СПОСОБ НОРМАЛИЗАЦИИ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИЩЕННОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ У ДЕТЕЙ 7-8 ЛЕТ СО СКОЛИОЗОМ

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к гематологии и педиатрии.

Аналогов способа нормализации антиоксидантной защищенности эритроцитов (эр.) у детей 7-8 лет со сколиозом не существует.

В литературе имеются отдельные рекомендации по коррекции сколиоза у детей с помощью лечебной физической культуры (ЛФК), массажа и плавания. Однако данные средства коррекции никогда ранее не применялись у них с целью нормализации антиоксидантной защищенности эритроцитов у детей 7-8 лет со сколиозом.

Целью изобретения является нормализация антиоксидантной защиты эритроцитов у детей 7-8 лет со сколиозом.

Способ заключатся в том, что с применением простых и доступных подходов возможна полная коррекция антиоксидантной защиты эритроцитов, что способствует улучшению микрореологических свойств эритроцитов у детей 7-8 лет со сколиозом (цитоархитектоники, деформируемости и агрегации), что оптимизирует их перемещение по капиллярам, и тем самым, достаточность притока O₂ в ткани, обеспечивая необходимый уровень метаболизма в организме детей.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Кровь берут из вены в количестве 20 мл через толстую иглу самотеком в пробирку. В качестве консерванта используют 5% раствор трилона-Б из расчета 1,0 мл консерванта на 9 мл цельной крови. Затем кровь с консервантом осторожно и тщательно перемешивают и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочный слой, который содержит основную массу тромбоцитов и лейкоцитов, отсасывают и удаляют в отдельную пробирку, а оставшиеся эритроциты ресуспендируют 5,0 мл физиологического раствора и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. Недосадочную жидкость после центрифугирования удаляют, а к осадку эритроцитов добавляют 6 мл 0,85% раствора натрия хлорида, приготовленного на 2,7% растворе трилона Б. Осадок эритроцитов осторожно перемешивают и центрифугируют при 2200 об/мин в течение 10 мин. Затем супернатант удаляют, а к осадку вновь добавляют физиологический раствор на трилоне Б в тех же количествах. Эту процедуру повторяют трижды при комнатной температуре. В каждом конкретном случае количество эритроцитов подсчитывается в камере Горяинова.

Последующая оценка активности каталазы и СОД осуществляется следующим способом.

Определение каталазы в крови. Принцип метода состоит в том, что каталаза разрушает субстрат Н₂O₂, а оставшуюся неразрушенной часть перекиси водорода измеряют с помощью молибдата натрия. Как известно, для молибдена характерно образование при взаимодействии с перекисью водорода перекисных соединений состава Na₂MoO₆, которые имеют желтую окраску. Интенсивность окраски образующихся перекисных соединений молибдена зависит от количества перекиси водорода в растворе, т.е. от активности каталазы в пробе.

Реагенты

(1) 0,3% водный раствор перекиси водорода (1 мл концентрированного раствора перекиси водорода доводят дистиллированной водой до 100 мл).

(2) 4% водный раствор молибдата натрия. В таблице 1 приведено описание методики.

Раствор молибдата добавляют к каждой пробе по отдельности и сразу же после перемешивания реакционной смеси измеряют экстинкцию при 410 нм против дистиллированной воды. Экстинкция холостой пробы около 0,350. Чем больше в пробе каталазы, тем меньше перекиси водорода остается неразрушенной и тем меньше образуется перекисей молибдата. Результат оценивают по степени разрушения перекиси водорода каталазой или степени блокирования образования конечных продуктов перекисей молибдата и выражают в процентах. Расчет проводят по формуле:

,

где Е_х.пр и Е_исс.пр - экстинкция соответственно холостой и исследуемой проб. С помощью калибровочной кривой, построенной для стандартных растворов каталазы (фигура 1), оценивают активность каталазы в пробе на основании рассчитанного процента разрушения перекиси водорода (по оси абсцисс на фиг.1 отложена активность каталазы в МЕ/10¹² эр., по оси ординат - блокирование реакции в %). Активность каталазы относят к концентрации эритроцитов (в МЕ/10¹² эр.) в исследуемой взвеси эритроцитов.

Определение СОД. Принцип определения основан на восстановлении нитротетразолия супероксидными радикалами, которые образуются при реакции между феназинметасульфатом и восстановленной формой никотинамиддинуклеотида (NAD·H). Образование нитроформазана, продукта восстановления нитротетразолия, блокируется наличием в пробе СОД. Так, на основании количества нитроформазана можно оценить активность СОД.

Реагенты

(1) 0,15 М фосфатный буфер (рН 7,8) (4,48 г Na₂HPO₄, 0,25 г КН₂РO₄ растворяют в 500 мл дистиллированной воды).

