Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КОЖИ ПО МОРФОМЕТРИЧЕСКОМУ ПРОФИЛЮ БАЗАЛЬНЫХ КЕРАТИНОЦИТОВ

Изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии, и может быть использовано для гистологического способа дифференциальной диагностики лимфопролиферативных заболеваний кожи, которые относятся к гетерогенной группе дерматозов, обусловленной возможностью развития в коже разнообразных доброкачественных лимфоидных гиперплазий (псевдолимфом), симулирующих злокачественные неопластические процессы (лимфомы).

Известен способ диагностики Т-клеточных лимфом кожи, заключающий в проведении цитологического анализа взятого у больного мазка крови, который фиксируют, проводят рибонуклеазную обработку, окрашивают галлоцианин-хромовыми квасцами, микроденситометрируют интерфазный хроматин лимфоцитов, на основании полученных параметров (OD4 - оптическая плотность эухроматина; FORM_P - форм-фактор ядра; IOD2 - интегральная оптическая плотность гетерохроматина; AREA - площадь ядра) рассчитывают показатель: DF=-0,14379*OD4+0,00003*IOD2+10,4952*FORM_P+0,0001*AREA-11,1241 и при отрицательном значении этого показателя диагностируют Т-клеточную лимфому кожи [патент RU 2104526, 1998 г.]. Данный способ позволяет выявлять злокачественные формы лимфоцитов в крови, устанавливать диагноз до развития выраженных клинических проявлений, позволяет проводить дифференциальную диагностику эритродермических состояний при Т-клеточных лимфомах кожи и доброкачественных воспалительных дерматозах, но не учитывает морфологических изменений, проходящих в коже при этих заболеваниях, не позволяет отдифференцировать лимфомы кожи от псевдолимфомы.

Известен способ клинико-лабораторной диагностики лимфопролиферативных заболеваний кожи, основанный на иммунофенотипировании клеток инфильтрата [Клинико-лабораторная диагностика лимфом кожи. Медицинская технология №ФС-2006/299-У от 26 октября 2006 года. ФГУ «Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунологии» г.Екатеринбург // «Вестник дерматологии и венерологии». - 2009. №4. С.27-34]. Авторы предлагают на первом этапе обследования провести изучение анамнеза, особенностей течения процесса, клинических проявлений, клинический мониторинг, общеклинические методы исследования. Результатом первого этапа обследования является предварительный диагноз доброкачественного дерматоза, первично злокачественной лимфомы кожи лимфопролиферативных заболеваний кожи. На втором этапе авторами проводится патоморфологическое исследование биоптата кожи, лимфоузла, костного мозга в светооптическом микроскопе, иммунофенотипирование клеток инфильтрата с использованием моноклональных антител (МКА): CD 45(LCA), CD45RO, CD45RA, CD3, CD8, CD20, CD30(ki1), ki 67 (фирмы Becton Dickinson), после чего устанавливается окончательный нозологический диагноз злокачественной лимфомы кожи. Однако, учитывая высокие стоимостные характеристики метода, необходимость использования специального оборудования, способ не всегда приемлем в практическом здравоохранении и может быть осуществлен только в специализированных региональных научных центрах 5-го квалификационного уровня. К тому же, клетки лимфоидного инфильтрата проходят дифференцировку в эпидермисе, меняя свой фенотип [Burg G., Zwingers Т., Staegemeiz Е. et al. Intrarater variabilities in the evolution of cutaneous lymphoma project group // Derm. Clin. - 1994. - Vol.12 - p.311-314]. Burg G. показал, что в пораженной коже больных псевдолимфомами, при доброкачественных хронических дерматозах, таких как мелко- и крупнобляшечный парапсориаз, возможна клональная перестройка лимфоцитов со сменой фенотипа [Burg G. Atlas of cancer of the skin. - New York. - 2006. - 368 c.].

В описанных способах иммунофенотипирование клеток инфильтрата позволяет оценить природу клеток Т и В линий, позволяет диагностировать лимфомы кожи на поздних стадиях заболевания, но не решает проблем ранней дифференциальной диагностики начальных проявлений лимфом от псевдолимфом кожи и дерматозов воспалительной природы. Наши контраргументы согласуются с данными других авторов [Молочков В.А., Лезвинская Е.М., Молочков А.В. Псевдолимфомы-прелимфомы-лимфомы кожи // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2004. №5. С.4-7].

