Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЦЕНКИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА НЕЙТРОФИЛОВ У РАБОТНИКОВ НЕФТЕХИМИЧЕСКОГО И ХИМИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к медицине труда, и может быть использовано для оценки состояния метаболизма в клетках у работников нефтехимических и химических производств.

Нефтехимическая и химическая отрасли занимают одно из ведущих мест по потенциальной опасности химического воздействия, более 100 тысяч наименований химических веществ присутствует в воздухе рабочей зоны предприятий [Карамова Л.М. Профессиональный риск для здоровья работников химических и нефтехимических производств / Л.М.Карамова, Л.К.Каримова, Г.Р.Башарова. - Уфа, 2006. - 306 с.].

В основе механизма токсического действия большинства химических соединений лежит их способность взаимодействовать с молекулами клеточных органелл и мембран, что обуславливает нарушение внутриклеточного метаболизма в организме у работников нефтехимической и химической отрасли [Газалиева М.А. Цитохимические показатели в клетках слизистой оболочки носа и периферической крови у рабочих бериллиевого производства // Гигиена санитария. - 2010. - №1. - С.69-70].

Нарушение внутриклеточного метаболизма предшествует развитию различных заболеваний, в т.ч. заболеваний, обусловленных профессиональными факторами [Базарный В.В. Цитохимическая характеристика нейтрофильных гранулоцитов при различных вариантах ишемической болезни сердца / В.В.Базарный, Е.А.Тихонина, Ю.В.Шилко // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. - №8. - С.48 -49].

Клетки представляют собой сложно организованные системы, в которых протекают окислительно-восстановительные, гидролитические и другие процессы. К настоящему времени известны тысячи отдельных биохимических реакций, изучены участвующие в них ферменты.

Кислая и щелочная фосфатазы характеризуют функциональное состояние клеток как гидролитических систем, участвуют в обмене углеводов, нуклеотидов и фосфолипидов. Эти гидролитические системы имеют отношение к процессам внутриклеточного переваривания. Функция фосфатаз в организме состоит в поддержании концентрации фосфата, необходимого для различных биохимических процессов. Значительная активность фосфатазы в клетке свидетельствует о дестабилизации лизосомных мембран.

Миелопероксидаза, наиболее чувствительная к вредному воздействию химических веществ, обладает антиоксидантными свойствами и является показателем снижения секреторной функции органелл в клетках [Hayhoe, F.G. J. Haematological cytochemistry / F.G. J. Hayhoe, D. Quaglino. - New Jork, 1983. - 197 Р].

Гликоген, как один из продуктов метаболического превращения глюкозы, является важнейшим субстратом дыхания и гликолиза. Гликоген характеризует энергетические процессы, протекающие в клетках. Благодаря гликогену клетки обладают способностью ресинтезировать АТФ в анаэробных условиях. Внутриклеточный гликоген играет важную роль в обеспечении клеток энергией для осуществления ими специфических функции [Нагоева М.Х. Содержание гликогена в нейтрофильных гранулоцитах при ангинах различной природы // Современные наукоемкие технологии. - 2005. - №4 - С.95-96].

Известен способ определения активности кислой фосфатазы (КФ) с помощью реакции азосочетания по Goldberg и Barka (1962), щелочной фосфатазы (ЩФ) - по М.Г.Щубич, (1965); миелопероксидазы (МПО) - по методу Грэхема-Кнолля (1983), гликогена - по методу А.Л.Шабадаша (1947) [Hayhoe, F.G. J. Haematological cytochemistry / F.G. J. Hayhoe, D. Quaglino. - New Jork, 1983. - 197 Р].

Известен способ исследования метаболической активности нейтрофилов [Виксман М.Е., Маянский А.Н. Характеристика опсонических факторов по реакции восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1980, т.89, №2, с.214-215].

