: 9 изображает аминокислотную последовательность липазы Fusarium oxysporrum.

SEQ ID NO: 10 изображает аминокислотную последовательность липазы Fusarium heterosporum.

SEQ ID NO: 11 изображает аминокислотную последовательность липазы Aspergillus oryzae.

SEQ ID NO: 12 изображает аминокислотную последовательность липазы Penicillium camemberti.

SEQ ID NO: 13 изображает аминокислотную последовательность липазы Aspergillus foetidus.

SEQ ID NO: 14 изображает аминокислотную последовательность липазы Aspergillus niger.

SEQ ID NO: 15 изображает аминокислотную последовательность липазы Aspergillus oryzae.

SEQ ID NO: 16 изображает аминокислотную последовательность липазы Landerina penisapora.

Детальное описание изобретения

Определения

В используемом тут значении термин "моющая композиция" включает, если не указано иное, гранулированные или порошкообразные универсальные или "для тяжелых условий работы" моющие средства, особенно моющие средства для стирки; жидкие, гелевые или пастообразные универсальные моющие средства, особенно так называемые средства жидкого типа для тяжелых условий работы; жидкие моющие средства для тонких легких тканей; средства для мытья посуды вручную или посудомоечные средства для облегченных режимов, особенно сильнопенящегося типа; средства для посудомоечных машин, включая различные таблетированные, гранулированные, жидкие типы и средства для уменьшения количества остающихся на посуде капель для использования в домашних условиях и в учреждениях питания; жидкие моющие и дезинфицирующие агенты, включая антибактериальные средства для ручной стирки, кусковые стиральные средства, жидкости для полоскания рта, очищающие средства для зубов и полости рта, шампуни для мытья машин и ковров, средства для уборки ванной комнаты; шампуни и ополаскиватели для волос; гели для душа и пены для душа и средства для очистки металлов, а также добавки для моющих средств, такие как отбеливающие добавки и "карандаши для выведения пятен" или средства для предварительной обработки.

В используемом тут значении термин "оттеночный агент для ткани" означает красители или пигменты, которые при включении в состав моющих композиций могут откладываться на ткани, когда указанную ткань вводят в контакт с моющим раствором, содержащим указанные моющие композиции, тем самым изменяя оттенок указанной ткани. В целях данной заявки флуоресцентные оптические осветлители не считаются оттеночными агентами для ткани.

В используемом тут значении фраза "независимо выбранный из группы, состоящей из…" означает, что компоненты или элементы, выбранные из указанной группы Маркуша, могут быть одинаковыми, могут быть разными или могут быть любой смесью элементов.

Методики проведения испытаний, раскрытые в разделе Методики проведения испытаний данной заявки, должны использоваться для определения соответствующих значений параметров заявляемых изобретений.

Если не указано иное, все уровни компонентов или композиций относятся к активным уровням данного компонента или композиции и не учитывают примеси, например остаточные растворители или побочные продукты, которые могут присутствовать в коммерчески доступных источниках.

Все величины процентного содержания и соотношения рассчитываются по весу, если не указано иное. Все величины процентного содержания и соотношения рассчитываются по отношению ко всей композиции, если не указано иное.

Следует понимать, что каждый максимальный численный предел, указанный в настоящем описании, включает каждый нижний численный предел, как если бы такие нижние численные пределы были явным образом указаны тут. Каждый минимальный численный предел, указанный в настоящем описании, будет включать каждый верхний численный предел, как если бы такие верхние численные пределы были явным образом указаны тут. Каждый интервал численных значений, приведенный в данном описании, будет включать каждый более узкий интервал численных значений, попадающий в такой более широкий интервал численных значений, как если бы такие более узкие интервалы численных значений были все явным образом указаны тут.

Все цитируемые документы в релевантной части включаются сюда в качестве ссылок; ссылка на любой документ не должна истолковываться как допущение того, что он является известным уровнем техники по отношению к настоящему изобретению.

Композиции

Композиции по настоящему изобретению могут содержать от примерно 0,00003% до примерно 0,1%, от примерно 0,00008% до примерно 0,05%, или даже от примерно 0,0001% до примерно 0,04%, оттеночного агента для ткани и от примерно 0,0005% до примерно 0,1%, от примерно 0,001% до примерно 0,05%, или даже от примерно 0,002% до примерно 0,03%, липазы.

Такие композиции могут иметь любую форму, например форму моющей композиции и/или композиции для обработки.

Остальная часть моющих композиций по любому из вышеупомянутых аспектов состоит из одного или больше вспомогательных материалов.

Пригодные варианты липаз

Липаза композиции по настоящему изобретению представляет собой вариант липазы без C-концевого удлинения, но с мутациями, введенными в определенные области родительской липазы, благодаря чему уменьшается тенденция к образованию запаха.

Родительская липаза

Родительская липаза может быть грибковой липазой с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50% гомологии, как определено в разделе "Гомология и сравнительный анализ первичной структуры", с последовательностью липазы Т. lanuginosus, приведенной в SEQ ID NO: 2.

В другом предпочтительном аспекте родительская липаза является липазой Thermomyces.

В более предпочтительном аспекте родительская липаза является липазой Thermomyces lanuginosus. В еще более предпочтительном варианте воплощения родительская липаза представляет собой липазу SEQ ID NO: 2.

Идентификация областей и замещений

Положения, указанные в Области I - Области IV ниже, представляют собой положения аминокислотных остатков в SEQ ID NO: 2. Для того чтобы найти соответствующие (или гомологичные) положения в другой липазе, используют процедуру, описанную в разделе "Гомология и сравнительный анализ первичной структуры".

Замещения в Области I

Область I состоит из аминокислотных остатков, окружающих N-концевой остаток Е1. В этой области предпочтительно замещают аминокислоту родительской липазы на более положительную аминокислоту. Область I охватывает аминокислотные остатки, соответствующие следующим положениям: 1-11 и 223-239. Следующие положения представляют особый интерес: 1, 2, 4, 8, 11, 223, 227, 229, 231, 233, 234 и 236. В частности, были идентифицированы следующие замещения: X1N/*, X4V, X227G, X231R и X233R.

В предпочтительном варианте воплощения родительская липаза имеет по меньшей мере 80%, например 85% или 90%, например по меньшей мере 95%, или 96%, или 97%, или 98%, или 99%, идентичность с SEQ ID NO: 2. В наиболее предпочтительном варианте воплощения родительская липаза идентична SEQ ID NO: 2.

Замещения в Области II

Область II состоит из аминокислотных остатков, контактирующих с субстратом с одного бока ацильной цепи и одного бока спиртовой части. В этой области предпочтительно замещают аминокислоту родительской липазы на более положительную аминокислоту или на менее гидрофобную аминокислоту. Область II охватывает аминокислотные остатки, соответствующие следующим положениям: 202-211 и 249-269. Следующие положения представляют особый интерес: 202, 210, 211, 253, 254, 255, 256, 259. В частности, были идентифицированы следующие замещения: X202G, X210K/W/A, X255Y/V/A, X256K/R и X259G/M/Q/V.

В предпочтительном варианте воплощения родительская липаза имеет по меньшей мере 80%, например 85% или 90%, например по меньшей мере 95%, или 96%, или 97%, или 98%, или 99%, идентичность с SEQ ID NO: 2. В наиболее предпочтительном варианте воплощения родительская липаза идентична SEQ ID NO: 2.

Замещения в Области III

Область III состоит из аминокислотных остатков, которые образуют гибкую структуру и тем самым позволяют субстрату заходить в активный сайт. В этой области предпочтительно замещают аминокислоту родительской липазы на более положительную аминокислоту или на менее гидрофобную аминокислоту. Область III охватывает аминокислотные остатки, соответствующие следующим положениям: 82-102. Следующие положения представляют особый интерес: 83, 86, 87, 90, 91, 95, 96, 99. В частности, были идентифицированы следующие замещения: Х83Т, X86V и X90A/R.

