Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ПЕЧЕНИ РЫБ ТРЕСКОВЫХ ПОРОД

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к способам получения биологически активных веществ из субпродуктов животного происхождения, в частности к получению биологически активных комплексов на основе водорастворимых белков печени рыб семейства Gadidae, обладающих сбалансированным аминокислотным составом, повышенным содержанием пептидов и высокой антиоксидантной активностью.

Одним из основных компонентов системы внутренних органов, богатых высококачественными протеинами, является печень. Содержание протеинов в печени, в зависимости от вида рыб, может достигать 20% (Bechtel et al. Chemical characterization of liver lipid and protein from cold-water fish species. J. Food Sci. 2006. 71(6): 480-485). Наиболее изученными пептидами из внутренних органов являются пептиды, выделенные из гидролизатов кишечника и печени рыбы бонито Gymnosarda unicolor (Ahn et al. Enzymatic production of bioactive protein hydrolysates from tuna liver: effects of enzymes and molecular weight on bioactivity. Int. J. Food Sci. Technol. 2010. 45: 562-568; Karaki et al. Oral administration of peptides derived from bonito bowels decreases blood pressure in spontaneously hypertensive rats by inhibiting angiotensin converting enzyme. Comp. Biochem. Physiol. C. 1993. 104(2): 351-353). В печени и других органах японской камбалы Paralichtys olivaceus был обнаружен богатый цистеином пептид гепсидин, проявляющий высокую антимикробную активность (Hirono et al. Two different types of hepcidins from the Japanese flounder Paralichthys olivaceus. FEBS J. 2005. 272(20): 5257-5264). В печени атлантического лосося Salmo salar найдены и локализованы клетки, вырабатывающие эстроген и ксеноэстроген (Arukwe et al. Fish model for assessing the in vivo estrogenic potency of the mycotoxin zearalenone and its metabolites. Sci. Total Environ. 1999. 236(1-3): 153-161), из этого же объекта был выделен белок, обладающий антимикробным действием (Richards et al. Histone H1: an antimicrobial protein of Atlantic salmon (Salmo salar). Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. 284(3): 549-555). Таким образом, печень различных рыб может служить источником большого количества как низкомолекулярных веществ, так и целого набора пептидов, которые можно применять для приготовления лекарственных средств.

Описан способ получения водорастворимого комплекса полипептидов из печени рыб, а именно из печени акулы, применяемого в качестве иммуностимулятора, включающий охлаждение печени акулы до 0°С; распыление охлажденной печени акулы для получения тщательно измельченного материала; смешивание тщательно измельченного материала с равным количеством воды при условии поддерживания в смеси температуры 0°С в течение 20 мин; центрифугирование смеси при 0-4°С в течение 4-6 ч для разделения смеси на три различных слоя, представляющих собой клеточный слой, водный слой и масляный слой; отделение водного слоя от других слоев; фильтрование водного слоя с целью получения профильтрованного раствора; и распыление профильтрованного раствора в вакуумной камере при 0-4°С с целью получения сухого порошкообразного вещества (Pat. US 5840342 (A), опубл. 24.11.1998).

Применение оборудования для распыления охлажденной печени, а также низкотемпературного высокоскоростного центрифугирования в течение нескольких часов является дорогостоящим. Его использование для производства продукции в промышленных масштабах ведет к высоким материальным затратам и удорожанию продукции.

Известен способ получения лекарственного препарата «Скваакан» - комплекса полипептидов из печени рыб, а именно из печени акулы, заключающийся в том, что печень акулы катран гомогенизируют, обезжиривают путем холодного отстоя при 1 - +5°С в течение 20-24 часов, затем обезжиренный гомогенат направляют на термическую и химическую коагуляцию белков при рН 1,0-6,0, оттаивают при комнатной температуре в течение 5-6 ч с получением стабилизированного экстракта, который после центрифугирования и мембранной фильтрации ампулируют и автоклавируют (Pat. RU 2211700 (C2), опубл. 10.09.2003).

Недостатком данного метода является большая длительность процесса и использование для осветления конечного экстракта центрифуг и мембранного оборудования, не позволяющего обрабатывать большие объемы экстракта. Процесс ведется при низком рН, что требует очистки сточных вод от кислот.

