Способ прогнозирования врастания плаценты при беременности

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии.

В настоящее время во всем мире сформировалась значимая проблема увеличение частоты выполнения операции кесарево сечение, и пропорционально возрастанию частоты проведения абдоминального родоразрешения, при последующей беременности у женщины с рубцом на матке растет риск инвазии плаценты в рубец с формированием тяжелейшей патологии гестационного процесса - врастания плаценты (Курцер М.А Истинное врастание плаценты (placenta accreta). Консервативная терапия/ Курцер М.А., Бреслав И.Ю., Лукашина М.В. и др.//Акушерство и гинекология. - 2011-N4 - с. 118-122).

С 1960 по 2002 года - частота врастания возросла в 60 раз, с 1:30000 беременностей до 1:533 беременности, (Robert М. S. Placenta Accreta Spectrum. / Robert M. Silver, MD, Kelli D. Barbour// Obstetrics and Gynecology Clinics of North America - 2015 - Vol. 42, N2. - P. 381-402.). Проведенное в 2011 году мультицентровое исследование в США показало возрастание числа врастаний предлежащей плаценты при рубце на матке после кесарева сечения до 3%, 11% 40%, 61% и 67% при рубце на матке после одной, двух, трех, четырех и пяти операций кесарево сечение соответственно, летальность при родоразрешении - 7% (Heller D.S. Placenta Accreta and Percreta/ Heller D.S.// Surgical Pathology Clinics. - 2013 - Vol. 6, N1 - P.181-197). По сообщениям Xiao-Yu Pan с соавт. (2015) в Китае (где частота ОКС достигает 40%) показания к гистерэктомии в акушерстве в течение последних 10 лет изменились, и если в начале 2000 годов лидирующим показанием к гистерэктомии служила атония матки (в 2000 году - 50% экстирпация матки, в 2015 году - 17.7%), то в настоящее время в 77,8% случаев показанием к гистерэктомии служит врастание плаценты (Pan XY A Marked Increase in Obstetric Hysterectomy for Placenta Accreta./ Pan XY, Wang YP, Zheng Z//Chin. Med. J. - 2015 - Vol. 128, N16. - P. 2189-2193).

В исследованиях in vitro показано, что клетки цитотрофобласта при врастании плаценты обладают большей способностью к инвазии, чем в норме (Давыдов, А.И. Клиническая оценка экспрессии иммуногистохимических маркеров в патогенезе врастания плаценты / А.И. Давыдов, И.Б. Агрба, И.Н. Волощук, И.И. Киличева //Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии - 2013. - №2. - С. 9-16). Ключевыми факторами протеолиза при плацентации являются ферменты группы желатиназ - матриксные металлопротеиназы (MMPs) и их тканевые ингибиторы (TIMPs) (Matjila, М. The Differential Expression of Kiss 1, MMP9 and Angiogenic Regulators across the Feto-Maternal Interface of Healthy Human Pregnancies: Implications for Trophoblast Invasion and Vessel Development / M. Matjila, R. Millar, Z. Van der Spuy, A. Katz //PLoS One.-2013.-Vol. 8, №5 - e63574). В ряде работ показано, что уровень металлопротеиназ 2 и 9 типа (ММР-2, ММР-9) значительно выше в сыворотке женщин с врастанием плаценты по сравнению с небеременными и при физиологически протекающей беременности (Ke, Y. Involvement of matrix metalloproteinase-2, -9, and tissue inhibitors of metalloproteinase-1, 2 in occurrence of the accrete placenta / Y. Ke, J.H. Lu, B.L. Yang, H.Q. Guo, Q.Y. Ma, H. Zhu, H.M. Shu, D.J. Li //Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi. - 2006. - Vol. 41, №5. - P. 311-314.). Концентрация TIMPs зависит от концентрации MMPs в тканях и внеклеточной жидкости, ограничивая, таким образом, протеолитическую активность в фокальном околоклеточном пространстве (Deng, Q. N-acetylglucosaminyltransferase V inhibits the invasion of trophoblast cells by attenuating MMP2/9 activity in early human pregnancy / Q. Deng, Y. Chen, N. Yin, N. Shan, X. Luo, C. Tong, H. Zhang, P.N. Baker, X. Liu, H. Qi //Placenta. - 2015. - Vol. 36, №11. - P. 1291-9.) TIMPs содержатся в соединительной ткани, отличаются в своей специфичности ингибирования желатиназ с наибольшей активностью TIMP-1 к ММР-9, TIMP-2 к ММР-2. Повышение уровня протеаз приводит к увеличению продукции их ингибиторов, и определяющее значение для осуществления избыточного протеолиза в итоге имеет нарушение их баланса. Также, в ряде работ отмечается важная роль кисспептина в патофизиологии placenta accreta, учитывая его роль в качестве ингибитора инвазии клеток трофобласта, посредством ингибирования действия металлопротеиназ. (Qiao С. The role of KiSSl and matrix metalloproteinase 9 in regulation of invasion of trophoblasts/ Qiao С, Cheng DL, Zhang SL, Wang CH, Lin Q.D.// Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2005 Mar 30;85(12):83942). Таким образом, точное и раннее прогнозирование врастания плаценты позволит своевременно отнести беременных к группе риска по развитию данной патологии, перенаправить в стационары 3 группы риска (перинатальные центры), для определения срока родоразрешения и проведения адекватного по объему операции, наименее травматичного абдоминального родоразрешения.