В предпочтительном варианте воплощения родительская липаза имеет по меньшей мере 80%, например 85% или 90%, например по меньшей мере 95%, или 96%, или 97%, или 98%, или 99%, идентичность с SEQ ID NO: 2. В наиболее предпочтительном варианте воплощения родительская липаза идентична SEQ ID NO: 2.

Замещения в Области IV

Область IV состоит из аминокислотных остатков, которые электростатически связываются с поверхностью. В этой области предпочтительно замещают аминокислоту родительской липазы на более положительную аминокислоту. Область IV охватывает аминокислотные остатки, соответствующие следующим положениям: 27 и 54-62. Следующие положения представляют особый интерес: 27, 56, 57, 58, 60. В частности, были идентифицированы следующие замещения: X27R, X58N/AG/T/P и X60V/S/G/N/R/K/A/L.

В предпочтительном варианте воплощения родительская липаза имеет по меньшей мере 80%, например 85% или 90%, например по меньшей мере 95%, или 96%, или 97%, или 98%, или 99%, идентичность с SEQ ID NO: 2. В наиболее предпочтительном варианте воплощения родительская липаза идентична SEQ ID NO: 2.

Аминокислоты в других положениях

Родительская липаза может опционально включать замещения других аминокислот, особенно менее 10 или менее 5 таких замещений. Примерами являются замещения, соответствующие одному или больше из положений 24, 37, 38, 46, 74, 81, 83, 115, 127, 131, 137, 143, 147, 150, 199, 200, 203, 206, 211, 263, 264, 265, 267 и 269 родительской липазы. В конкретном варианте воплощения имеется замещение в по меньшей мере одном из положений, соответствующих положениям 81, 143, 147, 150 и 249. В предпочтительном варианте воплощения по меньшей мере одно замещение выбирают из группы, состоящей из X81Q/E, X143S/C/N/D/A, X147M/Y, X150G/K и X249R/I/L.

Вариант может включать замещения за пределами указанных Областей I-IV, причем число замещений за пределами указанных Областей I-IV предпочтительно составляет менее шести, или менее пяти, или менее четырех, или менее трех, или менее двух, например пять, или четыре, или три, или два, или одно. Альтернативно, вариант не включает каких-либо замещений за пределами указанных Областей I-IV.

Другие замещения могут, например, быть осуществлены в соответствии с принципами, известными специалистам, например замещения, описанные в WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 и WO 97/07202.

Родительские варианты липаз

В одном аспекте указанный вариант, по сравнению с указанным родительским, содержит в общем по меньшей мере три замещения, причем указанные замещения выбирают из одной или больше из следующих групп замещений:

a) по меньшей мере двух, или по меньшей мере трех, или по меньшей мере четырех, или по меньшей мере пяти, или по меньшей мере шести, например двух, трех, четырех, пяти или шести замещений в Области I,

b) по меньшей мере одного, по меньшей мере двух, или по меньшей мере трех, или по меньшей мере четырех, или по меньшей мере пяти, или по меньшей мере шести, например одного, двух, трех, четырех, пяти или шести замещений в Области II,

c) по меньшей мере одного, по меньшей мере двух, или по меньшей мере трех, или по меньшей мере четырех, или по меньшей мере пяти, или по меньшей мере шести, например одного, двух, трех, четырех, пяти или шести замещений в Области III,

d) и/или по меньшей мере одного, по меньшей мере двух, или по меньшей мере трех, или по меньшей мере четырех, или по меньшей мере пяти, или по меньшей мере шести, например одного, двух, трех, четырех, пяти или шести замещений в Области IV.

Вариант может включать замещения, по сравнению с родительским вариантом, соответствующие замещениям, перечисленным ниже в Таблице 1.

В следующем конкретном варианте воплощения родительская липаза идентична SEQ ID NO: 2 и варианты из Таблицы 1 будут, таким образом, представлять:

Номенклатура аминокислотных модификаций

При описании вариантов липаз в соответствии с изобретением для удобства указания используют следующую номенклатуру: Исходная аминокислота(ы):положение(я):замещенная аминокислота(ы).

В соответствии с этой номенклатурой, например, замещение глутаминовой кислоты на глицин в положении 195 описывается как G195E. Делеция глицина в том же положении описывается как G195*, и инсерция дополнительного аминокислотного остатка, такого как лизин, описывается как G195GK. В тех случаях, когда конкретная липаза содержит "делецию" по сравнению с другими липазами и выполняется инсерция в таком положении, это обозначается как *36D для инсерции аспарагиновой кислоты в положении 36. Многочисленные мутации разделены плюсами, т.е.: R170Y+G195E обозначает мутации в положениях 170 и 195 с замещением тирозина и глутаминовой кислоты на аргинин и глицин соответственно.

Х231 указывает аминокислоту в родительском полипептиде, соответствующую положению 231, при применении описанной процедуры сравнительного анализа первичной структуры. X231R указывает, что аминокислота замещается на R. Для SEQ ID NO: 2 X обозначает Т и X231R, таким образом, указывает замещение Т в положении 231 на R. В тех случаях, когда аминокислота в положении (например, 231) может быть замещена на другую аминокислоту, выбранную из группы аминокислот, например группы, состоящей из R, Р и Y, это будет обозначено как X231R/P/Y.

Во всех случаях используются принятые IUPAC однобуквенные или трехбуквенные сокращенные обозначения аминокислот.

Деление аминокислот на группы

В данном описании аминокислоты классифицируются как отрицательно заряженные, положительно заряженные или электрически нейтральные, в соответствии с их электрическим зарядом при pH 10. Таким образом, отрицательно заряженными аминокислотами являются Е, D, С (цистеин) и Y, особенно Е и D. Положительно заряженными аминокислотами являются R, K и Н, особенно R и K. Нейтральными аминокислотами являются G, А, V, L, I, Р, F, W, S, Т, М, N, Q и С, когда он образует часть дисульфидного мостика. Замещение на другую аминокислоту из той же группы (отрицательно заряженной, положительно заряженной или нейтральной) называется консервативным замещением.

Нейтральные аминокислоты могут быть разделены на гидрофобные или неполярные (G, А, V, L, I, Р, F, W и С как часть дисульфидного мостика) и гидрофильные или полярные (S, Т, М, N, Q). В данном описании аминокислоты классифицируются как отрицательно заряженные, положительно заряженные или электрически нейтральные в соответствии с их электрическим зарядом при pH 10. Таким образом, отрицательно заряженными аминокислотами являются Е, D, С (цистеин) и Y, особенно Е и D. Положительно заряженными аминокислотами являются R, K и Н, особенно R и K. Нейтральными аминокислотами являются G, А, V, L, I, Р, F, W, S, Т, М, N, Q и С, когда он образует часть дисульфидного мостика. Замещение на другую аминокислоту из той же группы (отрицательно заряженной, положительно заряженной или нейтральной) называется консервативным замещением.

Нейтральные аминокислоты могут быть разделены на гидрофобные или неполярные (G, А, V, L, I, Р, F, W и С как часть дисульфидного мостика) и гидрофильные или полярные (S, Т, М, N, Q).

Аминокислотная идентичность

Степень сродства между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывается параметром "идентичность".

В целях настоящего изобретения сравнительный анализ первичной структуры двух аминокислотных последовательностей осуществляется с использованием программы Needle из пакета EMBOSS (http://emboss.org), версия 2.8.0. Программа Needle реализует алгоритм глобального сравнения, описанный Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970), J. Mol. Biol., 48, 443-453. Используется матрица замещения BLOSUM62, штраф за начало разрыва равен 10 и штраф за продолжение разрыва равен 0,5.

