Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФТОРУГЛЕРОДНОГО ГЕМОСОРБЕНТА И ФТОРУГЛЕРОДНЫЙ ГЕМОСОРБЕНТ (ВНИИТУ-1Ф)

Изобретение относится к технологии получения сорбентов с иммобилизованным белком, позволяющих селективно сорбировать вирусные частицы гепатита В (поверхностный антиген гепатита В, ДНК вируса гепатита В). Предназначено для применения в сорбционной терапии, протеомике, медицинской диагностике, биотехнологии.

В настоящее время в мире насчитывается 350 миллионов человек с хронической HBV-инфекцией (гепатит В) (Lee W. Hepatitis В virus infection. // N. Engl. J. Med. 1997. Vol.337. P.1733-1745). Носители вируса гепатита В представляют собой группу высокого риска по развитию цирроза печени, печеночной недостаточности и гепатоцеллюлярной карциномы (Beasley R.P. Hepatitis В virus: the major etiology of hepatocellular carcinoma. // Cancer. 1988. Vol.61. P.1942-1956; McMahon B.J. Hepatocellular carcinoma and viral hepatitis. In: Wilson R.A., ed. Viral Hepatitis. New York: Marcel Dekker, 1997. P.315-330).

Одним из перспективных способов решения этой острой проблемы является разработка и получение биоспецифических сорбентов - модифицированных материалов с иммобилизованными на их поверхности биологическими активными веществами (органические вещества с различными функциональными группами, лиганды, ферменты, аминокислоты и др.) (Лисичкин Г.В. Химия привитых поверхностных соединений. М.: Физматлит, 2003. 592 с.).

Известны сорбенты на основе акрилатов и кремнийорганических соединений с последующей иммобилизацией биологических молекул высокой молекулярной массы (патенты US №№7122381, 7713421, 7173001). Основными недостатками известных материалов неуглеродной природы является малый размер частиц (менее 100 мкм), что может привести к проникновению в клетки крови и их травмированию; ограниченная сорбционная способность по молекулярной массе токсинов (патогенных частиц) - сорбция низкомолекулярных веществ либо неселективная сорбция высокомолекулярных соединений - вирусов, бактерий, без учета их возможной конкурентной сорбции, что значительно снижает сорбционную способность материала.

Известны биоматериалы - планшеты различных типов полистиролов, изготовленных фирмами-производителями ВНИИмедполимер (Россия) и Costar 3590 (США) с иммобилизованными на их поверхности моноклональными антителами HV 42 (ЗАО «Биосан», Россия) (Б.Н.Зайцев, И.В.Юдина, А.Н.Канев. // Биотехнология. 2006. №1. С.89-96). Иммобилизацию моноклональных антител осуществляют из бикарбонатного буфера, pH 9,6, при концентрации антител 6 мкг/мл в течение ночи при 4°С. Иммобилизованные антитела способны захватывать частицы поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Физическая сорбция моноклональных антител является существенным недостатком полистирольных планшетов, так как антитела, связанные с частицами HBsAg, могут перейти обратно в очищаемую биологическую среду (кровь, плазма).

Известны иммуномагнитные сорбенты для сепарации вирусов гепатитов В (биомагнитные сорбенты) на основе композитов высокодисперсного магнетита, модифицированного силика-γ-аминопропилсилоксаном, с последующей иммобилизацией модифицированного глутаровым альдегидом специфического иммуноглобулина Ig-ВГВ (Вергун Л.Ю., Климчук Д.А., Горбик П.П. и др. // Мiкробiол. журнал. 2009. Т.71. №5. С.65-71). Полученные сорбенты способны удалять инфекционный вирус гепатита В. Недостатком иммуносорбентов является недостаточная специфическая сорбция (остаются свободные участки для связывания полезных белков плазмы крови). Существенным недостатком также является получение сорбентов непосредственно перед вирусоудалением в день проведения испытаний, так как возможна потеря активности иммуносорбентов по отношению к вирусным частицам HBsAg при консервировании и хранении.