Прототипом изобретения является способ исследования поглотительной и метаболической активности нейтрофилов периферической крови методами фагоцитоза и нст-теста, заключающийся в том, что гепаринизированную венозную кровь разливают в пять конических пробирок по 0,1 мл, первые три из которых содержат по 0,1 мл суспензии неокрашенного латекса с размером частиц 1,5 мкм, 4-я - 0,1 мл среды 199 и 0,1 мл 0,1% водного раствора нитросинего тетразолия (НСТ), 5-я - 0,1 мл суспензии латекса и 0,1 мл 0,1% водного раствора НСТ. Инкубируют в термостате при t 37°С: 1-ю пробирку - 5 мин, 2-ю - 30 мин, 3-ю - 1 час, 4-ю и 5-ю - 40 мин. Готовят из 0,2 мл инкубационной смеси мазки на стеклах, высушивают при t 37°С, фиксируют в пламени горелки, окрашивают 1% водным раствором метиленового синего, повторно высушивают и микроскопируют под иммерсией при увеличении 90×10. Результаты исследования оценивают по поглотительной активности в реакциях фагоцитоза, определяя процент фагоцитирующих клеток, фагоцитарное число, фагоцитарный интегральный индекс и показатели скорости фагоцитоза. Реакцию НСТ-теста определяют путем подсчета процента формазан-позитивных клеток, вычисления цитохимического показателя активности и индекса стимуляции НСТ-теста (патент RU 2249215, 2005 г.).

Однако не существует интегрального показателя, в целом характеризующего степень нарушения различных сторон метаболизма.

Задачей изобретения стала разработка объективного, высокоинформативного способа оценки внутриклеточного метаболизма у работников нефтехимической и химической промышленности.

Технический результат - получение интегральной оценки состояния внутриклеточного метаболизма у работников химического и нефтехимического производства при обследованиях.

Предлагаемый способ оценки внутриклеточного метаболизма осуществляется следующим образом:

1. Приготовление мазков крови.

4 мазка крови делают на предметных стеклах с помощью более узкого предметного шлифованного стекла. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается "метелочкой". После приготовления мазки следует быстро высушить на воздухе до исчезновения влажного блеска.

Сухие мазки крови фиксируют в 10% спирт - формалиновой смеси 10 сек - для определения МПО, 30 сек - для определения КФ и ЩФ, 10 мин - для гликогена. Промывают проточной водой.

2.Приготовление рабочих растворов.

Для миелопероксидазы - растворяют содержимое одного флакона бензидина в 3 мл 96° этилового спирта и доливают 2 мл дистиллированной воды. Хорошо взбалтывают и перед употреблением добавляют пипеткой 1 каплю 3% перекиси водорода.

Для кислой фосфатазы - приготавливают ацетатный буфер (содержимое флакона ацетата Na растворяют в колбе в 500 мл дистиллированной воды, охлаждают. 20 мг нафтола-AS-фосфата растворяют в 0,5 мл диметилформамида, доливают 40 мл холодного ацетатного буфера), приготавливают 4% раствор азотистокислого Na (содержимое флакона с азотистокислым Na растворяют в 10 мл дистиллированной воды, в отдельной небольшой посуде (пробирке) смешивают 8 капель парарозанилина и 8 капель 4% раствора азотистокислого Na). Полученные растворы тщательно смешивают, отфильтровывают (рН должен быть 5,2-5,4).

Для щелочной фосфатазы - приготавливают 0,05 М буферного раствора (к содержимому флакона маточного раствора пропандиолового буфера добавляют 70 мл дистиллированной воды (рН 9,6-9,7)), приготавливают 2% раствор метилового зеленого (содержимое флакона метилового зеленого растворяют в 100 мл дистиллированной воды и выливают в делительную воронку. В ту же воронку заливают 50 мл хлороформа. Экстрагируют хлороформом, полученный метиленовый фиолетовый удаляют). Приготавливают раствор из содержимого флакона с альфа-нафтилфосфатом натрия с 5 мл 0,05 М буферного раствора и добавляют содержимое флакона прочного синего РР, перемешивают.

Для гликогена - содержимое флакона с йодной кислотой растворяют в 50 мл дистиллированной воды (получают 1% раствор йодной кислоты).

Рабочие растворы хранятся в течение 3 месяцев в темном месте и используются на 6-15 исследований.

3.Окраска мазков.