Степень идентичности между аминокислотными последовательностями по настоящему изобретению ("последовательность по изобретению"; например, аминокислоты 1-269 SEQ ID NO: 2) и отличной от них аминокислотной последовательностью ("чужеродная последовательность") рассчитывается как число точных совпадений при сравнительном анализе первичной структуры двух последовательностей, деленное на длину "последовательности по изобретению" или длину "чужеродной последовательности", в зависимости от того, какая из них короче. Результат выражают в процентах идентичности.

Точное совпадение наблюдается тогда, когда "последовательность по изобретению" и "чужеродная последовательность" имеют идентичные аминокислотные остатки в одинаковых положениях участка перекрывания. Длина последовательности равна числу аминокислотных остатков в последовательности (например, длина SEQ ID NO: 2 равна 269).

Родительская липаза имеет аминокислотную идентичность по меньшей мере 50% с липазой Т. lanuginosus (SEQ ID NO: 2), особенно по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, более 95% или более 98%. В конкретном варианте воплощения родительская липаза идентична липазе Т. lanuginosus (SEQ ID NO: 2).

Описанная выше процедура может быть использована для расчета идентичности, а также гомологии и для сравнительного анализа первичной структуры. В контексте настоящего изобретения гомология и сравнительный анализ первичной структуры рассчитывались, как описано ниже.

Гомология и сравнительный анализ первичной структуры

В целях настоящего изобретения степень гомологии может быть удобно определена с помощью компьютерных программ, известных специалистам, таких как GAP, входящая в программный пакет GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45), при использовании GAP со следующими настройками для сравнения полипептидных последовательностей: штраф за создание разрыва 3,0 и штраф за продолжение разрыва 0,1.

В настоящем изобретении соответствующие (или гомологичные) положения в последовательностях липаз Absidia reflexa, Absidia corymbefera, Rhizmucor miehei, Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus tubigensis, Fusarium oxysporum, Fusarium heterosporum, Aspergillus oryzea, Penicilium camembertii, Aspergillus foetidus, Aspergillus niger, Thermomyces lanoginosus (синоним: Humicola lanuginose) и Landerina penisapora определяют с помощью сравнительного анализа первичной структуры, показанного на Фигуре 1.

Для того чтобы найти гомологичные положения в последовательностях липаз, не показанных в сравнительном анализе первичной структуры, последовательность, представляющую интерес, сравнивают с последовательностями, изображенными на Фигуре 1. Новую последовательность сопоставляют с первичной структурой по настоящему изобретению на Фигуре 1, используя сравнительный анализ первичной структуры методом GAP для наиболее гомологичной последовательности, найденной с помощью программы GAP. GAP входит в программный пакет GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45). Для сравнения полипептидных последовательностей используются следующие параметры настройки: штраф за создание разрыва 3,0 и штраф за продолжение разрыва 0,1.

Родительская липаза имеет гомологию по меньшей мере 50% с липазой Т. lanuginosus (SEQ ID NO: 2), особенно по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, более 95% или более 98%. В конкретном варианте воплощения родительская липаза идентична липазе Т. lanuginosus (SEQ ID NO: 2).

Гибридизация

Настоящее изобретение также относится к изолированным полипептидам, обладающим липазной активностью, которые кодируются полинуклеотидами, гибридизующимися в условиях очень низкой жесткости, предпочтительно условиях низкой жесткости, предпочтительнее условиях средней жесткости, предпочтительнее условиях средневысокой жесткости, еще предпочтительнее условиях высокой жесткости и наиболее предпочтительно условиях очень высокой жесткости, с (i) нуклеотидами 178-660 SEQ ID NO: 1, (ii) последовательностью кДНК, содержащейся в нуклеотидах 178-660 SEQ ID NO: 1, (iii) подпоследовательностью (i) или (ii) или (iv) комплементарной цепью (i), (ii) или (iii) (J.Sambrook, E.F.Fritsch and T.Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York). Подпоследовательность SEQ ID NO: 1 содержит по меньшей мере 100 непрерывных нуклеотидов или предпочтительно по меньшей мере 200 непрерывных нуклеотидов. Кроме того, подпоследовательность может кодировать полипептидный фрагмент, обладающий липазной активностью.

Для длинных зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов условия от очень низкой до очень высокой жесткости определяются как предгибридизация и гибридизация при 42°C в 5×SSPE, 0,3% SDS, 200 мкг/мл деградированной с помощью гидродинамического сдвига и денатурированной ДНК спермы лосося и или 25% формамида для условий очень низкой и низкой жесткости, или 35% для условий средней и средневысокой жесткости, или 50% формамида для высокой и очень высокой жесткости оптимально в соответствии со стандартными процедурами саузерн-блоттинга в течение от 12 до 24 часов.

Для длинных зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов материал носителя в конце промывают три раза по 15 минут с использованием 2×SSC, 0,2% SDS, предпочтительно при по меньшей мере 45°C (очень низкая жесткость), предпочтительнее при по меньшей мере 50°C (низкая жесткость), предпочтительнее при по меньшей мере 55°C (средняя жесткость), предпочтительнее при по меньшей мере 60°C (средневысокая жесткость), еще предпочтительнее при по меньшей мере 65°C (высокая жесткость) и наиболее предпочтительно при по меньшей мере 70°C (очень высокая жесткость).

Последовательность ДНК, вектор экспрессии, клетка-хозяин, продуцирование липазы

Изобретение предусматривает последовательность ДНК, кодирующую липазу по изобретению, вектор экспрессии, включающий последовательность ДНК, и трансформированную клетку-хозяина, содержащую последовательность ДНК или вектор экспрессии. Они могут быть получены с помощью методов, известных специалистам. Изобретение также предусматривает способ продуцирования липазы путем культивации трансформированной клетки-хозяина в условиях, способствующих продуцированию липазы, и выделения липазы из полученной среды. Способ может быть осуществлен в соответствии с принципами, известными специалистам.

Липазная активность

- Липазная активность по трибутирину при нейтральном pH (LU)

Субстрат для липазы готовят путем эмульгирования трибутирина (глицеринтрибутират) с использованием гуммиарабика в качестве эмульгатора. Гидролиз трибутирина при 30°C и pH 7 или 9 отслеживают с помощью титровального эксперимента в pH-стате. Единица липазной активности (1 LU) равняется количеству фермента, способного выделять 1 мкмоль масляной кислоты/мин при pH 7.

- Польза-Риск

Соотношение Польза-Риск, описывающее эффективность по сравнению с уменьшенным риском запаха, определяется как: BR=RP_avg/R. Варианты липаз, описанные в настоящем изобретении, могут иметь BRs больше 1, больше 1,1 или даже от больше 1 до примерно 1000.

- Средняя относительная эффективность

Процедура расчета средней относительной эффективности (RP_avg) приведена в примере 5 настоящего описания. Варианты липаз, описанные в настоящем изобретении, могут иметь (RP_avg) по меньшей мере 0,8, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,5 или даже от по меньшей мере 2 до примерно 1000.

Пригодные оттеночные агенты для ткани

Флуоресцентные оптические осветлители излучают по меньшей мере некоторую часть видимого света. В отличие от них, оттеночные агенты для ткани могут изменять оттенок поверхности за счет поглощения по меньшей мере части спектра видимого света. Пригодные оттеночные агенты для ткани включают красители, конъюгаты краситель-глина и пигменты, удовлетворяющие требованиям Метода испытаний 1 в разделе Методы испытаний настоящего описания. Пригодные красители включают красители с малыми молекулами и полимерные красители. Пригодные красители с малыми молекулами включают красители с малыми молекулами, выбранные из группы, состоящей из:

(1) Трис-азо прямые синие красители формулы

где по меньшей мере два из нафтильных колец А, В и С замещены сульфонатной группой, кольцо С может быть замещено в положении 5 группой NH₂ или NHPh, X обозначает бензильное или нафтильное кольцо, замещенное до 2 сульфонатных групп, и может быть замещено в положении 2 группой ОН и также может быть замещено группой NH₂ или NHPh.