Планшеты и иммуносорбенты, способные сорбировать вирусные частицы HBsAg, полученные на основе неуглеродных материалов - полистиролов, магнетитов, обладают неспецифичностью и низкой адсорбционной способностью к токсичным биологическим молекулам высокой молекулярной массы, особенно по отношению к сложным по структуре соединениям, например к поверхностному антигену вирусного гепатита В.

Известен перфторполимерсодержащий углеродный гемосорбент, состоящий из углеродного пористого носителя и перфторполимерного покрытия, а также способ его получения (патенты РФ №№2118898, 2208441). Исходный углеродный гемосорбент имеет преимущественно микро-, мезопористую структуру. В качестве вещества для получения полимерного перфторуглеродного покрытия используют тетрафторэтилен с последующей полимеризацией и перфторолефин. Получаемый углеродный биосовместимый гемосорбент не повреждает форменных элементов крови, сохраняет микро-, мезопористую структуру и высокую удельную поверхность углеродного гемосорбента, не образует пылевых частиц, имеет хорошую гемодинамику и кинетику детоксикации. Недостатком данного углеродного сорбента является наличие полимерной пленки в виде равномерного сплошного покрытия по всей поверхности сорбента, резко снижающего доступ молекул токсичных соединений к адсорбирующей поверхности углеродного сорбента, и их возможный переход обратно в объем жидкой фазы (биологическая жидкость). Это приводит к низкой адсорбционной способности сорбента по отношению к молекулам токсинов.

Для повышения избирательности и увеличения активности углеродных гемосорбентов по отношению к токсичным биологическим молекулам высокой молекулярной массы и сложной структуры (на примере поверхностного антигена вируса гепатита В) необходимо наличие на их поверхности определенных «активных центров», способных к селективной сорбции - прочному связыванию таких вирусных частиц.

Известно, что в составе вирусной частицы гепатита В присутствует поверхностный антиген - HbsAg, который имеет в своей структуре рецептор, способный связываться с полиальбумином (M.W.Yu, J.S.Finlayson, J.W.-K.Shih // J.Virology. 1985. Vol.55. No.3. P.736-743; Ph.M.Harrison. J.Y.N.Lau, R.Williams // Postgrad. Med.J. 1991. Vol.67. P.719-741; Майер К.-П. Гепатит и последствия гепатита: Практич. рук.: Пер. с нем. - М.: ГЭОТАР-МЕД. 2004. 720 с.) Для достижения высокой специфичности взаимодействия с вирусными частицами HBsAg необходима иммобилизация полиальбумина, которую можно осуществить через аминогруппы на поверхности фторуглеродного сорбента.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ обработки углеродного мезопористого гемосорбента, включающий обработку пористого углеродного материала воздухом при контактировании с воздушно-водяной смесью в кипящем слое и обработку гемосорбента в стационарном слое 4-6% раствором азотной кислоты, подаваемым в зону реакции порциями через определенные интервалы времени, с последующей подачей воздуха с объемной скоростью 8 м³/ч для перемешивания сорбента. Обработку кислотой проводят в течение 7 часов, соотношение кислоты к сорбенту составляет 1:(29-32). Полученный сорбент сушат при температуре 200°С до остаточной влажности 0,2% (патент РФ №2362733, прототип).

Наиболее близким к предлагаемому гемосорбенту является углеродный мезопористый гемосорбент ВНИИТУ-1, который состоит из гранул размером 0,5-1,0 мм, характеризуется высокой химической чистотой (содержание углерода не менее 99,5%) и удельной адсорбционной поверхностью 300-400 м²/г (Суровикин В.Ф., Пьянова Л.Г., Лузянина Л.С. Новые гемо- и энтеросорбенты на основе нанодисперсных углерод-углеродных материалов // Российский химический журнал. 2007 - Т. LI. - №5 - Стр.159-165).

Данный углеродный гемосорбент обеспечивает высокую степень очистки крови от низко- и среднемолекулярных токсинов, но не сорбирует высокомолекулярные соединения. Данные свойства можно рассматривать как недостатки данного сорбента при использовании его для высокоселективной сорбции вирусных частиц гепатита В.