Прототипом изобретения является способ гистологической диагностики лимфом кожи путем микроскопического исследования биоптатов пораженной кожи [Родионов А.Н., Барбинов В.В., Казаков Д.В. Гистологическая диагностика лимфом кожи. - Санкт-Петербург. - 1997. 283 с.]. Авторы проводят гистологическую диагностику лимфом кожи на светооптическом уровне, основываясь на следующих основных морфологических критериях: 1) изменение структуры эпидермиса - наличие акантоза с широкими, местами сливающимися эпидермальными отростками; вакуольной дистрофии базальных кератиноцитов; увеличение фигур патологических митозов в эпидермисе; 2) наличие в дерме полиморфноклеточного пролиферата, включающего атипичные лимфоциты; наличие диффузного или очагового (абсцессы Потрие) проникновения лимфоцитов в эпидермис.

Однако гистологическая картина может быть весьма вариабельной в зависимости от клинических проявлений и стадии заболевании, при этом диагностическое значение приведенных выше критериев не одинаково, не всегда является достоверным [Молочков В. А., Ковригина A.M., Овсянникова Г.В. Т-клеточные лимфомы кожи: современные подходы к клинико-морфологической диагностике согласно классификации WHO/EORTC 2006 // Российский журнал кож.-вен. болезней. - 2009. №2. С.4-15]. Ряд патологических изменений, таких как интенсивность воспалительных реакций, атрофии и гипертрофии, реактивные состояния, явления дисплазии и определение пограничных состояний, степени снижения дифференцировки опухоли и многие другие проблемы детализации гистологического диагноза решаются по-разному с учетом опыта, знаний, квалификации специалиста с одной стороны, неисчерпаемым разнообразием опухолевых структур и определенными границами морфологического метода с другой [Скрек С.В., Родионов А.Н., Разнатовский К.И. Современная классификация лимфом кожи. Характеристики иммунного статуса лимфоидных клеток у больных с различными видами лимфом кожи // Клиническая дерматология и венерология. - 2008. №2. с.82-88]. Прототип изобретения учитывает морфологические изменения, проходящие в коже при лимфопролиферативных заболеваниях кожи визуально, но не включает иммунофенотипирования клеток инфильтрата, не позволяет объективизировать и дифференцировать наблюдаемые в коже изменения при лимфопролиферативных заболеваниях кожи, и не позволяет провести дифференциальную морфологическую диагностику лимфом от псевдолимфом.

Задачей изобретения является объективизация и дифференцировка наблюдаемых в коже изменений при лимфопролиферативных заболеваниях кожи, дифференциальная морфологическая диагностика лимфом от псевдолимфом кожи для определения тактики адекватного лечения.

Технический результат - повышение точности диагностики лимфопролиферативных заболеваний кожи за счет дифференциальной диагностики лимфом и псевдолимфом кожи.

Предлагаемый способ дифференциальной диагностики лимфопролиферативных заболеваний кожи осуществляется следующим образом. Проводят гистологическое исследование биоптатов пораженной кожи, иммунофенотипирование клеток инфильтрата [Цветкова Г.М., Мордовцев В.В. Патоморфологическая диагностика заболеваний кожи. - Москва, Изд-во Медицина. - 1996. - 263 с.]; Кунгуров Н.В., Кохан М.М., Сазонов С.В. и др. Алгоритмы клинико-лабораторной диагностики злокачественных лимфом кожи // Клиническая дерматология и венерология. - 2002. №6. с.16-19]. Для проведения световой микроскопии биоптаты кожи фиксируют в 10% растворе нейтрального формалина (рН-7,3). После обезвоживания в спиртах восходящей концентрации заливают в парафиновые блоки, срезы толщиной 4 мкм, полученные с блоков, окрашивают гематоксилином и эозином, просматривают в световом микроскопе, описывают морфологические изменения. Для иммуногистохимического исследования повторные срезы с парафиновых блоков предварительно обрабатывают в водяной бане [Izban K.F., Hsi E.D., Ackan S. Immunohistochemical analysis of mycosis fungoides on paraffin - embedded tissue sections. // Mod. Pathol. - 2008. - V.11. p.978-982]. В работе использовали панель антител CD1a фирмы «Novocastra», панель моноклональных антител CD2⁺, CD3⁺, CD4⁺, CD5⁺, CD45RO⁺, CD68⁺, p69⁺ набора «Fast immune», фирмы «Becton Dickinson», США. Результаты иммуногистохимических реакций визуализируют с помощью системы "Enviston (Dako)". Полученные результаты интерпретируют согласно классификации ВОЗ/EORTC [Молочков В.А., Ковригина A.M., Овсянникова Г.В. Т-клеточные лимфомы кожи: современные подходы к клинико-морфологической диагностике (согласно классификации ВОЗ/EORTC) и лечению // Росс. журн. кож.-вен. болезней. - 2009. - №3. - С.4-9; Белоусова, И.Э., Казаков Д.В., Криволапов Ю.А. Современные подходы к диагностике и лечению первичных лимфом кожи на основе новой ВОЗ-EORTC классификации В-клеточных лимфом кожи. // Архив патологии. - 2007. - №6 - С.48-50]. Микрофотографирование проводят с помощью камеры «Leica DFS 420» и обрабатывают с помощью пакета компьютерного анализа изображения Leica Qwin standart v3.1.0. Статистическую обработку данных проводят с помощью Statistica 7.0 с применением методов непараметрической статистики. При схожей гистологической картине, описываемой при лимфомах и псевдолимфомах как выраженный акантоз, гиперкератоз, в дерме расширение сосудов, периваскулярные лимфо-гистиоцитарные инфильтраты с проникновением лимфоцитов в эпидермис, одинаковом иммунофенотипе клеток инфильтрата CD3⁺, CD4⁺, CD43⁺, CD45RO⁺ при лимфомах и псевдолимфомах, дополнительно проводят морфометрическое исследование базальных кератиноцитов в гистологических препаратах биоптатов пораженной кожи с помощью компьютера, совмещенного со световым микроскопом «Leica» фирмы «Leitz Biomed» (Германия) с помощью окуляр-микрометра и окулярной сетки (на 100 точек пересечения) [Автандилов Г.Г. Компьютерная морфометрия. - Москва. Изд-во Медицина. - 1999. 320 с.].