Известен способ прогнозирования врастания плаценты путем определения содержания в материнской крови фетальной ДНК методом DANSR™. (SamuelA. Fraction of cell-free fetal DNA in the maternal serum as predictor of abnormal placental invasion-a pilot study./ Samuel A., Bonanno C, Oliphant A., Batey A., Wright J.D.// Prenat Diagn. - 2013. - Vol. 33(11). - P:1050-3. doi: 10.1002/pd.4195. Epub 2013 Aug 4)

При этом сами авторы не отмечают выраженной диагностической значимости при использовании этого способа, в виду: слабых различий в основной группе, группе контроля, сложности постановки реакции DANSR™, низкой чувствительности и специфичности метода.

Известен способ прогнозирования развития врастания плаценты иммуноферментным определением в сыворотке крови РАРР-А (ассоциированного с беременностью белка А) в 1 триместре беременности. Повышение сывороточного уровня РАРР-А до 1.68 МоМ значимо коррелировало с риском возникновения врастания плаценты. (Desai N. Elevated first trimester PAPP--a is associated with increased risk of placenta accreta / Desai N., Krantz D., Roman A., Fleischer A., Boulis S., Rochelson B.// Prenat Diagn. - 2014. - Vol. 34(2). - P:159-62. doi: 10.1002/pd.4277. Epub 2013 Dec 9).

В данном источнике не указана чувствительность и специфичность метода, при этом есть данные, свидетельствующие о возможности повышения уровня РАРР-А при физиологически протекающей беременности в 1 триместре, при возникновении беременности после отмены оральных контрацептивов, а также при развитии преэклампсии.

Известен способ прогнозирования врастания плаценты путем иммуноферментного определения в сыворотке крови альфа-фетопротеина (АФП) и хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в 15-20 недель гестации. Повышенные показатели АФП и ХГЧ коррелируют с неудовлетворительными исходами беременности: преэклампсия, преждевременный разрыв плодных оболочек, патологическая плацентарная инвазия, антенатальная гибель плода ( The role of unexplained high serum alpha-fetoprotein (AFP) and human chorionic gonadotropin (hCG) levels in the second trimester to determine poor obstetric outcomes / , Erkaya S., , , Vanh Tonyali N., // Turk J Obstet Gynecol. - 2014. - Vol. 11(3). - P: 142-147)

Однако, данный способ характеризуется низкой специфичностью: уровень АФП и ХГЧ возрастает при различных акушерских осложнениях: преэклампсия, патологическая плацентарная инвазия, антенатальная гибель плода, преждевременный разрыв плодных оболочек, что не позволяет использовать его для прогнозирования формирования именно врастания плаценты. Способу присуща высокая индивидуальная вариабельность показателей для уровней веществ в сыворотке крови. Отсутствуют данные о точности способа.

Поставлена задача повышения точности прогнозирования возникновения врастания плаценты во время беременности с целью улучшения исхода беременности.