Целью изобретения является получение гемосорбента, позволяющего селективно сорбировать вирусные частицы гепатита В (поверхностный антиген гепатита В, ДНК вируса гепатита В).

Поставленная задача решается получением фторуглеродного гемосорбента с высоким содержанием фтора на поверхности, с последующим замещением фтора на аминогруппы и иммобилизацией полиальбумина (модифицированный глутаровым альдегидом человеческий сывороточный альбумин).

Предлагаемый способ получения фторуглеродного гемосорбента ВНИИТУ-1Ф включает обработку углеродного гемосорбента трифторидом брома в среде безводного фтористого водорода при массовом соотношении гемосорбент:трифторид брома:безводный фтористый водород 1:2-4:10 во фторопластовом реакторе, охлажденном до -15-25°С, герметизацию реактора, выдерживание смеси при комнатной температуре в течение 4-5 суток с последующим выделением сорбента на фторопластовой воронке, промывку несколькими порциями ацетона и сушку в токе азота, добавление к гемосорбенту смеси 1,3-диаминопропана и пиридина в соотношении 1:1 с последующим перемешиванием в течение 16-24 ч, центрифугирование и удаление прореагировавшей смеси двукратной отмывкой растворителем - диметилформамидом, а затем 0,15 М раствором хлорида натрия до отрицательной реакции 1% спиртового раствора нингидрина на аминогруппы, промывку в фосфатном буферном растворе pH 7,0-7,5, добавление приготовленного в ацетатном буферном растворе с pH 6,0-7,5 белка сывороточного альбумина с концентрацией 15-25 мг/мл, предварительно инкубированного со свежеприготовленным 25-% водным раствором глутарового альдегида в течение 2-4 часов при температуре 1-4°С и перемешивании, выдерживание сорбента с белком в течение 16-24 часов и отмывку сорбента физиологическим 0,15 М раствором хлорида натрия, высушивание полученного продукта на воздухе при комнатной температуре в течение 15-20 часов.

Предлагаемый фторуглеродный гемосорбент с иммобилизованным белком полиальбумином ВНИИТУ-1Ф представляет собой гранулы округлой формы размером 0,8-1,2 мм и характеризуется удельной адсорбционной поверхностью 190-230 м²/г, общим объемом пор не более 0,40 см³/г, мезопор не более 0,35 см³/г, содержанием фтора до 20 вес.%, кислорода до 11 вес.% и наличием на поверхности ковалентно связанного полиальбумина (использование для образования ковалентной связи глутарового альдегида - X.Д.Якубке, X.Ешкайт. Аминокислоты. Пептиды. Белки. - М.: Мир, 1985. 340 с.).

Высокое специфическое взаимодействие фторуглеродного гемосорбента с вирусными частицами гепатита В достигается за счет иммобилизации полиальбумина на поверхности фторуглеродного гемосорбента с аминогруппами. Иммобилизованный полиальбумин связывает вирусные частицы гепатита В по рецепторному механизму.

Образование связи C-F обусловлено обработкой углеродного гемосорбента в среде безводного фтористого водорода трифторидом брома. Иммобилизация полиальбумина происходит через аминогруппу мостика, ковалентно присоединенного к поверхности фторуглеродного сорбента, путем замещения фтора на -NH-(СН₂)₃-NH₂.

Проведенные исследования показали значимые различия исходного образца углеродного мезопористого гемосорбента (прототипа) с полученным образцом фторуглеродного гемосорбента: фазовый состав, морфология, текстурные характеристики, элементный состав, поверхностные функциональные группы.