На миелопероксидазу - на предметное стекло приливают рабочий раствор, оставляют на 15-20 мин, промывают дистиллированной водой и промачивают фильтровальной бумагой, промывают стекла в проточной воде. Докрашивают 0,5% раствором красителя по Романовскому (15-20 мин), промывают стекла в проточной воде, высушивают.

На кислую фосфатазу - помещают в свежеприготовленный рабочий раствор, инкубируют в темноте при t 37°С (2-3 часа), промывают дистиллированной водой и промачивают фильтровальной бумагой, докрашивают ядра гематоксилином Майера (15 мин), промывают стекла в проточной воде, высушивают.

На щелочную фосфатазу - инкубируют в субстратной смеси (10 мин) при комнатной температуре, промывают проточной водой, докрашивают 2% раствором метилового зеленого в течение (15 мин), высушивают.

На гликоген - помещают мазки в 1% раствор йодной кислоты (10 мин), промывают дистиллированной водой и промачивают фильтровальной бумагой, помещают мазки в реактив Шиффа (30 мин), промывают в проточной воде, докрашивают мазки гематоксилином Майера (15 мин), промывают в проточной воде, высушивают.

4. Микроскопия и подсчет СЦК, % фосфатазоположительных клеток.

Для подсчета кислой и щелочной фосфатазы используют принцип Астальди, основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски.

В зависимости от окраски исследуемые клетки делят на 4 группы:

с отрицательной реакцией (-),

слабоположительной (+),

положительной (++)

резко положительной (+++).

Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по степени интенсивности окраски, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски суммируют и вычитают количество клеток без окраски, результат выражают в процентах. Результат выражают в % фосфатазоположительных клеток.

Для подсчета миелопероксидазы и гликогена рассчитывают средний цитохимический коэффициента (СЦК) по Каплоу (1955). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по степени интенсивности окраски, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумму этих произведений делят на 100, что и составляет СЦК.

5. Оценка показателя нарушения метаболизма

Полученные значения сопоставляют с референтными значениями [Методические рекомендации по разработке референтных величин лабораторных показателей: Мет.рекомендации / В.В.Меньшиков, Л.М.Пименова. - М., 1983, Биохимические и цитохимические методы определения активности ферментов и фермент-субстратных систем различной клеточной локализации: мет.рекомендации / Р.В.Меркурьева, Г.Л.Билич, Р.П.Нарциссов. - М., 1982, 19-21 с.].

Референтные значения

Для оценки состояния внутриклеточного метаболизма вводят показатель степени нарушения метаболизма в нейтрофиле (ПНМ), характеризующий нарушение процессов в нейтрофиле. ПНМ рассчитывается как сумма условных единиц, характеризующих состояние каждого из 4-х показателей (значение, отклоненное от референтных значений, соответствует 1, значение в пределах референтных значений соответствует 0), и изменяется в интервале от 0-4.

Степень нарушения внутриклеточного метаболизма оценивают по значению ПНМ

0 - метаболизм в клетке в норме (ПНМ=0)

I - легкая степень нарушения внутриклеточного метаболизма (ПНМ=1)

II - средняя степень нарушения внутриклеточного метаболизма (ПНМ=2)

III - высокая степень нарушения внутриклеточного метаболизма (ПНМ=3-4)

Пример 1. Работник А., стаж работы - 10 лет, возраст - 34 года. Диагноз: хронический профессиональный бронхит. Находился на стационарном лечении в клинике института медицины труда и экологии человека.

При поступлении в мазке крови (в нейтрофилах) определен уровень миелопероксидазы (2,16 у.е.), гликогена (2,11 у.е.), кислой фосфатазы (55%), щелочной фосфатазы (76%).

Уровень миелопероксидазы в нейтрофиле - 2,16 у.е., значительно ниже референтных значений 2,23-2,89 у.е., следовательно, данное отклонение условно принимают за 1.

Уровень гликогена в нейтрофиле - 2,11 у.е, значительно выше референтных значений 1,74-2,04 у.е., следовательно, данное отклонение также условно принимают за 1.

Уровень кислой фосфатазы - 55%, превышает референтые значения 17-30%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 1.

Уровень щелочной фосфатазы - 76%, превышает референтые значения 18-54%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 1.