(2) Инкубационная смесь 37 мг ЭДТА-Nа₂, 330 мг нитротетразолия голубого, 55 мг феназинметасульфата смешивают с 300 мл фосфатного буфера, оставляют стоять на ночь. Утром фильтруют.

(3) Раствор NAD·H (152 мг NAD·H растворяют в 10 мл трис-ЭДТА-буфера).

(4) Трис-ЭДТА-буфер, рН 8,0 (37 мг ЭДТА-Na, 24 мг трис растворяют в 100 мл дистиллированной воды).

Схема определения СОД в суспензии отмытых эритроцитов представлена в таблице 2.

Смешивание растворов производят при комнатной температуре, после чего измеряют экстинкцию холостой и исследуемой проб при 540 нм на спектрофотометре. Экстинкция холостой пробы составляет около 0,680. Расчет производят по формуле:

= процент блокирования образования нитроформазана.

Активность СОД определяют с помощью калибровочной кривой (фиг.2). По оси абсцисс схемы отложены активность СОД в ME/10⁹ тр., по оси ординат - блокирование восстановления нитротетразолия в %. Активность СОД в крови выражают в ME/10¹² эр.

Таким образом, с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов, в эритроцитах детей 7-8 лет со сколиозом возможно определение антиоксидантной активности эритроцитов. В случае понижения активности в них каталазы ниже 8900,0 ME/10¹² эр. и/или СОД ниже 1560,0 МЕ/10¹² эр. необходимо назначение на 6 мес заявленного лечебного комплекса, состоящего из ЛФК, массажа и плавания.

Первым компонентом заявленного способа является ежедневная лечебная физическая культура, состоящая из нескольких частей: разминки, упражнений лежа на спине, лежа на животе и стоя. Отдых между упражнениями производится в исходном положении (т.е. если упражнение проводилось лежа на спине, то и отдых происходит в этом же положении без вставания и сидения).

1. Разминка - ходьба по кругу 3-4 минуты. Ребенок ложится на спину.

2. "Вытяжение" позвоночника. Ребенок лежит на спине и пятками тянется "вниз", макушкой - "вверх". Выполняется 5-6 "вытяжений" по 15-20 секунд.

3. Плавание. Исходное положение лежа на спине, ноги прямые, голова затылком соприкасается с плоскостью, на которой лежит тело. Ребенок выполняет движения, имитирующие плавание на спине: руки отведены в бок и совершают движения, имитирующие греблю амплитудой около 90°, ноги выпрямлены и совершают легкие толчкообразные движения. Выполняется 2-3 подхода по 30 секунд с кратковременным отдыхом между ними (5-10 секунд).

4. Велосипед. Лежа на спине, руки за головой или вдоль туловища, ребенок совершает ногами движения, имитирующие езду на велосипеде. Большая часть амплитуды движений ног должна быть на уровне тела, не болтая ногами над животом и стремясь, чтобы выпрямляемая нога поочередно проходила близко к полу. Темп выполнения - средний. Выполняется 2-3 подхода по 30-40 секунд с перерывами на отдых по 5-10 секунд.

5. Ножницы. Лежа на спине, руки за головой или вдоль туловища, ребенок выполняет окрестные горизонтальные и вертикальные махи ногами. При этом горизонтальные махи необходимо производить ближе к полу. Темп выполнения - средний. Выполняется 2-3 подхода по 30-40 секунд.

Ребенок переворачивается на живот.

6. "Вытяжение" позвоночника. Лежа на животе, носочками ребенок тянется "вниз", макушкой - "вверх". Выполняется 5-6 "вытяжений" по 15-20 секунд с перерывами на отдых 5-10 секунд.

7. Плавание. Исходное положение лежа на животе, ноги прямые, голова опирается на тыльную часть ладоней. Ребенок прогибается в пояснице (голова, верхняя часть туловища, руки и ноги подняты, точка опоры - живот). Удерживая такое положение, выполняются движения, имитирующие плавание: руки вперед, ноги развести в стороны, затем руки в стороны, ноги соединить, затем руки к плечам, ноги по-прежнему вместе. Выполняются 2-3 подхода по 10-15 повторений с отдыхом между подходами 5-10 секунд.

8. Ножницы. Лежа на животе, ноги прямые, голова опирается на тыльную часть ладоней. Ребенок поднимает ноги и выполняет скрестные горизонтальные и вертикальные махи ногами. В ходе выполнения этого упражнения бедра нужно отрывать от пола. Темп выполнения - средний. Выполняется 2-3 подхода по 15-20 секунд с отдыхом между ними по 5-10 секунд.