(2) Бис-азо прямые фиолетовые красители формулы:

где Z обозначает Н или фенил, кольцо А предпочтительно замещено метильной и метоксигруппой в положениях, указанных стрелочками, кольцо А также может быть нафтильным кольцом, группа Y представляет собой бензильное или нафтильное кольцо, замещенное сульфатной группой, и может быть моно- или дизамещенной метильными группами.

(3) Синие или красные кислотные красители формулы

где по меньшей мере один из Х и Y должен быть ароматической группой. В одном аспекте обе ароматические группы могут быть замещены бензильной или нафтильной группой, которая может быть замещена не солюбилизирующимися в воде группами, такими как алкильные, или алкилокси-, или арилоксигруппы, Х и Y не могут быть замещены солюбилизирующимися в воде группами, такими как сульфонаты или карбоксилаты. В другом аспекте Х представляет собой нитрозамещенную бензильную группу и Y обозначает бензильную группу.

(4) Красные кислотные красители структуры

или

где В является нафтильной или бензильной группой, которая может быть замещена не солюбилизирующимися в воде группами, такими как алкильные, или алкилокси-, или арилоксигруппы, В не могут быть замещены солюбилизирующимися в воде группами, такими как сульфонаты или карбоксилаты.

(5) Дис-азо красители структуры

или

где Х и Y, независимо друг от друга, обозначают каждый водород, C₁-C₄-алкил или C₁-С₄-алкокси, Rα обозначает водород или арил, Z обозначает С₁-С₄-алкил; C₁-C₄-алкокси; галоген; гидроксил или карбоксил, n равен 1 или 2 и m равен 0, 1 или 2, а также их соответствующие соли и их смеси.

(6) Трифенилметановые красители следующих структур

,

,

,

,

и/или

и их смеси. В другом аспекте пригодные красители с малыми молекулами включают красители с малыми молекулами, выбранные из группы, состоящей из красителей с номерами по Colour Index (Society of Dyers and Colourists, Bradford, UK) прямого фиолетового 9, прямого фиолетового 35, прямого фиолетового 48, прямого фиолетового 51, прямого фиолетового 66, прямого синего 1, прямого синего 71, прямого синего 80, прямого синего 279, кислотного красного 17, кислотного красного 88, кислотного красного 150, кислотного фиолетового 15, кислотного фиолетового 17, кислотного фиолетового 24, кислотного фиолетового 49, кислотного синего 15, кислотного синего 17, кислотного синего 29, кислотного синего 40, кислотного синего 75, кислотного синего 80, кислотного синего 83, кислотного синего 90 и кислотного синего 113, основного фиолетового 1, основного фиолетового 3, основного фиолетового 4, основного фиолетового 10, основного фиолетового 35, основного синего 3, основного синего 16, основного синего 22, основного синего 47, основного синего 66, основного синего 75, основного синего 159 и их смесей.

Пригодные полимерные красители включают полимерные красители, выбранные из группы, состоящей из полимеров, содержащих конъюгированные хромогены (конъюгаты краситель-полимер), и полимеров с хромогенами, сополимеризованными в основную цепь полимера, и их смеси.

В другом аспекте пригодные полимерные красители включают полимерные красители, выбранные из группы, состоящей из субстантивных красителей для тканей, продаваемых под наименованием Liquitint® (Milliken, Spartanburg, South Carolina, USA), конъюгаты краситель-полимер, образованные из по меньшей мере одного реакционно-способного красителя и полимера, выбранного из группы, состоящей из полимеров, включающих фрагмент, выбранный из группы, состоящей из гидроксильной группы, первичной аминогруппы, вторичной аминогруппы, тиольной группы и их смесей. В еще одном аспекте пригодные полимерные красители включают полимерные красители, выбранные из группы, состоящей из Liquitint® (Milliken, Spartanburg, South Carolina, USA), фиолетовый CT, карбоксиметилцеллюлозы (CMC), конъюгированной с реактивным синим, реактивным фиолетовым или реактивным красным красителем, такой как CMC, конъюгированная с CL реактивным синим 19, которая продается фирмой Megazyme, Wicklow, Ireland, под торговым знаком AZO-CM-CELLULOSE, код продукта S-ACMC, и их смеси.

Пригодные конъюгаты краситель-глина включают конъюгаты краситель-глина, выбранные из группы, включающей по меньшей мере один катионный/основный краситель и смектитную глину и их смеси. В другом аспекте пригодные конъюгаты краситель-глина включают конъюгаты краситель-глина, выбранные из группы, состоящей из одного катионного/основного красителя, выбранного из группы, состоящей из основных желтых C.I. 1-108, основных оранжевых C.I. 1-69, основных красных C.I. 1-118, основных фиолетовых C.I. 1-51, основных синих C.I. 1-164, основных зеленых C.I. 1-14, основных коричневых C.I. 1-23, основных черных C.I. 1-11, и глины, выбранной из группы, состоящей из монтмориллонитовой глины, гекторитовой глины, сапонитовой глины и их смесей. В еще одном аспекте пригодные конъюгаты краситель-глина включают конъюгаты краситель-глина, выбранные из группы, состоящей из конъюгата монтмориллонита и основного синего В7 C.I. 42595, конъюгата монтмориллонита и основного синего В9 C.I. 52015, конъюгата монтмориллонита и основного фиолетового V3 C.I. 42555, конъюгата монтмориллонита и основного зеленого G1 C.I. 42040, конъюгата монтмориллонита и основного красного R1 C.I. 45160, конъюгата монтмориллонита и основного черного C.I. 2, конъюгата гекторита и основного синего В7 C.I. 42595, конъюгата гекторита и основного синего В9 C.I. 52015, конъюгата гекторита и основного фиолетового V3 C.I. 42555, конъюгата гекторита и основного зеленого G1 C.I. 42040, конъюгата гекторита и основного красного R1 C.I. 45160, конъюгата гекторита и основного черного C.I. 2, конъюгата сапонита и основного синего В7 C.I. 42595, конъюгата сапонита и основного синего В9 C.I. 52015, конъюгата сапонита и основного фиолетового V3 C.I. 42555, конъюгата сапонита и основного зеленого G1 C.I. 42040, конъюгата сапонита и основного красного R1 C.I. 45160, конъюгата сапонита и основного черного C.I. 2, и их смеси.

Пригодные пигменты включают пигменты, выбранные из группы, состоящей из флавантрона, индантрона, хлорированного индантрона, содержащего от 1 до 4 атомов хлора, пирантрона, дихлорпирантрона, монобромдихлорпирантрона, дибромдихлорпирантрона, тетрабромпирантрона, диимида перилен-3,4,9,10-тетракарбоновой кислоты, где имидные группы могут быть незамещенными или замещенными С₁-С₃-алкилом, или фенилом, или гетероциклическим радикалом и где фенил и гетероциклические радикалы могут дополнительно нести заместители, которые не придают растворимости в воде, амидов антрапиримидинкарбоновой кислоты, виолантрона, изовиолантрона, диоксазиновых пигментов, фталоцианина меди, который может содержать до 2 атомов хлора в молекуле, полихлорфталоцианинов меди или полибромхлорфталоцианинов меди, содержащих до 14 атомов брома в молекуле, и их смеси. В другом аспекте пригодные пигменты включают пигменты, выбранные из группы, состоящей из ультрамаринового синего (C.I. пигментный синий 29), ультрамаринового фиолетового (C.I. пигментный фиолетовый 15), и их смеси.