Известен способ получения водорастворимого полипептидного комплекса из печени рыб лососевых пород, включающий измельчение исходного сырья, экстракцию дистиллированной водой при соотношении сырье:экстрагент 1:5-1:30 с последующим подщелачиванием суспензии до рН 8-9 и настаиванием ее при комнатной температуре в течение 2-4 часов с перемешиванием, очистку целевого продукта путем обработки жидкой фракции 0.3% раствором хитозана в 3% растворе пищевой органической кислоты при рН 2,5-3,0 в соотношении 1:20 с перемешиванием в течение 1 часа и последующим инкубированием смеси в течение 2-3 часов и двойным разделением путем сепарирования на твердую и жидкую фракции с последующим соединением жидких фракций (Pat. RU 2409291 (C1), опубл. 20.01.2011).

Недостатком этого способа является большое количество рабочих стадий, применение кислот и щелочей, что ведет к большому количеству стоков, требующих очистки, использование дорогостоящего хитозана, обладающего собственной биологической активность.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ комплексной переработки печени рыб семейства тресковых и получения липидного комплекса, гидрофильного комплекса и кормового продукта (Pat. RU 2420213 (C1), опубл. 10.06.2011), выбранный авторами за прототип. Печень рыб семейства тресковых измельчают, массу переносят в реактор с мешалкой и добавляют небольшими порциями при перемешивании растительное масло при соотношении измельченной печени и масла 1:0,2÷5,0. После этого в реактор при перемешивании небольшими порциями вносят воду при соотношении измельченной печени и воды 1:0,2÷5,0. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1-15 мин. Процесс ведут до появления границы раздела фаз, определяемой визуально. Образовавшуюся суспензию центрифугируют для выделения отдельных фракций, различающихся по плотности: гидрофильной, липофильной и плотного остатка. Гидрофильную фракцию, представляющую собой водный раствор биологически активных соединений, содержащую в том числе пептиды, и липофильную фракцию направляют на сепарирование. Плотный остаток используют в качестве кормового продукта. Гидрофильную фракцию после сепарирования направляют на коагуляцию. Полученную липофильную фракцию очищают от примесей нежирового характера. После этого очищают липофильную фракцию от стеринов и восков выдерживанием при температуре от -15 до +5°С (6) в течение 1-24 часов до осаждения балластных веществ и последующим фильтрованием липофильной фракции. Содержание пептидов в гидрофильной фракции составляет около 1-1,15%.

Недостатком данной технологии является затрудненное разделение фракций и необходимости использования центрифугирования, низкое содержание пептидов в гидрофильной фракции, присутствие значительного количества липидов. Данное обстоятельство ограничивает растворимость целевого продукта, что может приводить к снижению активности, более быстрой его порче. Кроме того, данный комплекс не растворим в воде, что ограничивает его биодоступность.

Задачей изобретения является промышленная переработка печени рыб тресковых пород с получением водорастворимого комплекса пептидов, обладающего сбалансированным аминокислотным составом, повышенным содержанием пептидов и высокой антиоксидантной активностью.

Задача изобретения решается тем, что в известном способе, включающем измельчение печени, смешивание с маслом при соотношении печени и масла 1:0,2÷5,0 и водой при соотношении печени и воды 1:0,2÷5,0, расслаивание при комнатной температуре в течение 1-15 мин, центрифугирование, сепарирование, выдерживание липидного комплекса при температуре от -15 до +5°С в течение 1-24 ч и фильтрование, согласно изобретению экстракцию проводят смесью масла и воды при соотношении сырье: экстрагент 1:5-1:30 при комнатной температуре в течение 2-4 часов с перемешиванием, целевой продукт очищают путем обработки органическим растворителем в соотношении 1:0,5÷2 с последующим разделением и высушиванием водного остатка.

Причем в качестве сырья используют печень рыб тресковых пород в свежем, мороженом или сухом виде.

Органический растворитель выбирают из ряда диэтиловый эфир, этилацетат, бутанол, хлороформ.