Определение физико-химических характеристик образцов исходного и полученного углеродного гемосорбента проводилось стандартными методами, применяемыми при исследовании пористых материалов: основные текстурные характеристики - удельную адсорбционную поверхность, суммарный объем пор и распределение пор по размерам определяли по изотермам адсорбции-десорбции азота, полученным на приборе «Gemini 23 80» (США). Расчет величины адсорбционной удельной поверхности проводили по уравнению БЭТ. Рельеф и морфологию поверхности исследуемых образцов углеродного сорбента изучали методом растровой электронной микроскопии с использованием электронного микроскопа «JSM - 6460 LV» («JEOL», Япония). Рентгеновский микроанализ поверхности исследуемых образцов проводили на энергодисперсионном спектрометре EDAX («EDAX», Япония), оснащенном Si (Li) детектором с энергетическим разрешением 130 эВ. ИК спектры регистрировали на спектрометре NICOLET 5700 фирмы Thermo Fisher Scientific с разрешением 4 см^-1 и числом накопления спектров 32. Спектры представлены после обработки в программном пакете "ORIGIN" (коррекция базовой линии и сглаживания). Исследование фазового состава и структурных свойств исходного и фторированных образцов углеродного гемосорбента проводили с использованием комбинационного рассеяния света (КР) (Раман-Фурье спектрометр комбинационного рассеяния RFS-100/S фирмы Bruker). В качестве источника возбуждения использовалась линия 1064 нм Nd-YAG лазера мощностью 1500 мВт. Обработка спектров КР, их нормирование и разложение на компоненты проводили с использованием функции Лоренца в спектральном диапазоне 1000-1800 см^-1 в программном пакете "ORIGIN". Измерения методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии проводились на приборе ES-300 Kratos Analytical с применением Mg-анода (hν=1253.6 эВ).

Влияние модифицирования поверхности углеродного гемосорбента на адсорбционные свойства по отношению к вирусным частицам гепатита В исследовано в Центральной научно-исследовательской лаборатории Омской государственной медицинской академии на плазме крови больных гепатитом В (стендовые испытания). Определение сорбции ДНК вируса гепатита В в плазме крови проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Определение содержания поверхностного антигена вируса гепатита В проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

Обработка углеродного гемосорбента в среде безводного фтористого водорода трифторидом брома приводит к изменению фазового состава и морфологии углеродного гемосорбента. При фторировании увеличивается доля аморфной фазы за счет разрушения углеродных кристаллитов и образования дополнительных дефектов в кристаллической решетке. Данный процесс происходит в объеме образца, что подтверждается анализом спектров комбинационного рассеяния и электронно-микроскопическими снимками поверхности исходного и фторированного углеродных сорбентов.

Представленные на фиг.1 изотермы адсорбции-десорбции гемосорбента по прототипу (1), фторуглеродного гемосорбента (2) и фторуглеродного гемосорбента с полиальбумином (3), а также табличные данные показывают, что фторирование углеродного гемосорбента с последующим замещением фтора на аминогруппы и иммобилизация полиальбумина приводит к существенному изменению текстурных характеристик углеродного сорбента, происходит перераспределение пор по размеру, уменьшается удельная площадь поверхности, увеличивается размер гранул.

Представленные на фиг.2 ИК спектры углеродного гемосорбента по прототипу (1), фторуглеродного гемосорбента (2) и фторуглеродного гемосорбента с полиальбумином (3), а также данные рентгеновского микроанализа поверхности, приведенные в таблице, подтверждают изменение химического состава.

Результаты использования фторуглеродного гемосорбента с иммобилизованным полиальбумином для избирательной сорбции ДНК вируса гепатита В и поверхностного антигена вируса гепатита В HBsAg из плазмы крови больных представлены в таблице. В плазме крови здорового человека отсутствуют ДНК вируса гепатита В и поверхностный антиген гепатита В HBsAg. Содержание ДНК вируса гепатита В в плазме крови больного составляло до сорбции 40,3*10³ МЕ/мл; HBsAg 1,346 мМЕ/мл. Сорбционные свойства повышаются по сравнению с прототипом в отношении к вирусным частицам гепатита В: снижение концентрации количества копий ДНК вируса гепатита В для прототипа до 33,8*10³ копий/мл, поверхностного антигена вируса гепатита В HBsAg - 0,730 мМЕ/мл, для предлагаемого образца - до концентрации 4,55*10³ копий/мл, 0,424 мМЕ/мл соответственно.

Для иллюстрации изобретения приведены следующие примеры.