Вышеупомянутые оттеночные агенты для ткани могут быть использованы в комбинации (может быть использована любая смесь оттеночных агентов для ткани). Пригодные оттеночные агенты для ткани могут быть закуплены у Aldrich, Milwaukee, Wisconsin, USA; Ciba Specialty Chemicals, Basel, Switzerland; BASF, Ludwigshafen, Germany; Dayglo Color Corporation, Mumbai, India; Organic Dyestuffs Corp., East Providence, Rhode Island, USA; Dystar, Frankfurt, Germany; Lanxess, Leverkusen, Germany; Megazyme, Wicklow, Ireland; Clariant, Muttenz, Switzerland; Avecia, Manchester, UK, и/или изготовлены в соответствии с примерами, приведенными в настоящем изобретении.

Вспомогательные материалы

Хотя это не существенно в целях настоящего изобретения, неограничивающий перечень вспомогательных веществ, описанных тут и далее, является пригодным для использования в композициях по настоящему изобретению и может быть желательным для включения в некоторые варианты воплощения изобретения, например, для обеспечения или повышения эффективности очистки, для обработки субстрата, нуждающегося в очистке, или для модификации эстетических характеристик моющего средства, как в случае отдушек, красящих веществ, красителей и т.п. Точный характер этих дополнительных компонентов и уровни их содержания будут зависеть от физической формы композиции и характера операции очистки, для которой они должны использоваться. Пригодные вспомогательные материалы включают, без ограничения, поверхностно-активные вещества, основные компоненты, хелатирующие агенты, агенты, ингибирующие перенос красителя, диспергенты, дополнительные ферменты и стабилизаторы ферментов, каталитические материалы, активаторы отбеливания, перекись водорода, источники перекиси водорода, предварительно подготовленные перкислоты, полимерные диспергенты, агенты для удаления частиц грязи и предотвращения их повторного осаждения, осветлители, пеногасящие добавки, красители, отдушки, эластификаторы структуры, мягчители ткани, носители, гидротропные вещества, технологические добавки, растворители и/или пигменты. В дополнение к приведенному ниже описанию, пригодные примеры таких других вспомогательных веществ и уровни их использования приведены в патентах США №№5576282, 6306812 В1 и 6326348 В1, которые включены сюда в качестве ссылок.

Как указывалось, вспомогательные ингредиенты не являются существенными для заявляемых композиций. Таким образом, определенные варианты воплощения заявляемых композиций не содержат один или больше из следующих материалов вспомогательных веществ: поверхностно-активные вещества, основные компоненты, хелатирующие агенты, агенты, ингибирующие перенос красителя, диспергенты, дополнительные ферменты и стабилизаторы ферментов, каталитические материалы, активаторы отбеливания, перекись водорода, источники перекиси водорода, предварительно подготовленные перкислоты, полимерные диспергенты, агенты для удаления частиц грязи и предотвращения их повторного осаждения, осветлители, пеногасящие добавки, красители, отдушки, эластификаторы структуры, мягчители ткани, носители, гидротропные вещества, технологические добавки, растворители и/или пигменты. Однако, в случае присутствия одного или больше вспомогательных веществ, может присутствовать такое одно или больше из вспомогательных веществ, указанных ниже.

Отбеливающие агенты. Моющие композиции по настоящему изобретению могут включать один или больше отбеливающих агентов. Пригодные отбеливающие агенты, отличные от катализаторов отбеливания, включают фотоотбеливатели, активаторы отбеливания, перекись водорода, источники перекиси водорода, предварительно подготовленные перкислоты и их смеси. В общем, в случае использования отбеливающего агента, композиции по настоящему изобретению могут включать от примерно 0,1% до примерно 50% или даже от примерно 0,1% до примерно 25% отбеливающего агента от веса данной моющей композиции. Примеры пригодных отбеливающих агентов включают:

(1) фотоотбеливатели, например сульфированный фталоцианин цинка;

(2) предварительно подготовленные перкислоты: пригодные предварительно подготовленные перкислоты включают, без ограничения, соединения, выбранные из группы, состоящей из перкарбоновых кислот и солей, перугольных кислот и солей, перимидных кислот и солей, пероксимоносерных кислот и солей, например Oxzone®, и их смеси. Пригодные перкарбоновые кислоты включают гидрофобные и гидрофильные перкислоты, имеющие формулу R-(C=O)O-O-M, где R обозначает алкильную группу, опционально разветвленную, содержащую, в тех случаях, когда перкислота является гидрофобной, от 6 до 14 атомов углерода или от 8 до 12 атомов углерода и, в тех случаях, когда перкислота является гидрофильной, менее 6 атомов углерода или даже менее 4 атомов углерода; и М обозначает противоион, например натрий, калий или водород;

(3) источники перекиси водорода, например неорганические пергидратные соли, включая соли щелочных металлов, такие как натриевые соли перборатов (обычно моно- или тетрагидраты), перкарбонатные, персульфатные, перфосфатные, персиликатные соли и их смеси. В одном аспекте изобретения неорганические пергидратные соли выбирают из группы, состоящей из натриевых солей пербората, перкарбоната, и их смеси. В случае использования неорганические пергидратные соли типично присутствуют в количестве от 0,05 до 40% мас. или от 1 до 30% мас. от общего количества композиции и типично включаются в такие композиции в виде кристаллического твердого вещества, которое может иметь покрытие. Пригодные покрытия включают неорганические соли, такие как силикатные, карбонатные или боратные соли щелочных металлов или их смеси, или органические материалы, такие как водорастворимые или диспергирующиеся полимеры, воска, масла или жирные мыла; и

(4) активаторы отбеливания, имеющие формулу R-(C=O)-L, где R обозначает алкильную группу, опционально разветвленную, содержащую, в тех случаях, когда активатор отбеливателя является гидрофобным, от 6 до 14 атомов углерода или от 8 до 12 атомов углерода и, в тех случаях, когда активатор отбеливателя является гидрофильным, менее 6 атомов углерода или даже менее 4 атомов углерода; и L обозначает отходящую группу. Примерами пригодных отходящих групп являются бензойная кислота и ее производные - особенно бензолсульфонат. Пригодные активаторы отбеливания включают додеканоилоксибензолсульфонат, деканоилоксибензолсульфонат, деканоилоксибензойную кислоту или ее соли, 3,5,5-триметилгексаноилоксибензолсульфонат, тетраацетилэтилендиамин (TAED) и нонаноилоксибензолсульфонат (NOBS). Пригодные активаторы отбеливания также раскрыты в WO 98/17767. Хотя может быть использован любой пригодный активатор отбеливателя, в одном аспекте изобретения являющаяся предметом изобретения моющая композиция может включать NOBS, TAED или их смеси.

В случае присутствия перкислота и/или активатор отбеливателя обычно присутствуют в композиции в количестве от примерно 0,1 до примерно 60% мас., от примерно 0,5 до примерно 40% мас. или даже от примерно 0,6 до примерно 10% мас. от композиции. Одна или больше гидрофобных перкислот или ее прекурсоров может быть использована в комбинации с одной или больше гидрофильной перкислотой или ее прекурсором.

Количество источника перекиси водорода и перкислоты или активатора отбеливателя может быть выбрано таким образом, что молярное отношение доступного кислорода (из источника пероксида) к перкислоте составляет от 1:1 до 35:1 или даже от 2:1 до 10:1.