Сущность способа заключается в следующем. Свежую или замороженную печень рыб тресковых пород (сем. Gadidae) (треска, пикша, минтай, путассу и т.п.) измельчают на куттере или электромясорубке. Как показали предварительные опыты, более тщательное измельчение с разрушением клеток не требуется. Высушенную печень измельчать нет необходимости, поскольку она измельчается перед сушкой. Фарш свежей или замороженной печени или раздробленные кусочки сушеной печени заливают смесью масла и воды при соотношении сырье:экстрагент 1:5-1:20 для свежей или замороженной печени и 1:30 в случае сублимированной печени.

Суспензию инкубируют при комнатной температуре с перемешиванием в течение 2-4 часов, затем отделяют осадок, что целесообразно проводить на промышленном сепараторе или проточной центрифуге непрерывного действия. Жидкую фракцию разделяют, высушивают водный остаток тем или иным способом, за исключением высокотемпературного выпаривания. Далее проводят очистку целевого продукта путем обработки бутанолом в соотношении 1:1 с последующим разделением и высушиванием.

Конечный продукт представляет собой субстанцию коричневого цвета, не гигроскопичный, с солоноватым привкусом и не обладающий неприятным запахом, не содержит токсичных элементов в количествах, превышающих ПДК, и патогенную микрофлору, т.е. является безопасным.

Продукт на 30 или более процентов состоит из пептидов. При проведении электрофореза в полиакриламидном геле выяснилось, что из большого спектра белков и полипептидов, присутствующих в водном экстракте печени рыб семейства Gadidae, в конечном продукте после обработки бутанолом остаются пептидные фракции с молекулярной массой 20-15 кДа, 15-3,5 кДа и низкомолекулярная фракция менее 3,5 кДа, куда входят олигопептиды, свободные аминокислоты и глицерофосфат. В пептидной субстанции отсутствуют высокомолекулярные белковые соединения (по качественной реакции на белок методом осаждения трихлоруксусной кислотой). Содержание свободных аминокислот составило 20-55%, среди которых основными являются: глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, пролин, серии, треонин, лизин, глутамин, валин, тирозин, лейцин и метионин.

Пример 1

2 кг свежей печени трески (Gadus morrhua L.) измельчают с помощью электромясорубки, после чего фарш помещают в аппарат с мешалкой и заливают 20 л смеси растительного масла и воды в соотношении 1:1, перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Полученную суспензию разделяют на сепараторе. Твердую фракцию направляют на изготовление кормовой муки, жидкую фракцию - на дальнейшую очистку от жировых примесей и высокомолекулярных белковых примесей. Полученную водную фракцию лиофильно высушивают и полученный остаток диспергируют в воде и очищают от водонерастворимых примесей экстракцией диэтиловым эфиром в соотношении 1:1. Водную фракцию декантируют и высушивают. В результате получают 18 г сухого пептидного комплекса.

Конечный продукт представляет собой порошок светло-коричневого цвета, не гигроскопичный, с солоноватым привкусом и не обладающий неприятным запахом, не содержит токсичных элементов в количествах, превышающих ПДК, и патогенную микрофлору, т.е. соответствует показателям безопасности.

Пример 2

0,5 кг сублимированной печени пикши (Melanogrammus aeglefinus L.) загружают в реактор с мешалкой и заливают 25 л смеси растительного масла и воды в соотношении 1:1, перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Далее поступают аналогично примеру 1, но очищают от водонерастворимых примесей экстракцией бутанолом в соотношении 1:0,5.

Выход пептидного комплекса 5,3 г.

Пример 3

5 кг замороженной печени путассу (Micromesistius poutassou) измельчают, помещают в аппарат с мешалкой и заливают 3,5 л смеси растительного масла и воды в соотношении 1:1, перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Далее поступают аналогично примеру 1, но очищают от водонерастворимых примесей экстракцией этилацетатом в соотношении 1:2.

Выход сухого полипептидного продукта 43 г.

Пример 4

Антиоксидантная активность в отношении радикала DPPH.

Антиоксидантную активность композиции по примеру 1 исследовали в отношении радикала DPPH спектрофотометрическим методом. В качестве препарата сравнения использовали Алфлутоп - препарат, получаемый из мелких морских рыб.

Установили, что IC50 для водорастворимых полипептидов, выделенных из печени рыб тресковых пород, составляет около 4,3 мг/мл, что сопоставимо с препаратом сравнения Алфлутоп, для которого IC50 было (4,6 мг/мл).