ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ УРАТНОЙ НЕФРОПАТИИ

Изобретение относится к медицине, а именно фармакологии, урологии и может быть использовано для профилактики и лечения уратной нефропатии.

Частота возникновения уратной нефропатии (УН) в современной популяции достигает от 7 до 15% от заболеваемости мочекаменной болезни (МКБ) которая относится к числу наиболее распространенных заболеваний мочевыделительной системы. Данное патологическое состояние характеризуется накоплением уратных конкрементов в почечных тканях, а также активацией процессов свободнорадикального окисления и проявлением воспалительной реакции, что в конечном итоге приводит к выраженным дисфункциональным расстройством почечных структур. Известно, что этиология и патогенез УН существенным образом связаны с метаболическим синдромом, который сегодня выходит на ведущие позиции по распространенности среди внутренних болезней человека.

На данный момент отсутствует средство для лечения уратной нефропатии, сочетающее в себе антилитогенное действие и антиоксидантный эффект.

Наиболее близким прототипом является фармакологическое средство для лечения мочекаменной болезни, имеющее в своем составе трипептид Leu-Ile-Lys (патент РФ 2679120). Его вводят перорально в дозе 11,5 мг/кг. Средство обладает высоким антилитогенным действием на фоне оксалатного нефролитиаза.

Недостатком данного средства является отсутствие сведений об эффективности его действия на течение уратной нефропатии.

Авторы предлагают фармакологическое средство для лечения уратной нефропатии, обладающее выраженной антилитогенной активностью, а также оказывающий антиоксидантное действие.

^{Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение ассортимента фармакологических средств для лечения уратной нефропатии.}

Технический результат достигается тем, что для лечения уратной нефропатии используется трипептид Leu-Ile-Lys (лейцин-изолейцин-лизин) в дозе 11,5 мг/кг.

Фармакологические свойства средства для лечения уратной нефропатии найдены экспериментальным путем.

Эксперимент проведен на самцах крыс линии Wistar, имеющих массу в пределах 200 - 320 г. Экспериментальные животные содержались в индивидуальных метаболических клетках, которые имели техническую возможность сбора мочи подопытных крыс. Животные находились на стандартной лабораторной диете с постоянным доступом к воде и питательным веществам. Экспериментальные крысы были разделены на опытную группу (n=15), а также контрольную группу (n=8), в которых осуществлялось моделирование экспериментальной уратной нефропатии в соответствии с общепринятой моделью (Перфильев В.Ю., Зверев Я.Ф., Жариков А.Ю., Условия развития уратного нефролитиаза и подходы к его моделированию. Нефрология. 2017; 21 (4): 48-54). Для этого животным обеих групп ежедневно на протяжении трех недель внутрижелудочно через зонд вводили смесь с содержанием оксониевой кислоты в дозе 500 мг/кг и мочевой кислоты в дозе 1000 мг/кг в течение 3 недель.

С 11-го дня и до конца эксперимента крысы опытной группы ежедневно получали трипептид Leu-Ile-Lys внутрижелудочно через зонд в дозе 11,5 мг/кг. Для определения исходного уровня активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и γ-глутамилтрансферазы (ГТТ), за день до начала эксперимента по моделированию уратной нефропатии производили сбор суточной мочи каждой экспериментальной крысы с последующим определением активности ферментов на автоматическом биохимическом анализаторе DIRUI CS-T240 с использованием оптимизированных кинетических методов. Для определения активности ЛДГ проводили реакцию восстановления пирувата до лактата. Активность ГГТ определялась по интенсивности окраски 5-амино-2-нитробензоата, являющегося продуктом, образующимся в процессе переноса L-гамма-глутамил-3-карбокси-нитроанилида на глицилглицин.

В ходе проведения эксперимента, на, 7-й, 11-й, 14-й, 17-й и 21-й дни также производился сбор суточной мочи, с последующим определением активности ЛДГ и ГГТ по методикам, аналогичным тем, которые применялись для определения исходного уровня ферментов.

По истечении 3 недель эксперимента лабораторных животных подвергали эвтаназии при помощи введения в эфирный наркоз, после чего извлекали почки для оценки показателей активности процессов свободнорадикального окисления (СРО), а также для проведения морфологических исследований.

Оценка активности свободнорадикального окисления проводилось в соответствии с общепринятыми методиками (Брюханов В.М., Зверев Я.Ф., Лампатов В.В. и др. Методы доклинического (экспериментального) исследования влияния лекарственных средств на функцию почек. Новосибирск; Гео. 2013; 84 с.). Определялись концентрация тиобарбитуратреактивных продуктов (ТБРП), общая прооксидантная активность (ОПА), общая антиоксидлантная активность, и активность антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГПО) и каталазы (КАТ). Концентрация ТБРП определялась методом фотоэлектроколориметрии по интенсивности окраски раствора после протекания химической реакции ТБРП с молекулой 2-тиобарбитуровой кислоты. Активность КАТ измерялась по степени подавления окисления перекисью водорода динатриевой соли молибденовой кислоты. Активность СОД оценивалась путем определения концентрации нитроформазана, являющегося основным продуктом взаимодействия супероксидных радикалов с ионом нитротетразолия. Активность ГПО измерялась с помощью проведения химического взаимодействия восстановленного глутатиона с дитионитробензойной кислотой. Общую прооксидантную активность оценивали в соответствии с измеренным м уровнем окраски флюоресцирующего комплекса, полученного путем взаимодействия 2-тиобарбитуровой кислоты с продуктами реакции ТВИН-80 с пероксидными радикалами. Общую антиоксидантную активность измеряли с помощью оценки степени ингибирования Fe2+/аскорбат-зависимого окисления твина-80 исследуемым образцом гомогената почечной ткани экспериментальных животных.