9. "Вытяжение" позвоночника. Лежа на животе, носочками ребенок тянется "вниз", макушкой - "вверх". Выполняется 3-4 "вытяжения" по 15 секунд с отдыхом между ними по 5-10 секунд.

10. Удержание. Лежа на животе, ноги прямые, голова опирается на тыльную часть ладоней. Ребенок поднимает ноги и верхнюю часть туловища, прогибаясь в пояснице (голова, верхняя часть туловища, руки и ноги подняты, точка опоры - живот). Ноги вместе, руки в стороны, ладони вывернуты вверх. Статически ребенок замирает в этом положении на 10-15 секунд. При этом желательно не задерживать дыхание и при выполнении этого упражнения бедра желательно отрывать от пола. Выполняется 3-4 повторения с отдыхом между повторениями по 5-10 секунд.

Ребенок встает.

11. Вращение руками. Стоя перед зеркалом для контроля осанки, локти отводятся в сторону, пальцы рук - к плечам. Выполняется вращение рук назад (по часовой стрелке) с большой амплитудой движения - локти должны совершать при вращении наибольшую окружность. Темп выполнения - медленный. Выполняется 2-3 подхода по 20-30 секунд с отдыхом между ними по 5-10 секунд.

12. Приседания. Стоя перед зеркалом для контроля осанки, руки разведены в сторону, ладони повернуты вверх. В таком положении, ребенок, сохраняя правильную осанку, встает на носочки, потом приседает, снова встает на носочки и возвращается в исходное положение. Темп выполнения упражнения - медленный. Выполняется 5-10 таких приседаний с отдыхом между ними по 5-10 секунд.

13. Наклоны из вертикального положения в стороны по 6-7 раз вправо и влево. Руки на поясе.

14. Глубокие вдохи с поднятием рук вверх и глубокие выдохи с резким их опусканием - 1-2 минуты.

Вторым компонентом заявленного способа является проведение четырех курсов массажа. Длительность одного сеанса массажа - 30мин, один курс массажа состоит из 25 сеансов. В течение полугода коррекции курсы массажа проводят четыре раза - первый сразу же в начале коррекции, а затем еще 3 курса массажа с интервалом 25-26 дней.

Ребенок со сколиозом лежит на животе, массажист стоит со стороны грудного сколиоза. Вначале проводится общее поглаживание всей поверхности спины (плоскостное, обхватывающее, граблеобразное, глажение), затем осуществляется седативное, расслабляющее воздействие на верхнюю часть трапециевидной мышцы (поглаживание, растирание, вибрация лабильная непрерывистая), делается растирание, разминание, вибрация на возвышении в области грудного сколиоза (гребнеобразное растирание, поколачивание, рубление, разминание щипцеобразное по длинным мышцам спины). После этого массируется область поясничной вогнутости (применяются приемы на расслабление, растягивание, воздействующие седативно - поглаживание, растирание, вибрация только лабильная, непрерывная).

Ребенок поворачивается на левый бок. В этом положении используют приемы оттягивания за правый подвздошный гребень.

Ребенок поворачивается на правый бок. В этом положении производят оттягивание за левый подвздошный гребень.

Ребенок поворачивается вновь на живот. Продолжается массаж области сколиоза в поясничном отделе, в области выпуклости (приемы стимуляции, тонизирования - разминание и вибрация прерывистая для укрепления мышц). Затем осуществляется расслабление и растягивание подлопаточной области, массируя межреберья (граблеобразное поглаживание, растирание, вибрация лабильная) с оттягиванием углов лопаток от вогнутости позвоночника, массируются, стимулируя и тонизируя надплечья, мышцы над лопатками, верхними частями трапециевидных мышц (растирание, разминание, вибрация прерывистая, ударные приемы).

Ребенок переворачивается на спину. В этом положении проводится массаж передней поверхности грудной клетки. В подключичной и надключичной областях, а также в области грудных мышц с целью стимуляции, укрепления мышечного корсета, проводят растирание, разминание, вибрацию прерывистую и ударные приемы. На передней брюшной стенке выполняются приемы стимулирования, тонизирования (растирание гребнеобразное, разминание, вибрация прерывистая, ударная).

Третьим компонентом заявленного способа является ежедневное плавание ребенка в море, реке или бассейне по 2 раза в день утром и вечером по 30 минут.

Пример 1. Группа здоровых детей 7-8 лет (n=42) обследована во время диспансерного осмотра в плановом порядке. У детей бралась кровь в пластиковые пробирки с последующим исследованием антиоксидантной защиты эритроцитов. Полученные результаты (каталаза 10200,0±24,16 МЕ/10¹²эр., СОД 1736,0±4,28 МЕ/10¹²эр.) указывали на ее нормальное состояние.