Поверхностно-активные вещества. Моющие композиции в соответствии с настоящим изобретением могут включать поверхностно-активное вещество или систему поверхностно-активного вещества, где поверхностно-активное вещество может быть выбрано из неионных поверхностно-активных веществ, анионных поверхностно-активных веществ, катионных поверхностно-активных веществ, амфолитных поверхностно-активных веществ, цвиттерионных поверхностно-активных веществ, полуполярных неионных поверхностно-активных веществ и их смеси. В случае присутствия поверхностно-активное вещество типично присутствует в количестве от примерно 0,1% до примерно 60%, от примерно 1% до примерно 50% или даже от примерно 5% до примерно 40% мас. от являющейся предметом изобретения композиции.

Основные компоненты. Моющие композиции по настоящему изобретению могут включать один или больше основных компонентов моющего средства или системы основного компонента. В случае использования основного компонента являющаяся предметом изобретения композиция будет типично включать по меньшей мере примерно 1%, от примерно 5% до примерно 60% или даже от примерно 10% до примерно 40% основного компонента от веса являющейся предметом изобретения композиции. Основные компоненты включают, без ограничения, полифосфатные соли щелочных металлов, аммония и алканоламмония, силикаты щелочных металлов, карбонаты щелочноземельных и щелочных металлов, алюмосиликатные основные компоненты и поликарбоксилатные соединения, простые эфиры гидроксиполикарбоксилатов, сополимеры малеинового ангидрида с этиленом или винилметиловым эфиром, 1,3,5-тригидроксибензол-2,4,6-трисульфоновую кислоту и карбоксиметилоксиянтарную кислоту, различные соли щелочных металлов, аммония и замещенного аммония полиуксусных кислот, таких как этилендиаминтетрауксусная кислота и нитрилотриуксусная кислота, а также поликарбоксилаты, такие как меллитовая кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, оксидиянтарная кислота, полималеиновая кислота, бензол-1,3,5-трикарбоновая кислота, карбоксиметилоксиянтарная кислота и их растворимые соли.

Хелатирующие агенты. Моющие композиции по настоящему изобретению могут содержать хелатирующий агент. Пригодные хелатирующие агенты включают хелатирующие агенты меди, железа и/или марганца и их смеси. В случае использования хелатирующего агента являющаяся предметом изобретения композиция может включать от примерно 0,005% до примерно 15% или даже от примерно 3,0% до примерно 10% хелатирующего агента от веса являющейся предметом изобретения композиции.

Агенты, ингибирующие перенос красителя. Моющие композиции по настоящему изобретению также могут включать один или больше агентов, ингибирующих перенос красителя. Пригодные полимерные агенты, ингибирующие перенос красителя, включают, без ограничения, поливинилпирролидоновые полимеры, полиамин-N-оксидные полимеры, сополимеры N-винилпирролидона и N-винилимидазола, поливинилоксазолидоны и поливинилимидазолы или их смеси. В случае присутствия в являющейся предметом изобретения композиции агенты, ингибирующие перенос красителя, могут присутствовать в количестве от примерно 0,0001% до примерно 10%, от примерно 0,01% до примерно 5% или даже от примерно 0,1% до примерно 3% от веса композиции.

Осветлители. Моющие композиции по настоящему изобретению могут также содержать дополнительные компоненты, которые могут подкрашивать изделия, подвергающиеся стирке, такие как флуоресцентные осветлители. Пригодные уровни флуоресцентного осветлителя включают низкие уровни, от примерно 0,01, от примерно 0,05, от примерно 0,1 или даже от примерно 0,2% мас., до верхних уровней в 0,5 или даже 0,75% мас.

Диспергенты. Композиции по настоящему изобретению могут также содержать диспергенты. Пригодные водорастворимые органические материалы включают гомо- или сополимерные кислоты или их соли, в которых поликарбоновая кислота содержит по меньшей мере два карбоксильных радикала, отделенных друг от друга не более чем двумя атомами углерода.

Дополнительные ферменты. Моющие композиции могут включать один или больше ферментов, которые обеспечивают эффективность очистки и/или ухода за тканью. Примеры пригодных ферментов включают, без ограничения, гемицеллюлазы, пероксидазы, протеазы, целлюлазы, ксиланазы, липазы, фосфолипазы, эстеразы, кутиназы, пектиназы, маннаназы, пектатлиазы, кератиназы, редуктазы, оксидазы, фенолоксидазы, липоксидазы, лигниназы, пуллуланазы, танназы, пентозаназы, маланазы, β-глюканазы, арабинозидазы, гиалуронидазу, хондроитиназу, лакказу и амилазы или их смеси. Типичная комбинация представляет собой ферментный коктейль, который может содержать, например, протеазу и липазу в сочетании с амилазой. В случае присутствия в моющей композиции вышеупомянутые дополнительные ферменты могут присутствовать в количестве от примерно 0,00001% до примерно 2%, от примерно 0,0001% до примерно 1% или даже от примерно 0,001% до примерно 0,5% ферментного белка от веса композиции.

Стабилизаторы ферментов. Ферменты для использования в моющих средствах могут быть стабилизированы разными способами. Ферменты, используемые в настоящем изобретении, могут быть стабилизированы присутствием в готовых композициях водорастворимых источников ионов кальция и/или магния, которые обеспечивают доставку таких ионов к ферментам. В случае водных композиций, содержащих протеазу, для дополнительного повышения стабильности может быть добавлен обратимый ингибитор протеазы, такой как соединение бора.

Каталитические комплексы металлов. Заявляемые моющие композиции могут включать каталитические комплексы металлов. Одним из типов металлсодержащего катализатора отбеливания является система катализатора, включающая катион переходного металла с определенной каталитической активностью отбеливания, такой как катионы меди, железа, титана, рутения, вольфрама, молибдена или марганца, вспомогательный катион металла, имеющий незначительную или не имеющий каталитической активности отбеливания, такой как катионы цинка или алюминия, и секвестрант, имеющий определенные константы устойчивости с каталитическими и вспомогательными катионами металлов, особенно этилендиаминтетрауксусная кислота, этилендиаминтетра (метиленфосфоновая кислота) и их водорастворимые соли. Такие катализаторы раскрыты в US 4430243.

При необходимости, композиции по настоящему изобретению могут быть катализированы с помощью соединения марганца. Такие соединения и уровни их использования хорошо известны специалистам и включают, например, катализаторы на основе марганца, раскрытые в US 5576282.

Кобальтовые катализаторы отбеливания, пригодные для использования в данном изобретении, известны и описаны, например, в US 5597936; US 5595967. Такие кобальтовые катализаторы легко получают известными методами, такими как описанные, например, в US 5597936 и US 5595967.

Композиции по настоящему изобретению также могут пригодно включать комплекс переходного металла с лигандами, такими как биспидоны (WO 05/042532 А1) и/или жесткие макрополициклические лиганды - сокращенно обозначенные "MRLs". На практике и без ограничения, композиции и способы по настоящему изобретению могут быть откорректированы для обеспечения порядка по меньшей мере одной части на сто миллионов активных частиц MRL в водной моющей среде и будут типично обеспечивать от примерно 0,005 млн^-1 до примерно 25 млн^-1, от примерно 0,05 млн^-1 до примерно 10 млн^-1 или даже от примерно 0,1 млн^-1 до примерно 5 млн^-1 MRL в моющем растворе.

Пригодные переходные металлы в катализаторе отбеливания на основе переходного металла по настоящему изобретению включают, например, марганец, железо и хром. Пригодные MRLs включают 5,12-диэтил-1,5,8,12-тетраазабицикло[6.6.2]гексадекан.

Пригодные MRLs на основе переходных металлов легко получают известными методами, такими как описанные, например, в WO 00/32601 и US 6225464.