Для проведения морфологических исследований производили фиксацию почек в 10%-ном растворе формалина, осуществляли проводку исследуемого материала с помощью аппарата TISSUE-TEK VIPTM6 (Sakkura, Япония), получали срезы толщиной 5-7 мкм через почечный сосочек на аппарате Accu-Cut SRM (Sakkura, Япония). Полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином и рассматривали под увеличением х400 на микроскопе марки Nikon Eclipse Е200 (Китай). Количество уратных депозитов в поле зрения и их размер определяли с использованием пакетов программ ImageJ 1.43 и AxioVision 3.1.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием статистических методов, принятых в экспериментальной фармакологии, с использованием программного пакета Statistica 12.0. для Windows (StatSoft, Inc.). Результаты биохимических исследований представлены как медиана (Me) и интраквартильный размах (Q1;Q3), морфологических исследований - в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (M±SEM). Значимость различий оценивали с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни (для независимых выборок) и Вилкоксона (для зависимых выборок). Достоверными считали различия при р<0.05.

Результаты исследований представлены в фигурах 1-3.

Фигура 1 - Динамика активности маркерных ферментов повреждения почечных тканей в почках экспериментальных крыс. Вариабельность данных представлена медианой с указанием 25 и 75 перцентилей; ЛДГ -лактатдегидрогеназа; ГГТ - γ-глутамилтрансфераза. р_и/у - уровень статистической значимости изменения показателя внутри группы относительно исходного уровня;

Фигура 2 - Показатели активности процесса СРО в гомогенате почек экспериментальных крыс.Вариабельность данных представлена медианой с указанием 25 и 75 перцентилей. ТБРП - тиобарбитуратреактивные продукты;

ОПА - общая прооксидантная активность; ОАА - общая антиоксидантная активность, СОД - супероксиддистумтаза, КАТ - каталаза; ГПО - глутатионпероксидаза. р_к - уровень статистической значимости различий в опытной группе относительно контрольной группы

Фигура 3 - Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 400.

а - уратные депозиты в кистозно-измененном канальце почки у контрольной крысы, б - уратные депозиты в канальце почки при применении трипептида Leu-Ile-Lys.

По результатам биохимических исследований было установлено, что активность ЛДГ в контрольной группе последовательно возрастала в течение всего эксперимента. Как следствие, на 21-й день она превосходила свой исходный уровень в 7,5 раза (Фиг. 1). При этом в опытной группе активность ЛДГ в первые 17 дней эксперимента аналогичным образом возрастала, однако к концу 3-й недели этот рост прекратился, а величина описываемого показателя уступала контролю в 1,7 раза. Активность ГГТ на этом фоне на протяжении эксперимента в обеих группах последовательно статистически значимо снижалась: в 3 раза в контрольной группе, в 2 раза - в опытной группе.

В ходе анализа активности процессов свободнорадикального окисления было зафиксировано, что в опытной группе оксидативный стресс в почках крыс под влиянием Leu-Ile-Lys существенно ослаблялся (Фиг. 2). Так, концентрация ТБРП после 3-х недель эксперимента была статистически значимо в 1,2 раза меньше, чем в контрольной группе. На этом фоне общая прооксидантная активность не имела статистически значимых межгрупповых различий.

При этом, ОАА в подопытной группе была статистически значимо выше аналогичного показателя в контрольной группе в 1,3 раза. Активность СОД в подопытной группе превышала аналогичный показатель контрольной группы в 1,5 раза (р=0,016). Активность КАТ в подопытной группе превосходила показатели животных контрольной группы в 1,2 раза (р=0,005). Статистически значимых различий в активности ГПО не было выявлено.

По результатам морфологических исследований, в почках крыс контрольной группы были выявлены уратные конкременты у всех 8 особей. Микролиты разной формы и синеватого цвета отмечали в канальцах коркового слоя, а также в почечном сосочке (Фиг. 3а). Их среднее количество составило 3.2±0.4 в поле зрения при среднем размере - 432.8±41.8 мкм². Кроме того, почечные канальцы были кистозно расширены, имели уплощенный эпителий с ядрами в состоянии пикноза. В строме отмечали явления выраженной воспалительной реакции.

На микропрепаратах почек экспериментальных животных опытной группы, получавших трипептид Leu-Ile-Lys на 21 день эксперимента уратные камни были выявлены во всех 15 (100%) случаях. Они были различной формы, синеватого цвета и располагались в корковом слое и почечном сосочке, в кистозно расширенных почечных канальцах, среди клеточного детрита и воспалительного инфильтрата, который состоял преимущественно из лейкоцитов (Фиг. 3б). Явления воспаления в строме, а также изменения канальцевого эпителия было умеренно выраженными, а клеточные ядра имели различные размеры, в том числе были гипертрофированы. Количество депозитов в канальцах по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы уменьшилось в 2 раза и составило в среднем 1,6±0,2 в поле зрения при увеличении х400 (р=0,001). Средняя площадь депозитов была незначительно меньше, чем в контроле, и составила 371,5±112,3 мкм².

Таким образом, в результате проведенных экспериментов продемонстрирована возможность эффективной фармакологической коррекции уратной нефропатии трипептидом Leu-Ile-Lys.