Поставленная задача достигается тем, что у беременных в сроке 20-26 недель гестации иммуноферментным анализом (ИФА) в сыворотке крови определяют уровень маркеров врастания плаценты: матриксных металлопротеиназ 2-го и 9-го типа, их ингибиторов (TIMP-1, TIMP-2), кисспептина (kisspeptin) и соотношения концентраций MMP-9/TIMP-1, и при значении одного из которых более 380,8 пг/мл для ММР-2, более 240,1 нг/мл для ММР-9, более 8,5 нг/мл для TIMP-1, более 6,1 нг/мл для TIMP-2, более 145,2 пг/мл для кисспептина, а для MMP-9/TIMP-1 менее 49,9 с точностью 81,4%, чувствительностью 78,8% и специфичностью 84,0% прогнозируют возникновение при данной беременности патологической плацентарной инвазии - врастания плаценты.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что предлагается с высокой точностью, чувствительностью и специфичностью прогнозировать врастание плаценты у беременных женщин как с наличием предлежания плаценты, так и без него, в сроке гестации 20-26 недель и позже по определению количественного содержания в сыворотке крови маркеров патологической плацентарной инвазии - матриксных металлопротеиназ 2 и 9 типа, их ингибиторов (TIMP-1, TIMP-2), кисспептина (kisspeptin), а также вычислению введенного в предлагаемом техническом решении соотношения концентраций MMP-9/TIMP-1.

Данный показатель ранее не использовался для прогнозирования врастания плаценты. В литературе есть данные, свидетельствующие о повышении уровня матриксных металлопротеиназ 2 и 9 типа и их ингибиторов в периферической крови, но нет данных об изменении уровня кисспептина, не описано соотношение MMP-9/TIMP-1. Также в литературе нет данных о критической величине содержания металлопротеиназ 2 и 9 типа и их ингибиторов, кисспептина и соотношения MMP-9/TIMP-1, позволяющей с высокой точностью, чувствительностью и специфичностью прогнозировать врастание плаценты.

В настоящее время известно, что клетки цитотрофобласта при врастании плаценты обладают большей способностью к инвазии, чем при нормальной беременности (Давыдов, А.И. Клиническая оценка экспрессии иммуногистохимических маркеров в патогенезе врастания плаценты / А.И. Давыдов, И.Б. Агрба, И.Н. Волощук, И.И. Киличева //Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2013. - №2. - С. 9-16). Ключевыми факторами протеолиза при плацентации являются ферменты группы желатиназ - матриксные металлопротеиназы (MMPs) и их тканевые ингибиторы (TIMPs) (Matjila, М. The Differential Expression of Kiss 1, MMP9 and Angiogenic Regulators across the Feto-Maternal Interface of Healthy Human Pregnancies: Implications for Trophoblast Invasion and Vessel Development / M. Matjila, R. Millar, Z. Van der Spuy, A. Katz //PLoS One. - 2013. - Vol. 8, №5 - e63574). В ряде работ показано, что уровень металлопротеиназ 2 и 9 типа (ММР-2, ММР-9) значительно выше в сыворотке женщин с врастанием плаценты по сравнению с небеременными и при физиологически протекающей беременности (Ke, Y. Involvement of matrix metalloproteinase-2, -9, and tissue inhibitors of metalloproteinase-1, 2 in occurrence of the accrete placenta / Y. Ke, J. H. Lu, B.L. Yang, H.Q. Guo, Q.Y. Ma, H. Zhu, H.M. Shu, D.J. Li //Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi - 2006. - Vol. 41, №5. - P. 311-314. doi: 10.3760/j.issn:0529-567x.2006.05.007). Концентрация TIMPs зависит от концентрации MMPs в тканях и внеклеточной жидкости, ограничивая, таким образом протеолитическую активность в фокальном околоклеточном пространстве. (Deng, Q. N-acetylglucosaminyltransferase V inhibits the invasion of trophoblast cells by attenuating MMP2/9 activity in early human pregnancy / Q. Deng, Y. Chen, N. Yin, N. Shan, X. Luo, C. Tong, H. Zhang, P.N. Baker, X. Liu, H. Qi //Placenta - 2015. - Vol. 36, №11. - P. 1291-9.) TIMPs содержатся в соединительной ткани, отличаются в своей специфичности ингибирования желатиназ с наибольшей активностью TIMP-1 к ММР-9, TIMP-2 к ММР-2. Повышение уровня протеаз приводит к увеличению продукции их ингибиторов, и определяющее значение для осуществления избыточного протеолиза в итоге имеет нарушение их баланса. Также в ряде работ отмечается важная роль кисспептина в патофизиологии placenta accreta, учитывая его роль в качестве ингибитора инвазии клеток трофобласта, посредством ингибирования действия металлопротеиназ. (Qiao С. The role of KiSSland matrix metalloproteinase 9 in regulation of invasion of trophoblasts/ Qiao С, Cheng DL, Zhang SL, Wang CH, Lin Q.D.// Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2005 Mar 30;85(12):83942). Установлено, что раннее повышение активности факторов протеолиза при плацентации - матриксных металлопротеиназ 2 и 9 типа, а также, компенсаторно, повышение активности, при этом недостаточное для ингибирования патологического протеолиза, специфических (TIMP-1, TIMP-2) и неспецифических ингибиторов у беременных в 1-2 триместре беременности является одним из механизмов, определяющих формирования врастания плаценты, и может отражать нарушение аутокринной регуляции в месте формирования плаценты. Повышение активности вышеприведенных маркеров врастания в околоклеточном матриксе приводит к повышенной их секреции в периферическую кровь, что позволяет прогнозировать врастание плаценты путем определения количественного содержания этих веществ иммуноферментным анализом в сыворотке крови.