Измеряют площадь и ядерно-цитоплазматическое соотношение базальных кератиноцитов, и при увеличении площади базальных кератиноцитов в 1,5 и более раза по сравнению с нормальной кожей, ядерно-цитоплазматического соотношения базальных кератиноцитов в 2 и более раза по сравнению с нормальной кожей диагностируют лимфомы кожи, а при неизмененных морфометрических показателях базальных кератиноцитов - псевдолимфомы кожи (таблица).

Изобретение иллюстрируется следующими чертежами: на фиг.1 представлено фото больной Д. по примеру 1; на фиг.2 - гистограмма больной Д. по примеру №1; на фиг.3 - фрагмент гистограммы больной Д. по примеру 1; на фиг.4 - фото больной У. по примеру №2; на фиг.5 - гистограмма больной У. по примеру №2; на фиг.6 - фрагмент гистограммы больной У. по примеру №2.

Авторами в доступной научно-медицинской и патентной литературе не было обнаружено сведений об использовании морфометрических исследований с измерением площади и ядерно-цитоплазматического соотношения базальных кератиноцитов для дифференциальной диагностики лимфом от псевдолимфом кожи. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию патентоспособности «новизна».

Исследованиями авторов была впервые доказана возможность дифференциальной диагностики лимфом от псевдолимфом кожи путем морфометрических исследований с измерением площади и ядерно-цитоплазматического соотношения базальных кератиноцитов. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Предлагаемый способ дифференциальной диагностики поясняется следующими примерами.

Пример №1. Больная Д., 56 лет, работница химического нефтеперерабатывающего комплекса, поступила в клинику Республиканского кожно-венерологического диспансера (РКВД) на стационарное лечение с жалобами на высыпания по всему кожному покрову, нестерпимый зуд. Считала себя больной в течение года, неоднократно обращалась в КВД по месту жительства, где назначалась десенсибилизирующая, симптоматическая терапия, не приводящая к клиническому улучшению. Для уточнения диагноза направлена в РКВД с направительными диагнозами: лимфома кожи? псевдолимфома кожи? При поступлении кожно-патологический процесс носил распространенный характер, в виде пятен розово-красной окраски, различных размеров и форм, более с шероховатой, чем шелушащейся поверхностью (фиг.1). Периферические лимфоузлы были увеличены до величины фасоли. Гистологически в биоптатах пораженной кожи отмечался выраженный акантоз с широкими, сливающимися эпидермальными отростками, гиперкератоз, роговые инвагинации. В дерме имелись расширенные сосуды лимфо-гистоцитарные периваскулярные инфильтраты с проникновением лимфоцитов в эпидермис (фиг.2). При иммунофенотипическом исследовании с помощью панели моноклональных антител установлен иммунофенотип клеток инфильтрата: CD3⁺, CD4⁺, CD43⁺, CD45RO⁺, что не позволило установить окончательный диагноз. Для уточнения диагноза и дифференциальной диагностики лимфомы от псевдолимфомы кожи проведено морфометрическое исследование базальных кератиноцитов (фиг.3).