ПНМ, полученный, как сумма условно принятых единиц:

ПНМ=1+1+1+1=4.

Рассчитанный ПНМ был равен 4, что соответствует степени III - высокой степени нарушения внутриклеточного метаболизма.

На 3-ий день в мазке крови (в нейтрофилах) определен уровень миелопеоксидазы (2,18 у.е.), гликогена (2,08 у.е.), кислой фосфатазы (37%), щелочной фосфатазы (51%).

Уровень миелопероксидазы в нейтрофиле - 2,18 у.е., ниже референтных значений 2,23-2,89 у.е., следовательно, данное отклонение условно принимают за 1.

Уровень гликогена в нейтрофиле - 2,08 у.е, значительно выше референтных значений 1,74-2,04 у.е., следовательно, данное отклонение также условно принимают за 1.

Уровень кислой фосфатазы - 37%, превышает референтые значения 17-30%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 1.

Уровень щелочной фосфатазы - 51%, находится в пределах референтых значений 18-54%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

ПНМ, полученный, как сумма условно принятых единиц:

ПНМ=1+1+1+0=3.

Рассчитанный ПНМ был равен 3,что соответствует степени III - высокой степени нарушения внутриклеточного метаболизма.

Через 6 дней в мазке крови (в нейтрофилах) определен уровень миелопеоксидазы (2,24 у.е.), гликогена (2,09 у.е.), кислой фосфатазы (38%), щелочной фосфатазы (50%).

Уровень миелопероксидазы в нейтрофиле - 2,24 у.е., находится в пределах референтных значений 2,23-2,89 у.е., следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

Уровень гликогена в нейтрофиле - 2,09 у.е, значительно выше референтных значений 1,74-2,04 у.е., следовательно, данное отклонение также условно принимают за 1.

Уровень кислой фосфатазы - 38%, превышает референтые значения 17-30%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 1.

Уровень щелочной фосфатазы - 50%, находится в пределах референтых значений 18-54%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

ПНМ, полученный, как сумма условно принятых единиц:

ПНМ=0+1+1+0=2.

Рассчитанный ПНМ был равен 2,что соответствует степени II - средней степени нарушения внутриклеточного метаболизма.

При выписке в мазке крови определен уровень миелопеоксидазы (2,26 у.е.), гликогена (2,08 у.е.), кислой фосфатазы (25%), щелочной фосфатазы (46%).

Уровень миелопероксидазы в нейтрофиле - 2,26 у.е., находится в пределах референтных значений 2,23-2,89 у.е., следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

Уровень гликогена в нейтрофиле - 2,08 у.е, выше референтных значений 1,74-2,04 у.е., следовательно, данное отклонение также условно принимают за 1.

Уровень кислой фосфатазы - 25%, находится в пределах референтых значений 17-30%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

Уровень щелочной фосфатазы - 46%, находится в пределах референтых значений 18-54%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

ПНМ, полученный, как сумма условно принятых единиц:

ПНМ=0+1+0+0=1.

Рассчитанный ПНМ был равен 1,что соответствует степени I-легкой степени нарушения метаболизма.

Пример 2. Работник В.. стаж работы - 5 лет, возраст - 29 лет.

Диагноз: здоров.

В мазке крови определен уровень миелопеоксидазы (2,56 у.е.), гликогена (2,00 у.е.), кислой фосфатазы (27%), щелочной фосфатазы (49%).

Уровень миелопероксидазы в нейтрофиле - 2,56 у.е., находится в пределах референтных значений 2,23-2,89 у.е., следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

Уровень гликогена в нейтрофиле - 2,00 у.е, находится в пределах референтных значений 1,74-2,04 у.е., следовательно, данное отклонение также условно принимают за 0.

Уровень кислой фосфатазы - 27%, находится в пределах референтых значений 17-30%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

Уровень щелочной фосфатазы - 49%, находится в пределах референтых значений 18-54%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

ПНМ, полученный, как сумма условно принятых единиц:

ПНМ=0+0+0+0=0.

Рассчитанный ПНМ был равен 0, что соответствует степени 0 - нормальному метаболизму в клетках.