Способ прогнозирования врастания плаценты при беременности осуществляют следующим образом:

1)При исследовании используют одну из наиболее часто применяемых модификаций анализа - гетерогенный ИФА (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), принцип которого состоит в одновременном взаимодействии антигена изучаемого образца со специфическим антителом (AT),иммобилизованном на твердой матрице (первичные AT) и конъюгатом таких специфических AT с ферментом (вторичные AT). Количество связанного конъюгата выявляется с помощью хромогенного субстрата, вступающего в реакцию с ферментом. При этом интенсивность приобретенного окрашивания пропорциональна количеству AT в образце.

2) Кровь для исследования берут из локтевой вены в количестве 10 мл в вакуумные пробирки Vacutainer с активатором свертывания (кремнезем). Материалом для исследования является сыворотка крови. В течение 30 минут при комнатной температуре и вертикальном положении пробирки дожидаются завершения процесса свертывания крови, после чего для максимального выдавливания сыворотки из сгустка, пробирки со свернувшейся кровью центрифугируют со скоростью 2500 оборотов в минуту в течение 10 минут. После этого супернатантную сыворотку отбирают в пробирки типа Eppendorf объемом 0,5 мл и тотчас замораживают при температуре -20°С. Непосредственно перед анализом образцы медленно размораживают при комнатной температуре (23-25°С) и аккуратно перемешивают.

3) Стандарты, контроль и предварительно разведенные образцы сыворотки инкубируют в лунках планшета (твердая матрица), сорбированных антителами к матриксным металлопротеиназам 2 и 9 типа, их ингибиторам и кисспептину, согласно инструкциям, к стандартным тест-системам фирм Cloud Clone corp. (США) для определения концентрации ММР-2, ММР-9, TIMP-1, TIMP-2, Kisspeptin. В ячейки планшета с иммобилизованными антителами к изучаемым факторам добавляют сыворотку крови. В процессе инкубации образуется специфический комплекс антиген-антитело. Носитель отмывают от не связавшихся антигенов и добавляют меченые антитела - конъюгат моноклональных антител (с пероксидазой хрена, стрептавидин-пероксидаза). При этом количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству антигена в исследуемом образце.

4) После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата добавляют хромогенный субстрат для используемого фермента, который изменяет цвет под действием фермента (ферментативная реакция с окрашиванием раствора в лунках). Реакцию останавливают добавлением кислого стоп-раствора. Измерение оптической плотности проводят анализатором иммуноферментных реакций УНИПЛАН (АИФР-01, ЗАО «Пикон», Россия), концентрацию изучаемых факторов в образцах определяют по стандартной кривой, построенной по 7 приготовленным разведениям стандартов факторов, согласно инструкциям к используемым наборам.

Отличительные признаки заявленного способа: установлен новый прогностический параметр количественного содержания маркеров врастания плаценты: матриксных металлопротеиназ 2 и 9 типа, их ингибиторов (TIMP-1, TIMP-2) и кисспептина (kisspeptin), при значении одного из которых: для ММР-2 более 380,8 пг/мл, для ММР-9 более 240,1 нг/мл, для TIMP-1 более 8,5 нг/мл, для TIMP-2 более 6,1 нг/мл, для кисспептина более 145,2 пг/мл, а для MMP-9/TIMP-1 менее 49,9 с точностью 81,4% прогнозируют возникновение во время беременности патологической плацентарной инвазии - врастания плаценты.