Площадь базальных кератиноцитов у данной больной составила 60,15 мкм², ядерно-цитоплазматическое соотношение 0,49, что превышало аналогичные показатели в здоровой коже (норме) в 1,5 и 2,2 раза соответственно. На основании комплексного клинико-лабораторного иммунофенотипического, гистологического и морфометрического исследования у данной пациентки установлен диагноз лимфома кожи (грибовидный микоз I стадия). После получения 2-х курсов спецефической проспидинотерапии элементы регрессировали. Рецидив заболевания в течение года не наблюдался.

Пример №2. Больная У., 67 лет, пенсионерка, поступила в клинику РКВД с предположительными диагнозами лимфома кожи? псевдолимфома кожи? При поступлении предъявляла жалобы на сильный постоянный зуд, озноб, повышение температуры тела до 38,5°С, покраснение всего кожного покрова, его отслойку. Считала себя больной в течение месяца, когда после лечения в санатории «Якты-Куль», где получала по поводу радикулита минеральные ванны и грязелечение, после 8 процедуры появилось покраснение кожи туловища. Объективно при поступлении: процесс универсального характера, по типу эритродермии (фиг.4). Кожные покровы ярко-красного цвета с ливидным оттенком, инфильтрированы, лихенифицированны в области кожных складок, обильно покрыты крупнопластинчатыми чешуйками. Шелушение особенно выражено на нижних конечностях, где имелись многочисленные экскориации и корочки. На ладонях и подошвах отмечался гиперкератоз. Подчелюстные, шейные, подмышечные, паховые лимфоузлы были увеличены до 3 см в диаметре, плотноэластической консистенции при пальпации, подвижные, безболезненные. При гистологическом исследовании обнаружено: в эпидермисе выраженный акантоз, паракератоз и гиперкератоз. В дерме сосуды расширены. Периваскулярно наблюдалась лимфоцитарная инфильтрация с проникновением лимфоцитов в эпидермис (фиг.5). Иммунофенотип клеток инфильтрата CD3⁺, CD4⁺, CD43⁺, CD45RO⁺. Морфометрические исследования базальных кератиноцитов (фиг.6) отклонений параметров от нормы не выявили: площадь базальных клеток составила 42,5; ядерно-цитоплазматическое соотношение 0,23. С учетом анамнестических данных, клинико-гистологической картины, морфометрических исследований был установлен диагноз синдром псевдолимфомы. Больной была проведена детоксикационная терапия, включающая курс плазмофереза в сочетании с энтеросорбентами и антигистаминными препаратами. Гиперемия и инфильтрация стали менее выраженными, шелушение отсутствовало, появились участки здоровой кожи, лимфатические узлы уменьшились, температура нормализовалась. Добиться клинического излечения удалось после 2-кратной инъекции дипроспана.

Как видно из приведенных примеров, диагностика лимфопролиферативных заболеваний кожи сложна, необходимы клинико-лабораторные методы исследования. Проведение гистологических исследований, иммунофенотипирование клеток дермального инфильтрата показало схожую гистологическую картину, описываемую как выраженный акантоз, гиперкератоз, расширенные сосуды, периваскулярная лимфогистиоцитарная инфильтрация с проникновением лимфоцитов в эпидермис, и схожий фенотип CD3⁺, CD4⁺, CD43⁺, CD45RO⁺, как при лимфомах, так и при псевдолимфомах кожи. Применение морфометрических исследований базальных кератиноцитов позволило отдифференцировать лимфому кожи от псевдолимфомы, что позволило, в свою очередь, назначить адекватное лечение, приведшее к регрессу заболевания. Следовательно, диагностика

лимфопролиферативных заболеваний кожи должна осуществляться с использованием всего спектра диагностических методов: клинических, гистологических, иммунофенотипических и морфометрических.

Таким образом, по сравнению с прототипом, предлагаемый способ дифференциальной диагностики лимфопролиферативных заболеваний кожи по морфометрическому профилю базальных кератиноцитов позволяет:

а) использовать весь спектр диагностических методов лимфопролиферативных заболеваний кожи, существующих на данный момент, включающий клинические и гистологические методы исследования, иммунофенотипирование клеток инфильтрата;

б) объективизировать и дифференцировать наблюдаемые в коже изменения при лимфопролиферативных заболеваниях кожи путем морфометрических исследований базальных кератиноцитов;

в) провести дифференциальную диагностику лимфом от псевдолимфом кожи путем измерения площади и ядерно-цитоплазматического соотношения базалиоцитов.

Предлагаемым способом была проведена дифференциальная диагностика у 37 больных с лимфомами кожи и 24 с псевдолимфомами, и во всех случаях был достигнут указанный технический результат. Способ воспроизводим в условиях гистологической лаборатории стационара. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию патентоспособности «промышленная применимость».