Растворители. Пригодные растворители включают воду и другие растворители, такие как липофильные жидкие среды. Примеры пригодных липофильных жидких сред включают силоксаны, другие силиконы, углеводороды, простые гликолевые эфиры, производные глицерина, такие как простые эфиры глицерина, перфторированные амины, перфторированные и гидрофторэфирные растворители, низколетучие нефторированные органические растворители, диольные растворители, другие экологически безопасные растворители и их смеси.

Способы получения композиций

Композиции по настоящему изобретению могут быть составлены в любой пригодной форме и изготовлены любым способом, выбранным составителем, неограничивающие примеры которых описаны в примерах заявки и в US 4990280; US 20030087791 A1; US 20030087790 A1; US 20050003983 A1; US 20040048764 A1; US 4762636; US 6291412; US 20050227891 A1; EP 1070115 A2; US 5879584; US 5691297; US 5574005; US 5569645; US 5565422; US 5516448; US 5489392; US 5486303, которые все включены в настоящее изобретение в качестве ссылок.

Способ применения

Настоящее изобретение включает способ очистки и/или обработки участка, в т.ч. поверхности или ткани. Такой способ включает стадии введения в контакт варианта воплощения заявляемой моющей композиции, в неразведенном виде или разведенной в моющем растворе, с по меньшей мере частью поверхности или ткани, а затем, опционально, полоскание такой поверхности или ткани. Поверхность или ткань может быть подвергнута стадии стирки перед вышеупомянутой стадией полоскания. В целях настоящего изобретения стирка включает, без ограничения, отмывку и механическое перемешивание. Как будет понятно специалистам в данной области, моющие композиции по настоящему изобретению идеально подходят для использования при стирке. Соответственно, настоящее изобретение включает способ стирки ткани. Способ включает стадии введения в контакт ткани, подлежащей стирке, с указанным моющим раствором для стирки, содержащим по меньшей мере один вариант воплощения заявляемой моющей композиции, моющую добавку или их смесь. Ткань может включать практически любую ткань, пригодную для стирки в нормальных условиях использования. Раствор предпочтительно имеет pH от примерно 8 до примерно 10,5. Композиции могут быть использованы в концентрациях от примерно 500 млн^-1 до примерно 15000 млн^-1 в растворе. Температура воды типично составляет от примерно 5°C до примерно 90°C. Соотношение вода:ткань типично составляет от примерно 1:1 до примерно 30:1.

МЕТОД ИСПЫТАНИЙ 1

Ниже приведен протокол определения того, является ли краситель или пигментный материал оттеночным агентом для ткани в целях данного изобретения.

1) Наполняют два терготометрических сосуда 800 мл воды из городского водопровода Newcastle upon Tyne, UK (общая жесткость ок. 12 гран на американский галлон - поставлялась Northumbrian Water, Pity Me, Durham, Co. Durham, UK).

2) Устанавливают сосуды в терготометр при заданной температуре воды 30°C и скорости перемешивания 40 об/мин на протяжении эксперимента.

3) Добавляют в каждый сосуд 4,8 г моющего средства IEC-B (IEC 60456 Эталонное основное моющее средство для стиральных машин тип В) - поставлялось wfk, Brüggen-Bracht, Germany.

4) Через две минуты добавляют в первый сосуд 2,0 мг активного красящего средства.

5) Через одну минуту добавляют в каждый сосуд 50 г ткани из непрессованного хлопка для жилетов (поставлялась Warwick Equest, Consett, County Durham, UK), разрезанной на образцы 5 см × 5 см.

6) Через 10 минут выливают жидкость из сосудов и снова заполняют их холодной водой из городского водопровода Newcastle upon Tyne (16°C).

7) После 2 минут полоскания вынимают ткань.

8) Повторяют стадии 3-7 еще три раза с использованием такой же процедуры обработки.

9) Собирают и сушат на веревке ткань в помещении в течение 12 часов.

10) Анализируют образцы с использованием спектрометра Hunter Miniscan, оснащенного источником света D65 и UVA отсекающим фильтром, для получения значений Hunter a (ось красный-зеленый) и Hunter b (ось желтый-зеленый).

11) Усредняют значения Hunter а и Hunter b для каждого набора тканей. Если ткани, обработанные тестируемым красящим веществом, показывают среднее отличие оттенка более 0,2 единиц по оси а или оси b, то оно считается оттеночным агентом для ткани в целях настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Примеры вариантов липаз

Химикаты, используемые в качестве буферов и субстратов, являются коммерческими продуктами, по меньшей мере химически чистыми.

- Среды и растворы: LAS (Surfac PS™) и цеолит A (Wessalith P™). Другие используемые ингредиенты являются стандартными лабораторными реагентами.

- Материалы: ЕМРА221 от ЕМРА St. Gallon, Lerchfeldstrasse 5, CH-9014 St. Gallon, Switzerland.

Пример 1: Продуцирование фермента

Плазмиду, содержащую ген, кодирующий липазу, конструируют и трансформируют в пригодную клетку-хозяина с использованием стандартных методов, известных специалистам.

Ферментация проводится как периодическая ферментация с подпиткой с использованием постоянной температуры среды, равной 34°C, и начальным объемом, равным 1,2 литра. Исходное pH среды устанавливают равным 6,5. После того как pH повысится до 7,0, это значение поддерживают путем добавления 10% H₃PO₄. Уровень растворенного кислорода в среде контролируют путем изменения скорости перемешивания с использованием постоянной скорости аэрации, равной 1,0 литр воздуха на литр среды в минуту. Скорость подачи сырья поддерживают постоянной на всем протяжении фазы периодической ферментации с подпиткой.

Маточная среда содержит мальтозный сироп в качестве источника углерода, мочевину и дрожжевой экстракт в качестве источника азота и смесь металлических микроэлементов и солей. Сырье, добавляемое непрерывно на протяжении фазы периодической ферментации с подпиткой, содержит мальтозный сироп в качестве источника углерода, в то время как дрожжевой экстракт и мочевину добавляют для обеспечения достаточного количества азота.

Очистка липазы может быть осуществлена с использованием стандартных методов, известных специалистам, например путем фильтрации ферментационного супернатанта и последующей гидрофобной хроматографии и анионного обмена, например, как описано в ЕР 0851913, Пример 3.

Пример 2: AMSA - Автоматизированный анализ с механической нагрузкой - для расчета относительной эффективности (RP)

Проводят испытания вариантов ферментов по данной заявке с использованием автоматизированного анализа с механической нагрузкой (AMSA). С помощью теста AMSA может быть проанализирована моющая способность большого количества небольших объемов растворов фермента-моющего средства. Пластина AMSA имеет ряд прорезей для тестируемых растворов и крышку, плотно прижимающую предназначенный для стирки текстильный образец ко всем отверстиям прорезей. Во время стирки пластину, тестируемые растворы, текстиль и крышку энергично встряхивают для того, чтобы привести тестируемый раствор в контакт с текстилем и приложить механическое напряжение. Более подробное описание приведено в WO 02/42740, особенно параграф "Специальные варианты воплощения способа" на страницах 23-24. Контейнеры, содержащие тестируемые растворы моющего средства, представляют собой цилиндрические отверстия (диаметр 6 мм, глубина 10 мм) в металлической пластине. Загрязненную ткань (тестируемый материал) укладывают на металлическую пластину и используют в качестве крышки и уплотнения для контейнеров. Другую металлическую пластину укладывают на загрязненную ткань во избежание утечки из каждого контейнера. Две металлические пластины вместе с загрязненной тканью колеблются вверх-вниз с частотой 30 Гц, с амплитудой 2 мм.

Анализ проводят в условиях эксперимента, указанных ниже.