Клинические примеры:

Пример 1. Пациентка В., 32 года, беременность третья, индуцированная ЭКО в связи с абсолютным трубным бесплодием в течение 10 лет (первые две беременности - эктопические трубные, завершившиеся лапароскопической тубэктомией). На момент обследования в женской консультации в сроке 21 неделя беременности жалоб не предъявляет, по УЗИ нормальная локализация плаценты, выше области внутреннего зева на 6 см по задней стенке матки, ближе к дну. Признаки врастания по УЗИ не описываются.

Было проведено обследование по предлагаемому способу:

Уровень ММР-2 - 431,4 пг/мл, ММР-9 - 198,3 нг/мл, TIMP-1 - 2,8 нг/мл, TIMP-2 - 5,9 нг/мл, кисспептин 202,1 пг/мл, MMP-9/TIMP-1 70,8

Заключение: в связи с тем, что уровень ММР-2 выше 380,8 пг/мл, уровень кисспептина выше 145,2 пг/мл, прогнозировано врастание плаценты. Пациентке проведено МРТ, подтвердившее патологию. Беременная переведена для родоразрешения в 37 недель в стационар 3 степени риска (перинатальный центр), где проведена операция кесарево сечение. Интраоперационно: по задней стенке матки, ближе к дну, на участке 5×6 см плацента не отделяется - врастание плаценты (placenta accreta). Проведена органосохраняющая операция: перевязка маточных сосудов с обеих сторон, участок врастания плаценты (после ее отделения) прошит отдельными компрессионными швами через всю толщу стенки матки. Кровопотеря 1100 мл. Пациентка с ребенком выписаны на 7 сутки в удовлетворительном состоянии.

Прогноз по предлагаемому способу подтвердился.

Пример 2. Пациентка Л. 29 лет, беременность вторая (первая 4 года назад, завершившаяся родами через естественные родовые пути в 36 недель гестации, ребенок здоров, послеродовый период осложнился эндометритом на 3 сутки, проводилась вакуум-аспирация, антибиотикотерапия). На момент обследования в женской консультации в 20 недель по УЗИ выявлено полное предлежание плаценты, плацента по передней стенке матки, переходит на заднюю стенку через внутренний зев, полностью его перекрывая. По УЗИ признаки врастания плаценты не описываются. Клинических проявлений, кровомазанья в триместре не отмечается.

Было проведено обследование предлагаемым способом:

Уровень ММР-2 - 512,6 пг/мл, ММР-9 - 322,1 нг/мл, TIMP-1 - 9,4 нг/мл, TIMP-2 - 4,8 нг/мл, кисспептин 168,1 пг/мл, MMP-9/TIMP-1 34,26

Заключение: в связи с тем, что уровень ММР-2 выше 380,8 пг/мл, ММР-9 выше 240,1 нг/мл, TIMP-1 выше 8,5 нг/мл, кисспептина выше 145,2 пг/мл, соотношение MMP-9/TIMP-1 ниже 49,9 заподозрено врастание плаценты. Пациентке проведено МРТ подтвердившее патологию. В связи с наличием предлежания плаценты, подозрением на ее врастание, пациентка госпитализирована в стационар 3 степени риска в 34 недели гестации для дальнейшего ведения, проведения планового абдоминального родоразрешения в 37 недель беременности, но в связи с начавшимся кровотечением в 36-37 недель пациентка была родоразрешена экстренно путем операции кесарево сечение. Интраоперационно отмечается участок врастания плаценты по передней стенке матки на протяжении 6×6 см, иссечен, выполнена перевязка маточных сосудов с двух сторон, перевязка внутренних подвздошный артерий, метропластика, реинфузия аутокрови аппаратом Cell-Saver. Матка сохранена. Кровопотеря 2200 мл. Пациентка на 7 сутки выписана с ребенком в удовлетворительном состоянии.

Прогноз по предлагаемому способу подтвердился.

Предлагаемым способом обследовано 102 женщины, количественные показатели представлены в таблице:

Предлагаемый способ прогнозирования врастания плаценты при беременности обладает высокой точностью - 81,4%, чувствительностью - 78,8% и специфичностью - 84,0%. У способа хорошая воспроизводимость, он прост в интерпретации результатов обследования. Способ дает возможность прогнозировать врастание плаценты у беременных женщин как с нормальной локализацией плаценты, так и с ее предлежанием в сроке 20-26 недель и позже, с точностью 81,4%.

Использование предлагаемого способа позволяет своевременно выбрать правильную тактику ведения женщин с риском развития данной акушерско-гинекологической патологии и избежать неблагоприятных исходов беременности.