Пример 1 (по прототипу)

Навеску углеродного мезопористого гемосорбента 0,05 г заливают плазмой крови больного гепатитом В с содержанием копий ДНК вируса 40,3*10 копий/мл и поверхностного антигена вируса гепатита В 1,346 мМЕ/мл и перемешивают на шейкере в течение часа при комнатной температуре. Количество копий ДНК вируса гепатита В во фракции до и после контакта с гемосорбентом определяют методом полимеразной цепной реакции и далее расчетным путем. Количество копий ДНК вируса гепатита В в исследуемой фракции после контакта с гемосорбентом составило 33,8*10³ копий/мл, содержание поверхностного антигена вируса гепатита В - 0,730 мМЕ/мл.

Пример 2

В герметичный фторопластовый реактор, охлажденный до -20°С, последовательно добавляют 20 г безводного фтористого водорода, 2 г углеродного мезопористого гемосорбента и 6 г трифторида брома, реактор герметизируют и выдерживают реакционную смесь при комнатной температуре в течение 5 суток, после чего отделяют гемосорбент от жидкой фазы фильтрацией на фторопластовой воронке, промывают трижды ацетоном и сушат в токе азота. Полученный образец характеризуется удельной адсорбционной поверхностью 288 м²/г, общим объемом пор 0,40 см³/г, мезопор 0,316 см³/г, содержанием фтора до 39 вес.%, кислорода до 3 вес.%.

Пример 3

По примеру 2, но затем добавляют 1 мл смеси 1,3-диаминопропана и пиридина в соотношении 1:1, перемешивают в течение 24 ч, центрифугируют и удаляют прореагировавшую смесь, двукратно отмывают растворителем - диметилформамидом, а затем 0,15 М раствором хлорида натрия до отрицательной реакции 1% спиртового раствора нингидрина на аминогруппы и промывают в фосфатном буферном растворе с pH 7,4. Полученный образец характеризуется удельной адсорбционной поверхностью 181 м²/г, общим объемом пор 0,344 см³/г, мезопор 0,343 см³/г.

Модифицирование углеродного гемосорбента фтором, замещение фтора на аминогруппы являются промежуточными стадиями получения фторуглеродного гемосорбента с целью получения фторуглеродного гемосорбента с иммобилизованным полиальбумином. Поэтому стендовые медицинские испытания фторуглеродного гемосорбента (пример 2) и фторуглеродного гемосорбента с аминогруппами (пример 3) не проводились.

Пример 4

По примеру 3, но затем добавляют приготовленный в ацетатном буферном растворе (pH 7,0) 1 мл человеческого сывороточного альбумина с концентрацией 20 мг/мл, предварительно инкубированного со свежеприготовленным 25% водным раствором глутарового альдегида в течение 2 часов при температуре 4°С и перемешивании, выдерживают сорбент с белком в течение 24 часов и отмывают физиологическим 0,15 М раствором хлорида натрия, высушивают полученный продукт на воздухе при комнатной температуре в течение 15-20 часов.

Проводят адсорбцию вирусных частиц плазмы крови больного гепатитом В по примеру 1.

Количество копий ДНК вируса гепатита В в исследуемой фракции после контакта с гемосорбентом составило 4,55*10³ копий/мл, содержание поверхностного антигена вируса гепатита В - 0,424 мМе/мл.

Пример 5

Аналогичен примеру 4, но в реактор добавляют 4 г трифторида брома, а перемешивание со смесью 1,3-диаминопропана и пиридина проводят в течение 18 ч.

Количество копий ДНК вирусов гепатита В в исследуемой фракции после контакта с гемосорбентом составило 4,60*10 копий/мл, содержание поверхностного антигена вируса гепатита В - 0,432 мМЕ/мл.

Таким образом, сорбционная способность предлагаемого фторуглеродного гемосорбента с иммобилизованным полиальбумином ВНИИТУ-1Ф, через который пропущена плазма крови человека, больного гепатитом В, значительно превосходит адсорбционную способность исходного углеродного мезопористого гемосорбента (по прототипу).