Образцы крем-куркума готовят путем смешения 5 г куркумы (Santa Maria, Denmark) со 100 г крема (38% жира, Aria, Denmark) при 50°C, смесь оставляют при этой температуре примерно на 20 минут и фильтруют (50°C) для удаления нерастворенных частиц. Смесь охлаждают до 20°C, образцы хлопчатобумажной ткани ЕМРА221 погружают в смесь крем-куркума и после этого оставляют сохнуть при комнатной температуре в течение ночи и замораживают до использования. Приготовление образцов крем-куркума раскрыто в патентной заявке РА 200500775, поданной 27 мая 2005.

Эффективность варианта фермента измеряют как яркость окраски текстильных образцов, выстиранных с данным конкретным вариантом фермента. Яркость также может быть выражена как интенсивность света, отраженного от текстильного образца при освещении белым светом. Когда текстиль загрязнен, интенсивность отраженного света ниже, чем у чистого текстиля. Таким образом, интенсивность отраженного света может быть использована для измерения моющей способности варианта фермента.

Измерения цвета выполняют с помощью профессионального планшетного сканера (PFU DL2400pro), который используют для получения изображения выстиранных текстильных образцов. Сканы делают с разрешением 200 dpi и с глубиной цвета 24 бит. Для получения точных результатов сканер часто калибруют с помощью отражательного эталона Kodak IT8.

Для получения значения интенсивности света для сканированных изображений используют специально разработанную прикладную программу (Novozymes Color Vector Analyzer). Программа осуществляет выборку 24-битовых значений пикселей из изображения и преобразует их в значения красного, зеленого и синего (RGB). Значение интенсивности (Int) рассчитывается путем векторного сложения значений RGB с последующим определением длины полученного вектора:

.

Моющая способность (Р) вариантов рассчитывается по формуле:

Р=Int(v)-Int(r), где

Int(v) обозначает значение интенсивности света для поверхности текстиля, выстиранного с тестируемым ферментом, и Int(r) обозначает значение интенсивности света для поверхности текстиля, выстиранного без тестируемого фермента.

Балльная оценка относительной эффективности определяется как результат стирки AMSA в соответствии со следующим определением: балльные оценки относительной эффективности (RP) представляют собой отношение суммы эффективностей (Р) тестируемых вариантов ферментов к эталонному ферменту: RP=Р(тестируемый фермент)/Р(эталонный фермент). RP_avg указывает среднюю относительную эффективность по сравнению с эталонным ферментом при всех четырех концентрациях фермента (0,125, 0,25, 0,5, 1,0 мг ф.б./л)

RP_avg=avg(RP(0,125), RP(0,25), RP(0,5), RP(1,0))

Считается, что вариант обладает улучшенной моющей способностью, если его показатели выше, чем у эталона. В контексте настоящего изобретения эталонным ферментом является липаза SEQ ID NO: 2 с замещениями T231R+N233R.

Пример 3: GC - Газовый хроматограф - для расчета фактора риска

Выделение масляной кислоты из образцов, выстиранных с липазой, измеряют методом газовой хроматографии с твердофазовой микроэкстракцией (SPME-GC) с использованием следующей методики. Четыре куска текстиля (5 мм в диаметре), выстиранные в растворе, указанном в Таблице 3, содержащем 1 мг/л липазы, переносят во флакон для газового хроматографа (GC). Образцы анализируют на приборе Varian 3800 GC, оснащенном Stabilwax-DA с колонкой Integra-Guard (30 м, 0,32 мм ID (внутренний диаметр) и 0,25 мкм df) и волокном Carboxen PDMS SPME (75 мкм). Каждый образец предварительно инкубируют в течение 10 мин при 40°C с последующим 20 мин отбором проб с помощью волокна SPME из пространства над кусками текстиля. Образец затем вводят в колонку (температура инжектора = 250°C). Расход в колонке = 2 мл гелия/мин. Температурный градиент печи колонки: 0 мин = 40°C, 2 мин = 40°C, 22 мин = 240°C, 32 мин = 240°C. Масляную кислоту детектируют с помощью пламенно-ионизационного детектора (FID), и количество масляной кислоты рассчитывается с помощью стандартной кривой для масляной кислоты.

Коэффициент риска запаха R варианта липазы представляет собой соотношение между количеством выделяющейся масляной кислоты из образца, который стирают с вариантом липазы, и количеством выделяющейся масляной кислоты из образца, который стирают с липазой SEQ ID NO: 2 с замещениями T231R+N233R (эталонный фермент), после внесения поправок в оба значения на количество масляной кислоты, выделяющейся из образца, который стирают без липазы. Риск (R) для вариантов рассчитывается в соответствии со следующей формулой:

Запах = измеренное в мкг количество масляной кислоты, выделяющейся при 1 мг ферментного белка/л с поправкой на холостой опыт

α_{тестируемый фермент} = запах_{тестируемый фермент} - Холостой опыт

α_{эталонный фермент} = запах_{эталонный фермент} - Холостой опыт

R=α_{тестируемый фермент}/α_{эталонный фермент}

Считается, что вариант обладает уменьшенным запахом по сравнению с эталоном, если коэффициент R меньше 1.

Пример 4: Отношение активности (LU) к оптической плотности при 280 нм

Отношение активности к оптической плотности при 280 нм определяется с помощью следующего анализа.

LU/A280:

Активность липазы определяется, как описано выше в разделе Липазная активность. Измеряют оптическую плотность липазы при 280 нм (А280) и рассчитывают соотношение LU/A280. Относительная LU/A280 рассчитывается как LU/A280 варианта, деленная на LU/A280 эталонного фермента. В контексте настоящего изобретения эталонным ферментом является липаза SEQ ID NO: 2 с замещениями T231R+N233R.

Пример 5: BR - Польза-Риск

Соотношение Польза-Риск, описывающее соотношение эффективности и сниженного риска запаха, определяется следующим образом: BR=RP_avg/R.

Считается, что вариант обладает улучшенной моющей способностью и уменьшенным запахом, если коэффициент BR больше 1.

С использованием описанных выше методов были получены следующие результаты.

Эталонная липаза и варианты 7 и 8 в Таблице 4 описаны в WO 2000/060063.

Пример 6

BR - Польза-Риск

Измеряют соотношение Польза-Риск для вариантов, перечисленных в Таблице 5. Соотношение Польза-Риск измеряют таким же образом, как описано в примере 5, и его найденные значения были выше 1 для всех перечисленных вариантов.

Эталонная липаза описана в WO 2000/060063.

ПРИМЕРЫ КОМПОЗИЦИЙ

Если не указано иное, материалы могут быть получены от Aldrich, P.O. Box 2060, Milwaukee, WI 53201, USA.

Примеры 1-6

Гранулированные композиции моющих средств для стирки, предназначенные для ручной стирки или для стиральных машин с верхней загрузкой

Любую из вышеприведенных композиций используют для стирки ткани в концентрации 600-10000 млн^-1 в воде при типичных медианных условиях 2500 млн^-1, 25°C и соотношении вода : ткань 25:1.

Примеры 7-10

Гранулированные композиции моющих средств для стирки, предназначенные для автоматических стиральных машин с передней загрузкой

Любую из вышеприведенных композиций используют для стирки ткани в концентрации 10000 млн^-1 в воде, 20-90°C, при соотношении вода : ткань 25:1. Типичный pH равен примерно 10.

Примеры 11-16

Жидкие композиции моющих средств для стирки сильно загрязненных изделий

Хотя были проиллюстрированы и описаны конкретные варианты воплощения настоящего изобретения, специалистам в данной области техники будет очевидно, что различные другие изменения и модификации могут быть выполнены без нарушения сущности и объема изобретения. Поэтому предполагается, что приложенная формула изобретения охватывает все такие изменения и модификации, входящие в объем настоящего изобретения.