Спустя 8 мес вся группа в плановом порядке была повторно обследована на предмет активности антиоксидантных ферментов эритроцитов (каталаза 10250,0±18,67 МЕ/10¹²эр., СОД 1696,0±5,20 МЕ/10¹²эр.), которая оставалась по-прежнему нормальной.

Пример 2. Группа детей 7-8 лет со сколиозом I-II степени (n=24) обследована во время планового диспансерного осмотра. У детей была взята кровь в пластиковые пробирки с последующим исследованием антиоксидантной защищенности эритроцитов. Результаты оценки (каталаза 8690,0±14,07 МЕ/10¹²эр, СОД 1468,0±6,72 МЕ/10¹²эр.) свидетельствовали об их понижении.

Для коррекции сколиоза всем детям данной группы в поликлинике по месту жительства проводили в течение 8 мес стандартные 5 раз в неделю занятия ЛФК, плавание в бассейне 3 раза в неделю и пять стандартных курсов массажа, применяемых при сколиозе по 10 сеансов длительностью 20 минут. Через 8 мес коррекции на фоне выраженной позитивной динамики сколиоза у детей отмечено усиление, но не нормализация каталазы (8750,0±12,08 МЕ/10¹²эр.) и СОД (1490,0±2,11 МЕ/10¹²эр.).

Пример 3. Группа детей 7-8 лет со сколиозом I-II степени (п=28) обследована в детской поликлинике по месту жительства во время планового диспансерного осмотра по поводу сколиоза. У детей была взята кровь в пластиковые пробирки с последующим исследованием активности антиоксидантных ферментов эритроцитов, показавшей их ослабление у них (каталаза 8682,0±11,96 МЕ/10¹²эр. и СОД 1400,0±3,67 МЕ/10¹²эр.).

Детям была рекомендована стандартно применяемая при сколиозе ежедневная ЛФК, шесть стандартных десятидневных курсов массажа по 20-30 мин с посещением бассейна в ближайшем спорткомплексе 6 раз в неделю в течение 8 месяцев.

Спустя 8 мес коррекции признаки сколиоза у детей 7-8 лет были сведены к минимуму. При этом показатели активности антиоксидантных ферментов эритроцитов у наблюдаемых детей (каталаза 8768,3±16,33 МЕ/10¹² эр. и СОД 1488,3±5,07 МЕ/10¹²эр.) так и не достигли уровня таковых у их здоровых сверстников.

Пример 4. Группа детей 7-8 лет со сколиозом I-II степени обследована во время диспансерного осмотра по поводу сколиоза. У детей была взята кровь в пластиковые пробирки и оценена у каждого активность антиоксидантных ферментов эритроцитов, оказавшаяся пониженной (каталаза 8647,0±10,36 МЕ/10¹²эр. и СОД 1451,0±3,80 МЕ/10¹²эр.).

Детям были рекомендованы на 8 мес стандартная ЛФК ежедневно, семь дней в неделю по 2 раза в день плавание в бассейне поликлиники по 30 минут и шесть стандартных курсов массажа со стандартными приемами по 15 сеансов, длительность сеанса 30 минут.

Спустя 8 мес коррекции признаки сколиоза у детей были полностью устранены, однако показатели антиоксидантной защиты их эритроцитов (каталаза 8793,1±14,57 МЕ/10¹²эр. и СОД 1491,3±5,67 МЕ/10¹²эр.) оставались ниже значений, характерных для здоровых детей 7-8 лет.

Пример 5. Группа детей 7-8 лет со сколиозом I-II степени (n=45) обследована в поликлинике по месту жительства во время диспансерного осмотра по поводу сколиоза. У детей была взята кровь в пластиковые пробирки с исследованием активности антиоксидантных ферментов (каталаза 8654,7±18,24 МЕ/10¹²эр. и СОД 1453,4±3,45 МЕ/10¹² эр.), оказавшейся пониженной.

Детям было рекомендовано сочетание ЛФК, плавания и массажа согласно заявленного способа.

Уже через 6 мес коррекции согласно заявленному способу, признаки сколиоза были полностью устранены, а учитываемые показатели антиоксидантной защиты эритроцитов у всех детей данной группы нормализовались (каталаза 9920,0±14,21 МЕ/10¹²эр. и СОД 1600,5±6,30 МЕ/10¹² эр.).

Контроль активности каталазы и СОД у детей данной группы еще через 6 мес даже при прекращении применения у них всех элементов заявленного способа показал сохранение их нормальной активности.

Применение данного способа коррекции антиоксидантной защищенности эритроцитов у детей 7-8 лет со сколиозом поможет избежать у них микрореологических нарушений, обеспечит нормальный приток крови к их растущим тканям и оптимальные условия для анаболических процессов в организме детей.